基于Fas/FasL信號通路探究調控miR-214-3p對帕金森病大鼠的干預效果

杜姝 傅增輝 姜巖 劉晶 林再紅 陳團團

(齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院神經內四科,黑龍江 齊齊哈爾 161000)

帕金森病(PD)屬于慢性神經系統退行性疾病。多發于中老年,主要臨床特征包括肌強直、靜止性震顫、姿勢反射障礙和運動遲緩〔1,2〕。miRNA在多種細胞活動中有著重要地位,可以指導形成miRNA-mRNA誘導沉默復合體。近幾年,在PD中miRNA的作用引起重視,miR-214與各種神經系統疾病密切相關〔3,4〕。目前的研究發現,miR-214作為一種功能性的miRNA,可以抑制海馬神經元的自噬和凋亡,故而miR-214-3p的表達可能與PD具有一定的關系〔5〕。研究顯示,Fas配體(FasL)屬于腫瘤壞死因子(TNF)家族一種細胞表面分子,與其受體Fas結合,從而誘導Fas攜帶細胞凋亡〔6〕。目前miR-214-3p在PD中的相關研究較少,本研究采用miR-214-3p對PD模型大鼠進行干預,探究其臨床指標及與Fas/FasL通路的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取36只清潔級SD雄性大鼠,8～12周齡;平均(9.50±1.90)周齡;體質量180～230 g,平均(194.75±23.75)g,購自河南省動物實驗中心,許可證號:SYXK(豫)2017-0002,大鼠均進行常規飼養,自由飲食、飲水,晝夜交替12 h,濕度在50%左右,統一適應性喂養1 w。

1.2PD模型大鼠制備〔7〕采取頸背部皮下注射魚藤酮制備PD大鼠模型。28只大鼠稱體質量后逐日給予魚藤酮2 mg/kg頸背部皮下注射,將大鼠行為變化分為6個等級計分。1分為大鼠拒逮捕能力減弱,外表顏色變黃變臟,毛發垂直,弓背,主動活動能力減少;2分為在1分大鼠基礎上出現主動活動能力明顯下降,動作遲緩、震顫、步態不穩;4分為基于2分大鼠行為,步態不穩定、不能直行、行走時向一側旋轉;6分為單側斜倚,單側肢體癱瘓,進食困難;8分為肢體完全癱瘓,體質量明顯減輕,無法進食,四肢拘攣;10分為瀕死狀態、死亡。造模后次日進行行為學評分,評分的環境與飼養環境一致,放置于具有干凈墊料的大籠子中,待大鼠適應新環境后,記錄大鼠行為學特征并評分。行為學評分2～8分的大鼠為造模成功,共24只大鼠建模成功。

1.3分組及干預 將建模成功的24只大鼠隨機分為上調miR-214-3p組、下調miR-214-3p組、模型組各8只,未行建模的8只正常大鼠為正常組,下調miR-214-3p組腹腔注射antago miR-214-3p 30 mg/kg進行干預。上調miR-214-3p組腹腔注射miR-214-3p 30 mg/kg,正常組、模型組腹腔注射等量生理鹽水進行干預。

1.4步幅距離測量 正式步幅試驗前,大鼠先行步幅訓練3次。裝置:木盒子長22 cm,寬18 cm,高12 cm;跑道長44 cm,寬5 cm,高10 cm,將跑道穿過木盒。大鼠前爪涂上黑墨水,跑道上放上白紙,寬5 cm,長44 cm,在放有白紙的跑道上行走,穿過盒子,記錄大鼠在白紙上遺留前爪印記前后間的距離,選取3個最長距離,記錄。重復測量3次。

1.5懸掛時間測定 正式懸掛開始前,大鼠先行懸掛訓練3次。懸掛于直徑約3 mm水平鐵線上,正常大鼠將前爪懸掛于該鐵絲上,肌力越大且越持久懸掛時間越長,放置軟墊防止大鼠摔傷。大鼠不能翻坐于鐵線,通過前爪懸掛于鐵線上,記錄抓鐵絲線時間,重復檢測3次,每次檢測間隔2 min以防大鼠疲憊。

