補腎益智方對SAMP8小鼠海馬和內嗅皮層神經元修復及突觸可塑性的影響

張彩霞 周泰冰 陳丹丹 接琳琳 盧強 吳君

(山東中醫藥高等?？茖W校,山東 煙臺 264199)

阿爾茨海默病(AD)是一種隨著年齡增長認知功能逐漸下降最終導致死亡的神經退行性疾病,好發于65歲以上的老年人〔1〕,目前尚無有效的治療方法。中醫認為AD的認知功能減退主要與老年衰憊、腎精失充有關。補腎類中藥復方具有多靶點、多途徑的優勢,在延緩腦組織的衰老、改善學習記憶障礙等能力方面有著獨特的優勢〔2〕。研究表明,連續補腎益智方灌胃的AD模型鼠,腦內興奮性氨基酸明顯降低,而抑制性氨基酸γ氨基丁酸和甘氨酸的含量升高,有預防及緩解記憶力衰退的功效〔3〕。水迷宮實驗表明,補腎益智方能顯著提高AD模型鼠學習記憶能力〔4〕。生長相關蛋白(GAP)-43和神經生長因子(NGF)均是與軸突生長、突觸可塑性和神經修復密切相關的基因〔5,6〕。本研究擬通過觀察補腎益智方對7月齡 SAMP8 小鼠海馬和內嗅皮層中GAP-43和NGF表達的影響,研究中藥復方對神經元的作用機制,以期為中醫中藥防治AD的臨床應用提供更多實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 7月齡快速老化模型SAMP8雄性小鼠90只,7月齡雄性SAMR1小鼠30只,均購自北京華阜康生物科技有限公司,動物許可證號 SCXK(京)2019-0008。SPF級,動物實驗室內通風良好,自然光照,室溫(22±2)℃。適應性喂養后進行灌胃試驗。

1.2實驗藥物 補腎益智方:熟地黃15 g、枸杞子20 g、山茱萸12 g、鹽益智仁6 g、丹參15 g、當歸10 g、郁金10 g、石菖蒲10 g、川芎10 g、遠志6 g等,以上藥物經山東天江藥業制成免煎顆粒。補腎益智方劑量設定根據成人臨床給藥劑量1.34 g/(kg·d)的2倍、4倍確立〔7〕,低劑量〔2.68 g/(kg·d)〕、高劑量補腎益智方藥液終濃度〔5.36 g/(kg·d)〕連續灌胃6 w。藥液配制完成后放置于4 ℃冰箱冷藏備用,用前37 ℃溫水浴后搖勻。

1.3實驗試劑 兔抗GAP-43多克隆抗體(ab75810)和兔抗NGF多克隆抗體(ab52918)均購自Abcam公司;熒光素-5-異硫氰酸鹽(FITC)標記羊抗兔IgG(111-095-003)購自美國Jackson Immuno Research;TRIzol(15596-026)購自美國Invitrogen公司;cDNA第一鏈合成試劑盒(RR036B)購自日本TaKaRa,;One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT-聚合酶鏈反應(PCR)Kit Ⅱ(SYBR Green)購自日本TaKaRa,生產批號:RR086B。

1.4給藥與取材 將SAMP8小鼠隨機分成3組:模型組、補腎益智方低劑量組和補腎益智方高劑量組。對照組為同月齡SAMR1小鼠。補腎益智方低劑量組和高劑量分別給予小鼠終濃度為2.68 g/(kg·d)和5.36 g/(kg·d)補腎益智方藥液連續灌胃42 d。模型組和對照組均給予等量生理鹽水灌服,烏拉坦麻醉。隨機選取部分小鼠經心臟灌注4%多聚甲醛固定,取小鼠大腦,制作石蠟切片,進行免疫熒光染色。一部分剝離小鼠海馬和內嗅皮層,TRIzol勻漿器冰上充分勻漿,提取總RNA,一部分提取小鼠海馬和內嗅皮層總蛋白。

1.5免疫熒光染色 切片脫蠟,封閉內源性過氧化物酶;37 ℃封閉非特異性抗原。甩去多余血清,滴加一抗兔抗GAP-43(1∶150)或兔抗NGF(1∶200),將切片置于濕盒,孵育過夜(4 ℃)。滴加熒光二抗(1∶400),37 ℃,避光孵育50 min;4′,6′-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染,將切片置于暗盒,孵育5 min。熒光防淬滅封片劑封片。激光共聚焦顯微鏡觀察、攝片。

