腎氣丸對腎間質纖維化大鼠腎組織TGF-β1/Smad3信號通路及AngⅡ表達的影響

張忠陽 凌家艷 周盾

(武漢市第一醫院中醫綜合科,湖北 武漢 430022)

腎間質纖維化是多種腎臟受累疾病發展至腎臟衰竭的關鍵事件,該病主要以腎組織微血管纖維化、腎小管間質纖維化及腎小球硬化為主要病理改變。如果不能及時有效的控制腎組織的纖維化進程,極易誘發臟器衰竭等惡性事件的發生。該病的分子機制尚未完全闡明,西醫藥技術只能緩解患者的臨床癥狀,不能準確而及時的修復腎臟損傷〔1〕。因此深入揭示疾病進展中的分子機制,積極尋找可靠的治療靶點,是臨床醫師急需解決的關鍵問題。腎間質纖維化在中醫上歸為“腎脈瘀阻”范疇,在我國傳統中醫藥發展的進程中,積累了一系列的中醫藥方法通過活血化瘀、溫補腎陽等手段改善患者的腎臟組織微循環,阻滯腎臟纖維化進程,改善患者的腎功能〔2〕。腎氣丸出自《金匱要略》,主要由肉桂、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉及山茱萸、附子、熟地黃等八味中藥組成?，F代藥理學的研究顯示〔3〕,腎氣丸具有調節內分泌,抑制炎性進展、增強免疫功能和保腎護肝等效用。趙峰等〔4〕研究顯示腎氣丸能明顯降低腎缺血再灌注損傷小鼠模型中腎組織細胞的凋亡率,改善實驗動物的腎功能,發揮腎臟保護作用。但是有關腎氣丸在腎間質纖維化中的作用的報道較少。轉化生長因子(TGF)-β1/果蠅抗生物皮膚生長因子蛋白家族(Smad)3信號是細胞內最重要的促纖維化轉導通路,能被腎組織中血管緊張素(Ang)Ⅱ等蛋白的表達激活〔5〕,Smad3磷酸化后將纖維化信號傳遞入核,進一步放大纖維化進程。本研究以腺嘌呤誘導構建大鼠腎間質纖維化模型,基于TGF-β/Smad3信號,探討腎氣丸對疾病進展中相關蛋白表達的影響,希望為藥物的臨床應用增加新的事實依據。

1 材料和方法

1.1試驗動物、主要試劑及儀器 SPF級,6～8周齡,SD大鼠,雄性,40只,體質量200～250 g,購自北京百奧賽圖基因生物技術有限公司,生產許可證號:SCXK(京)2020-0007,經醫院專門人員在溫度20～25 ℃,濕度55%～60%,12 h明暗交替的條件下進行適應性喂養后用于實驗。本研究的實驗操作和目的已經獲得醫院動物倫理委員會的批準。腎氣丸(北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠,國藥準字:Z11020147);過表達TGF-β1(pcDNA3.1-TGF-β1)及陰性對照(pcDNA3.1-TGF-β1-NC)購自北京安波特基因工程技術有限公司。腺嘌呤(北京中杉金橋生物技術有限公司),蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、Masson染色試劑盒、Western印跡試劑盒(南京建成生物科技有限公司),兔抗大鼠AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3抗體及磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國abcam公司。X71光學顯微鏡、JEM-300F2透射電鏡(日本Olympus公司),凝膠自動成像系統(美國Bio-rad公司),組織包埋機、攤片機、超薄切片機(德國Leica公司)。

1.2動物模型的復制及分組處理 腎間質纖維化大鼠模型的復制根據Contreras-Salinas等〔6〕介紹的方法:每日以250 mg/kg的腺嘌呤生理鹽水混懸液進行灌胃處理,每日1次,連續12 d后,更換為每兩日1次,連續12 d,造模周期共24 d。動物隨機分為正常組、模型組、實驗組和過表達組,正常組造模過程中以等劑量的生理鹽水進行灌胃處理。大鼠造模周期結束后,實驗組每日尾靜脈注射5×109pfu/ml的pcDNA3.1-TGF-β1-NC,并且以10 g/kg的腎氣丸進行灌胃處理;過表達組每日尾靜脈注射5×109pfu/ml pcDNA3.1-TGF-β1,并且以10 g/kg的腎氣丸進行灌胃處理;模型組和正常組每日尾靜脈注射5×109pfu/ml的pcDNA3.1-TGF-β1-NC并以生理鹽水進行灌胃處理。實驗過程中大鼠單籠飼養,自由飲食。