1.6各組前額葉皮層蘇木素-伊紅(HE)染色 大鼠麻醉后,斷頭取腦,腦組織放置冰盤,取前額葉皮層組織,予0.9%氯化鈉溶液洗凈組織中血液,吸干,于EP管中,-80 ℃保存備用。組織塊固定在切片機標本固定架上,暴露組織最大切面,4 μm的厚度切片。恒溫水浴鍋內展平裱片,烘片2～6 h,依次浸入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫蠟15 min,完成后依次浸入100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%Ⅰ、95%Ⅱ、90%、80%、70%乙醇溶液中各5 min,后置于蒸餾水中。置于蘇木素液中染色20 min,洗去蘇木素液,將切片浸入1%鹽酸乙醇溶液中,再水洗后流水返藍30 min。伊紅液中染色30 s水洗,以與入水相反順序乙醇溶液脫水,浸入二甲苯中3 min,中性樹膠封片,陰涼處晾干。置于光學顯微鏡下觀察各組前額葉皮層部位組織切片。

1.7miR-214-3p表達檢測 腦組織中miR-214-3p的表達采用熒光定量-聚合酶鏈反應(PCR)檢測,取大鼠腦組織,Trizol試劑提取總RNA,逆轉錄合成cDNA。加入PCR引物,進行qPCR擴增反應,反應條件:94 ℃預變性30 s;94 ℃變性10 s,64 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30個循環。U6為內參照,應用凝膠成像系統(Bio-Rad)攝影,Quantity One軟件進行掃描分析,計算采用2-ΔΔCt法。引物序列為:miR-214-3p上游5′-CAGCAGGCACAGACAGGC-3′,下游5′-CTATGTCCTCACCGZZCGCAACC-3′;U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.8大鼠炎癥因子檢測 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測腦組織中白細胞介素(IL)-1、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α的水平,取大鼠腦組織進行組織勻漿,4 ℃離心后收集上清液,應用IL-1、TNF-α和IL-6 ELISA檢測試劑盒測定上清液中IL-1β、TNF-α和IL-6的水平,按照試劑盒說明書進行具體步驟操作。

1.9Western印跡檢測Fas/FasL信號通路相關蛋白表達 取出腦組織,對每塊進行稱重后按12.5 μl/mg加入組織裂解液,充分研磨,靜置30 min,4 ℃ 12 000 r/min離心15 min,抽取上清液,加熱10 min。-80 ℃冰箱保存,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉膜。5%脫脂牛奶封閉1 h,加入封閉液稀釋的Fas(1∶1 000)、FasL(1∶1 000)、甲狀腺激素(TH,1∶1 000)抗體,4 ℃孵育過夜。PBST洗滌3次,加入標記的二抗,室溫孵育1 h,PBST洗滌3次,電化學發光(ECL)顯影。

1.10統計學處理 采用SPSS26.0軟件進行齊性方差分析、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1各組miR-214-3p表達比較 與正常組相比,上調miR-214-3p組、下調miR-214-3p組、模型組miR-214-3p表達明顯降低(P<0.05);與模型組相比,上調miR-214-3p組miR-214-3p表達明顯升高,下調miR-214-3p組miR-214-3p表達明顯降低(P<0.05);與下調miR-214-3p組相比,上調miR-214-3p組miR-214-3p表達明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組miR-214-3p表達、步幅距離、懸掛時間、腦組織中炎癥因子比較

2.2miR-214-3p對各組步幅距離、懸掛時間的影響 與正常組相比,上調miR-214-3p組、下調miR-214-3p組、模型組步幅距離明顯縮短,懸掛時間明顯減少(P<0.05);與模型組相比,上調miR-214-3p組步幅距離明顯變長,懸掛時間明顯增加,下調miR-214-3p組步幅距離明顯縮短,懸掛時間明顯減少(P<0.05);與下調miR-214-3p組相比,上調miR-214-3p組步幅距離明顯變長,懸掛時間明顯增加(P<0.05)。見表1。

2.3miR-214-3p對各組腦組織炎癥因子的影響 與正常組相比,上調miR-214-3p組、下調miR-214-3p組、模型組TNF-α、IL-1、IL-6表達明顯升高(P<0.05);與模型組相比,上調miR-214-3p組TNF-α、IL-1、IL-6表達明顯降低,下調miR-214-3p組TNF-α、IL-1、IL-6表達明顯升高(P<0.05);與下調miR-214-3p組相比,上調miR-214-3p組TNF-α、IL-1、IL-6表達明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.4各組前額葉皮層HE染色 正常組前額葉皮層區域神經元分布緊密,數量正常,排列整齊,形態較為規整,胞體輪廓清晰,大而圓,空泡變性較少;模型組前額葉皮層區域神經元細胞則較正常組數量較少、排列散裂、胞體輪廓較模糊,胞核固縮與空泡變性較多;下調miR-214-3p組前額葉皮層區域神經元細胞數量減少、排列疏松、胞體模糊,胞核固縮與空泡變性增多,上調miR-214-3p組前額葉皮層部位神經元細胞數有所增加,細胞整體形態與排列情況改善顯著。見圖1。