1.6RT-PCR 分別提取小鼠海馬和內嗅皮層總RNA,進行RT-PCR實驗,實驗步驟參照Zhou等〔8〕。擴增條件:預變性95 ℃,5 min;變性95 ℃,15 s,58 ℃退火20 s,延伸72 ℃,40 s,進行40循環;95 ℃,8 min。引物序列:GAP-43上游引物:5′-GCTGTGCTGTATGAGAAGAACC-3′,下游:5′-AATTTTGGT-CGCAGCCTTATGA-3′;NGF上游引物:5′-GTCTGG-GCCCAATAAAGGTTTT-3′,下游:5′-GAAGTTTAGT-CCAGTGGGCTTC-3′;磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)上游引物:5′-GAAGGTGGTGAAGCAGGCATCT-3′,下游:5′-CGGCATCGAAGGTGGAAGAGTG-3′。

1.7Western印跡檢測 分別提取小鼠海馬和內嗅皮層組織總蛋白。十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),轉膜,5%脫脂奶粉溶液室溫封閉60 min;一抗(兔抗GAP-431∶15 000或兔抗NGF1∶12 000),4 ℃過夜;羊抗兔二抗(1∶5 000)37 ℃搖床孵育55 min;電化學發光(ECL)反應3 min,暗室膠片曝光。

1.8統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。采用ImageJ圖像分析光密度值。

2 結 果

2.1GAP-43定位于海馬和內嗅皮層區且補腎益智方灌胃后表達升高 各組大腦切片的海馬和內嗅皮層區中均可檢測到GAP-43陽性細胞。與對照組比較,模型組海馬區和內嗅皮層中GAP-43 平均光密度值、mRNA及蛋白表達明顯降低(P<0.01,P<0.05)。與模型組比較,補腎益智方低劑量組與高劑量組海馬區和內嗅皮層中GAP-43 平均光密度值、mRNA及蛋白表達均顯著增強(P<0.01,P<0.05)。與補腎益智方低劑量組比較,補腎益智方高劑量組海馬區和內嗅皮層中GAP-43平均光密度值、mRNA及蛋白表達雖有升高,但差異無統計學意義(均P>0.05)。見圖1、圖2、表1、圖3、圖4。

表1 各組海馬區及內嗅皮層GAP-43免疫陽性細胞平均光密度值、mRNA和蛋白表達比較

圖1 各組海馬區GAP-43表達(免疫熒光,×400)

圖2 各組內嗅皮層GAP-43表達(免疫熒光,×400)

1～4:對照組、模型組、補腎益智方低劑量組、補腎益智方高劑量組;圖4同

圖4 Western印跡檢驗各組內嗅皮層GAP-43和NGF蛋白表達

圖5 各組海馬區NGF表達(免疫熒光,×400)

2.2NGF定位于海馬區且補腎益智方灌胃后表達升高 補腎益智方灌胃42 d后,各組海馬區和內嗅皮層切片中均可檢測到NGF陽性細胞。與對照組比較,模型組海馬區和內嗅皮層中NGF平均光密度值、mRNA及蛋白表達均明顯降低(P<0.01,P<0.05)。與模型組比較,補腎益智方低劑量組與高劑量組海馬區和內嗅皮層中NGF平均光密度值、mRNA及蛋白表達均顯著增強(P<0.01,P<0.05)。與補腎益智方低劑量組相比,補腎益智方高劑量組海馬區和內嗅皮層中NGF平均光密度值、mRNA及蛋白表達雖有升高,但差異無統計學意義(均P>0.05)。見圖3～圖6、表2。

表2 各組海馬區及內嗅皮層NGF免疫陽性細胞平均光密度值、mRNA和蛋白表達比較

圖6 各組內嗅皮層NGF表達(免疫熒光,×400)

