糖皮質激素通過Nrf2/HO-1信號通路對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺氧化應激反應的影響

齊見旭 歐宗興 李英 王心曉

(?？谑腥嗣襻t院 1呼吸與危重癥醫學科,海南 ?？?570208;2重癥醫學科)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種常見的進行性發展呼吸系統非傳染性疾病,特點是呼吸氣流受限、肺部出現慢性炎癥,臨床表現有咳嗽、氣短、呼吸困難等〔1〕。至2020年,COPD居于我國死亡原因第3位,全球死亡原因第4位,且患病率仍在持續上升〔2〕。COPD的發病率、致殘率和死亡率都很高,且容易復發。COPD的病因尚不明確,目前已知的高危致病因素有吸煙、空氣污染、長期暴露于可吸入顆粒物環境下、呼吸道感染、家族病史等〔3～6〕,這些也是常見的對肺功能造成負面影響的因素。研究〔7〕表明COPD患者患病初期氣道和肺組織就已出現炎癥。中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等與炎癥相關的細胞受到外界或內部條件影響釋放出炎癥因子,激活多種細胞信號通路,損傷肺部細胞,破壞肺結構〔8〕。臨床常用糖皮質激素對COPD患者進行治療,可有效減輕COPD患者的炎癥反應,能夠調節機體的代謝和免疫系統,還能影響血液系統及神經系統〔9〕。因其藥理作用繁多,糖皮質激素在機體內的具體作用機制還未被研究透徹。核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶-1(Nrf2/HO-1)信號通路具有保護線粒體、抗炎、抗氧化、調節細胞凋亡等作用〔10〕,可能參與了糖皮質激素調節機體的作用過程。本研究通過檢測COPD模型大鼠機體內Nrf2/HO-1通路相關指標水平變化與表達情況探究糖皮質激素對COPD氧化應激反應的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物 48只雄性SD大鼠,體質量200～230 g,購自陜西省醫學實驗動物中心,動物合格證號為SCXK(陜)2018-0009。大鼠自由進食飲水,在23～26 ℃、濕度30%～50%環境下適應性飼養1 w后開展實驗。本實驗按照動物實驗倫理指導守則進行操作。

1.2試劑 香煙(中華牌,焦油量10 mg,尼古丁含量0.9 mg,一氧化碳含量10 mg),脂多糖(貨號SMB00704,美國Sigma公司),吸入用布地奈德混懸液(普米克令舒,國藥準字H20140475,AstraZeneca Pty Ltd),蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號C0105S)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(貨號P0012,上海碧云天生物技術有限公司),Masson三色法染色試劑盒(貨號M029,上海歌凡生物科技有限公司),大鼠C-反應蛋白(CRP)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(貨號GV-E13446,上海極威生物科技有限公司),大鼠白細胞介素(IL)-6(貨號ml064292)、IL-8(貨號ml002885)、大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α(貨號ml002859)ELISA檢測試劑盒(上海酶聯生物公司),降鈣素原(PCT)ELISA檢測試劑盒(貨號H151-1)、總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(貨號A001-3-2)、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(貨號A007-1-1)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(貨號A003-1-2,南京建成生物工程研究所),兔Nrf2抗體(貨號12721)、兔HO-1抗體(貨號86806,美國Cell Signaling Technology公司),小鼠β-actin抗體、兔二抗抗體、小鼠二抗抗體、化學發光液(ECL,美國Thermo Fisher公司),其他試劑均為市售分析純。

1.3儀器 動物煙熏箱、FM系統動物肺功能檢測儀(上海玉研科學儀器有限公司),BRM-085Ⅱ型壓縮霧化吸入機(百瑞醫療科技有限公司),光學顯微鏡(德國Leica公司),DNP-9272 電熱恒溫培養箱(上海甘易儀器設備有限公司),HBS-1096C 酶標分析儀(南京德鐵實驗設備有限公司),AU480全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司),LF-Mini4型小型垂直電泳槽(北京龍方科技有限公司),eBlotTML1快速濕轉儀(南京金斯瑞生物科技有限公司),TS-2000型脫色搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司),接觸式無損定量成像儀(上海易孛特光電技術有限公司)。

1.4分組與造模 將大鼠隨機分為對照組、模型組、糖皮質激素低劑量組和糖皮質激素高劑量組,每組12只。采用煙熏聯合氣管滴注脂多糖的方法建立COPD模型。對照組正常呼吸潔凈空氣,建模大鼠除滴注脂多糖當天不進行煙熏,之后每日在煙熏箱內接受內置10支煙、為期30 min的煙熏,總共煙熏35 d。第1、14、28天麻醉全部大鼠,建模大鼠經氣道滴注濃度為1 mg/ml的200 μl脂多糖,對照組經氣道滴注200 μl的生理鹽水。36 d使用動物肺功能檢測儀檢測各組大鼠1 s用力呼吸容積(FEV1)和用力肺活量(FVC)的值,并計算FEV1和FVC的比值,FEV1/FVC<0.7提示造模成功〔11〕。造模成功后開始讓糖皮質激素低、高劑量組每日吸入布地奈德氣霧劑,劑量分別為0.5 mg和2 mg,吸入時長15 min,對照組與模型組每日吸入霧化的生理鹽水,吸入時長與糖皮質激素低、高劑量組相同,持續2 w。