圖1 各組前額葉皮層變化(HE染色,×400)

2.5miR-214-3p對PD模型大鼠Fas/FasL信號通路相關蛋白的影響 與正常組相比,上調miR-214-3p組、下調miR-214-3p組、模型組Fas、FasL表達較高,TH表達較低,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,上調miR-214-3p組Fas、FasL表達較低,TH表達較高,下調miR-214-3p組Fas、FasL表達較高,TH表達較低,差異有統計學意義(P<0.05);與下調miR-214-3p組相比,上調miR-214-3p組Fas、FasL表達較低,TH表達較高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖2。

1～4:下調miR-214-3p組、模型組、上調miR-214-3p組、正常組

表2 miR-214-3p對PD模型大鼠Fas/FasL通路蛋白的影響

3 討 論

目前,尚未明了PD的致病機制,成功的動物模型制備不僅能夠為研究提供良好基礎,且可以明確疾病的發病機制〔8～10〕。

miRNA在神經系統中表達豐富,具有明顯的組織和細胞特異性,多個miRNA均與PD的發生相關,可能參與并調節PD的發病機制。據報道,miRNA調節的相關系統炎癥反應機制也成為PD發病機制研究重點,膠質細胞激活及炎性過程均能對PD的發病和進展起到促進作用〔11～12〕。miR-214-3p在多種腫瘤發生發展中具有重要地位,范文秀等〔13〕研究顯示,miR-214-3p的表達可能與卵巢癌的發生、發展有關,故miR-214-3p的表達應該引起相應的重視,以促進早期干預,為生物治療提供新靶點,阻止病情的發展。步幅試驗是評價PD動物模型四肢運動障礙程度的方法,可檢測實驗動物運動能力,懸掛試驗評價PD模型動物在姿勢平衡障礙的程度,因此本研究對PD模型大鼠采用步幅試驗與懸掛試驗的進行評價,以側面反映PD模型大鼠腦部多巴胺能神經元細胞丟失程度〔14〕。本文研究顯示,上調miR-214-3p表達,可有效改善PD模型大鼠步幅距離、懸掛時間,側面反映miR-214-3p上調可有效改善神經及運動功能。

在PD患者腦內過度的激活引起的神經元丟失及TNF-α等炎癥因子的增加。在PD動物模型的中同樣有研究發現,小膠質細胞分泌TNF-α引起后續的炎癥反應,而抑制小膠質細胞的激活并減少TNF-α的分泌,可以進一步防止神經元的損失〔15〕。研究表明,在雄性大鼠注射脂多糖,可以產生IL-1,IL-6等激活的小膠質細胞,介質的過度釋放會導致PD。抑制促炎分子可阻止PD的進展〔16〕。說明在PD的病情發生發展中,炎癥因子引起的神經炎癥反應發揮著決定性的作用。本研究顯示,上調miR-214-3p表達可顯著改善PD大鼠TNF-α、IL-6、IL-1表達,通過抑制促炎性細胞因子與程序性黑質的神經元死亡的關系,降低細胞毒性作用,促進神經元恢復。

Fas是屬于TNF受體超家族成員的一種跨膜蛋白,它與FasL結合誘導Fas自身的三聚化,然后在細胞膜上形成凋亡誘導復合物。同時,Fas-FasL系統可自行執行Fas介導的凋亡,從而下調免疫應答〔17,18〕。研究發現,Fas/FasL配體相互作用,以自主的方式誘導炎癥細胞死亡。Fas通路不僅是重要的凋亡通路,而且與腫瘤發生發展密切相關〔19〕。本文研究顯示,miR-214-3p可靶向調控凋亡通路,改善相關蛋白表達,引起細胞骨架重塑和突觸形成,誘導細胞分泌金屬基質酶,凋亡敏感性增強,有利于機體清除病毒感染的細胞〔20〕,提示上調miR-214-3p改善PD的作用機制可能與Fas/FasL信號通路有關。

綜上,miR-214-3p上調對PD大鼠神經功能可有效改善,降低炎癥因子,其作用機制可能與Fas/FasL信號通路有關。