3 討 論

AD可影響人體多個系統,隨著病情加重,會導致患者失去自主生活能力并帶來嚴重的并發癥,最終死亡。研究發現,內嗅皮層是AD患者大腦中最早最明顯的受損區,AD早期內嗅皮層中會出現神經元凋亡、神經纖維纏結、淀粉樣斑塊和突觸損傷丟失等現象,隨后逐漸擴展至海馬等周圍結構〔9〕。內嗅皮層連接海馬與新皮層,被稱為皮層記憶的樞紐,內嗅皮層神經元在記憶的恢復中起著重要作用〔10〕。神經元的記憶功能活動需要依靠突觸連接來實現,因此突觸的損傷或缺失是影響認知功能神經生物學的重要因素〔11〕。

GAP-43是一種在大腦海馬中表達豐富的磷蛋白,可影響神經發育和突觸重塑。在正常海馬和記憶相關區域,GAP-43高水平表達,而GAP-43缺失會導致小鼠空間記憶功能障礙〔12〕。當神經系統受損時,損傷部位周圍的神經元可通過反應性軸突和側枝再生進行補償。受損區域中的GAP-43表達水平隨損傷修復時間的增加而增加,然后逐漸降低。因此,GAP-43被認為是研究神經可塑性、修復和再生的首選探針〔13〕。本實驗兩組海馬區和內嗅皮層中均檢測到GAP-43陽性細胞的存在。

歷代名老中醫常以“腎-髓-腦”為軸線,以補腎為先的理念論治AD臨床證明可取得滿意療效。補腎益智方中枸杞子、熟地黃和山茱萸可補腎填精,郁金、石菖蒲和遠志可活血化痰開竅。因此補腎益智方具有補腎益氣、活血健腦和開竅醒神的功效,與AD發病機制相契合〔14〕。本實驗以補腎益智方飲片為原料,通過現代化制藥技術制成免煎顆粒。免煎顆粒不但方便服用而且可以明確地控制質量,能夠很好保留中藥飲片的藥性和藥效,在一定程度可以作為中藥水煎劑的替代〔15〕。臨床實踐證明,補腎益智方在老年遺忘型輕度認知功能障礙方面有療效〔16〕。前期水迷宮實驗發現補腎益智方能有效改善6月齡SAMP8小鼠的學習記憶能力〔17〕。本研究結果提示,補腎益智方免煎顆?？缮险{GAP-43的表達。GAP-43在大腦突觸功能的維持和神經處理中起關鍵作用,出生1 w時在神經元內表達最高,成年之后除了海馬和新皮質區表達較高,腦部其他區域表達較低〔18〕。本研究結果說明,AD的記憶喪失可能與突觸的修復或神經功能障礙有關。適度GAP-43蛋白表達,有利于記憶增強,而過度的GAP-43表達反而有可能損傷記憶〔19〕。經過補腎益智方灌胃治療42 d后,GAP-43蛋白在海馬的表達明顯高于模型組,這提示上調的GAP-43可能有利于海馬區突觸修復和神經元再生,進而有改善小鼠學習記憶的作用。

NGF廣泛存在于成年人中樞神經系統和周圍神經系統,是一種十分重要的神經營養因子,有促進神經元發育、分化、成熟、再生和突觸可塑性的作用〔20〕。當皮質和海馬區NGF的供應量減少時,基底前腦膽堿能神經元形態和功能出現障礙,導致AD認知功能下降〔21〕。本研究結果提示,補腎益智方可上調SAMP8小鼠海馬區和內嗅皮層中NGF,可能與神經元或突觸的修復有關。在缺血腦卒中動物模型中,NGF過表達可通過上調GAP-43,使GAP-43穩定性提高,誘導神經元形態和功能恢復,進而緩解動物的認知障礙〔22〕。由此推測,補腎益智方也可能通過上調NGF,提高GAP-43神經元和突觸的修復作用,進而改善SAMP8小鼠的認知障礙。本研究發現,不同劑量補腎益智方在GAP-43、NGF蛋白和mRNA表達方面尚未發現明顯變化,分析原因可能與所選劑量或實驗動物月齡等因素有關。

綜上所述,補腎益智方免煎顆?？赏ㄟ^改善SAMP8小鼠海馬區和內嗅皮層中GAP-43、NGF蛋白和mRNA表達,減輕其空間學習記憶功能損傷,這可能與其調控神經元修復和軸突可塑性密切相關,具體機制有待深入研究。