1.3各組腎功能檢測 在實驗過程中觀察記錄各組大鼠日常行為的變化,持續給藥14 d后,將大鼠誘導麻醉,腹主動脈采血5 ml,置于臺式高速微量離心機上10 min,留取上清液,酶標儀檢測各組大鼠血清中血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)的含量。

1.4各組腎臟組織病理學改變 采血完畢,處死實驗動物,無菌操作臺上取出大鼠的腎臟組織,醫用生理鹽水清洗,肉眼觀察后,迅速轉移至低溫冰箱中保存待測。取大鼠的腎臟組織,經固定,脫水,切片,依次HE染色、過典酸雪夫染色(PAS)、Masson染色,鏡檢。

1.5各組腎臟組織的超微結構改變 取大鼠的腎臟組織,戊二醛固定1 h,PBS清洗,鋨酸再固定,梯度濃度的無水乙醇梯度脫水,包埋,切片,醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色JEM-300F2透射鏡下觀察。

1.6各組腎臟組織中α-平滑肌肌動蛋白(SMA)和Ⅳ型膠原蛋白(ColⅣ)的表達 取大鼠的腎臟組織,經固定、脫水、透明、包埋、切片、脫蠟、抗原修復后,按照免疫組化試劑盒要求依次加入一抗(1∶300),二抗(1∶1 000),蘇木素復染,封片,鏡檢,以胞質中出現棕黃色顆粒為目標蛋白陽性表達,ImageJ軟件統計分析蛋白的陽性表達率。

1.7各組腎組織中AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3的表達水平 取各組大鼠的腎組織,在4 ℃裂解液中放置30 min,離心,并將上清液稀釋,常規方法提取樣本中的總蛋白,以50 μg樣品進行上樣,電泳后,轉模,封閉,加入一抗(1∶1 000),二抗(1∶5 000)稀釋后,室溫孵育后,顯色30 min,以GAPDH為參照,分析目標蛋白的灰度值。

1.8統計學分析 采用SPSS16.0軟件進行單因素分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組一般狀態觀察 實驗過程未出現大鼠死亡;正常組活動正常,皮毛光亮,進食與飲水正常,大鼠體質量增加明顯;模型組活動量較少,易怒,飲食與進水意愿不強烈,皮毛暗淡雜亂,體質量未見明顯增加;實驗組臨床癥狀明顯好轉,體質量增加量較模型組明顯升高;過表達組飲食量較實驗組明顯減少,體質量增加較實驗組明顯降低(P<0.05),見表1。

表1 各組實驗前后體質量

2.2各組腎功能的變化 與正常組相比,模型組、實驗組、過表達組血清Scr、BUN含量明顯升高(均P<0.05);與模型組相比,實驗組、過表達組血清Scr、BUN含量明顯降低(均P<0.05);與實驗組相比,過表達組血清Scr、BUN含量明顯升高(均P<0.05),見表2。

表2 各組腎參數、腎組織中α-SMA和ColⅣ陽性細胞的比例及AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3的相對表達比較

2.3各組腎臟組織中α-SMA和ColⅣ表達 免疫組化結果顯示,與正常組相比,模型組、實驗組、過表達組腎組織中α-SMA和ColⅣ陽性細胞比例明顯升高(P<0.05);與模型組相比,實驗組、過表達組腎組織中α-SMA和ColⅣ陽性細胞比例明顯降低(P<0.05);與實驗組相比,過表達組腎組織α-SMA和ColⅣ陽性細胞比例明顯升高(P<0.05),見表2、圖1。

圖1 各組腎組織中ColⅣ、α-SMA表達(免疫組化染色,×400)

2.4各組腎臟解剖學、組織損傷病理、超微結構變化 肉眼觀察結果顯示,正常組腎組織顏色較深,表面光滑,有彈性;模型組腎組織比正常組腎組織個體上偏大,顏色較淺,呈現淡白色,腎組織表面出現結晶沉淀和較多的腎結石,表面粗糙,失去彈性,質地偏硬;實驗組腎組織個體較模型組偏小,趨于正常,質軟,表面光滑;過表達組腎組織個體較實驗組腎組織偏大,質地偏硬,表面偶有白色斑點,見圖2。HE染色顯示,正常組腎組織腎小管及腎小球形態規則,未見炎性浸潤;模型組腎小管擴張明顯,腎小球嚴重硬化和炎性細胞大量浸潤;實驗組腎小管腫脹,明顯緩解,炎性浸潤緩和;過表達組組織損傷較實驗組重,較模型組輕。PAS染色顯示,正常組腎組織腎小管及腎小球結構正常,腎小管與間質及腎小球與間質形態未見明顯異常;模型組腎小球基底膜增厚明顯,系膜增生嚴重,系膜區明顯變寬;實驗組較模型組明顯改善,但過表達組較實驗組改善程度明顯減小。Masson染色顯示,正常組腎組織中未見膠原沉淀沉積,無腎間質纖維化現象;模型組腎小球和腎小管中均可見成片的纖維性藍色沉淀,間質纖維化嚴重;實驗組腎組織藍色沉積明顯減少,間質纖維化現象明顯改善;與實驗組相比,過表達組腎間質纖維化現象明顯加重。電鏡觀察結果顯示:正常組腎小管和腎小球結構完整,足突細胞排列整齊,未見異常;模型組腎小球系膜增厚明顯,細胞間質增寬,胞質中細胞器出現空泡樣變性,腎小管擴張,可見較為明顯的纖維化區域,足突細胞融合嚴重;實驗組腎組織的超微結構損傷明顯緩解,腎小球系膜增生趨于緩解,腎小管稍見腫脹;與實驗組相比,過表達組腎組織細胞超微結構損傷明顯加重,見圖3。

2.5各組腎組織中AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3表達水平 與正常組相比,模型組、實驗組、過表達組腎組織中AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3的表達明顯升高(均P<0.05);與模型組相比,實驗組、過表達組腎組織中AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3表達明顯降低(均P<0.05);與實驗組相比,過表達組腎組織中AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3的表達明顯升高(均P<0.05),見表2、圖4。

圖4 各組腎組織中AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3蛋白表達

3 討 論

祖國傳統醫學在漫長的歷史進程中,積累了豐富的治療腎病及腎纖維化等腎臟疾病的經驗,中醫認為“腎”主元氣,“腎氣”足而精力充沛,在中醫“陰陽配伍”和腎臟陰陽調和的指導下,涌現了大量的相關治療名方,如養陰活血方、腎炎防衰液、腎消康、延腎膠囊、通絡方等。古方腎氣丸出自我國著名醫學家張仲景《傷寒雜病論》中的《金匱要略》,主要由肉桂、附子、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉及山茱萸、熟地黃等八味中藥,將溫陽與滋陰相結合,發揮補腎助陽、陰中求陽,鼓舞腎氣的目的。腎氣丸配伍嚴謹常用于頑固性失眠,虛勞腰痛等病癥的治療,并取得了良好的療效〔7,8〕。劉瑞萍等〔9〕將腎氣丸用于陰陽兩虛糖尿病腎病的臨床治療中,結果顯示該方的應用能明顯降低患者的尿蛋白的排泄,降低炎性因子的釋放,緩解患者的臟器損傷,改善其腎功能。本研究結果顯示實驗組大鼠的臨床癥狀,腎組織的病理損傷,纖維化程度、腎組織細胞的超微結構損傷均明顯緩解,證實了藥物對疾病的干預作用。

TGF-β1是目前已知的具有最強致纖維化效用的細胞因子之一,在腎、心、肝、肺等臟器纖維化進展過程中發揮關鍵的調控作用〔10〕。Geng等〔11〕研究顯示在單側輸尿管梗阻模型小鼠中抑制TGF-β1的表達,抑制TGF-β1/Smad3信號的激活,能明顯降低實驗動物腎組織中間充質細胞標志物α-SMA的表達,下調ColⅣ導致臟器中的膠原沉淀比例。本研究以腺嘌呤作為誘導劑,該含氮雜環化合物在體內特異性酶的作用下,生成2,8-二羥基腺嘌呤致使腎組織中氮質化合物代謝異常,腎小管發生阻塞,動物的腎功能異常,血清中的過飽和尿酸刺激血管中血管活性肽(主要是AngⅡ的表達升高),激活TGF-β1,誘發大鼠腎間質纖維化〔12〕。本研究以過表達pcDNA3.1-TGF-β1作為對照,過表達組改善情況較實驗組明顯變差,證實了藥物的作用靶點。

綜上,腎氣丸能減輕腎間質纖維化大鼠腎組織的病理損傷,改善其腎功能,這與抑制TGF-β1/Smad3信號的激活有關。但是將腎氣丸全面用于疾病的臨床治療,需要更為詳盡、系統的研究。