1.5大鼠肺功能檢測 給藥結束后再次檢測各組FEV1和FVC的值,并計算FEV1和FVC的比值。

1.6HE染色觀察肺組織形態 處死大鼠后取出兩肺,取部分肺組織用生理鹽水沖洗干凈,放入4%多聚甲醛中固定,經脫水后石蠟包埋,制成4 μm厚的石蠟切片。按照HE染色試劑盒說明書的要求進行HE染色,在光鏡下觀察各組大鼠肺組織形態。

1.7血清中炎性因子水平檢測 分離大鼠腹主動脈,采集動脈血并按照ELISA檢測試劑盒說明書的要求進行樣本前處理與實驗操作,檢測大鼠動脈血血清中CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α水平。

1.8血清中氧化應激指標檢測 按照生化檢測試劑盒說明書的要求進行樣本前處理與實驗操作,檢測大鼠動脈血血清中SOD、CAT、MDA水平。

1.9Masson法檢測大鼠肺組織纖維化程度 取石蠟切片,按照Masson三色法染色試劑盒說明書的要求進行Masson染色,在光鏡下觀察并拍攝各組肺組織纖維化結果,用ImageJ軟件計算Masson染色中藍色膠原纖維面積的百分比。

1.10Western印跡檢測肺組織中Nrf2、HO-1表達 取肺組織制成勻漿,加入適量的預冷蛋白裂解液,充分混合后置入冰盒內低溫孵育2 h。裂解完成后將勻漿放入低溫離心機內,在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min,取上清液進行BCA定量,制成總蛋白含量相同的Western印跡上樣。凝膠電泳分離樣品蛋白,轉膜,截取目的條帶,浸于5%脫脂奶粉制成的封閉液中,放到搖床上室溫封閉1 h。加入1∶500稀釋的一抗孵育液,充分搖勻后于4 ℃環境下過夜。平衡至室溫后洗膜,加入1∶5 000稀釋的對應二抗孵育液,室溫孵育2 h,洗膜后加入ECL,避光反應5 min,用定量成像儀收集結果。

1.11統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗,方差分析。

2 結 果

2.1各組外觀變化與肺功能檢測結果 對照組大鼠外觀與實驗前無明顯變化,呼吸正常,口鼻無明顯分泌物。模型組毛色泛黃無光澤,出現咳嗽的情況,口鼻有濃稠分泌物。糖皮質激素低、高劑量組較模型組情況有所改善,毛色較為正常,咳嗽癥狀減輕,口鼻分泌物減少。肺功能檢測結果顯示,與對照組相比,模型組、糖皮質激素低、高劑量組肺功能指標均明顯下降(P<0.05);與模型組相比,糖皮質激素低、高劑量組肺功能指標均明顯上升(P<0.05)。見表1。

表1 各組肺功能檢測結果

2.2各組肺組織HE染色結果 與對照組相比,模型組肺泡、肺泡管、肺泡囊出現膨脹融合現象,管腔內存在黏液與炎性細胞;與模型組相比,糖皮質激素低、高劑量組肺組織結構更完整,管腔內黏液與炎性細胞相對減少。見圖1。

圖1 各組肺組織(HE染色,×400)

2.3血清中CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α、SOD、CAT、MDA水平比較 與對照組相比,模型組、糖皮質激素低、高劑量組CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α、MDA水平均明顯上升,SOD、CAT水平明顯下降(P<0.05);與模型組相比,糖皮質激素低、高劑量組CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α、MDA水平均明顯下降,SOD、CAT水平明顯上升(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α、SOD、CAT、MDA水平比較

2.4各組肺組織纖維化程度 與對照組相比,模型組、糖皮質激素低、高劑量組肺組織結構出現變化,纖維化程度明顯提高,膠原纖維面積明顯增大(P<0.05);與模型組相比,糖皮質激素低、高劑量組肺組織結構更完好,纖維化程度降低,膠原纖維面積明顯減小(P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 各組肺組織(Masson染色,×200)

表3 各組肺組織膠原纖維面積、Nrf2、HO-1表達水平比較

2.5肺組織中Nrf2、HO-1表達情況 與對照組相比,模型組、糖皮質激素低、高劑量組Nrf2、HO-1表達量均明顯上升(P<0.05);與模型組相比,糖皮質激素低、高劑量組Nrf2、HO-1表達量均明顯上升(P<0.05)。見表3、圖3。

圖3 Western印跡檢測各組肺組織中Nrf2、HO-1表達

3 討 論

COPD的主要發病機制為肺部結構的慢性炎癥反應與氧化應激〔12〕?；颊唧w內的中性粒細胞與巨噬細胞被外界刺激或內部條件激活并聚集于肺部,令肺部細胞的蛋白降解,破壞肺部組織結構。嗜酸性粒細胞會釋放出細胞毒性物質溶解肺泡上皮細胞,進一步加強炎癥反應,擴大肺部組織損傷〔13〕。巨噬細胞釋放的TNF-α等細胞因子還會激活肺成纖維細胞,使其增殖,合成大量膠原并積聚細胞外基質,導致肺部組織纖維化〔14〕。肺部損傷令肺功能降低,FEV1/FVC<0.7是臨床上診斷COPD的指標之一。本研究說明,糖皮質激素能夠在一定程度上抑制炎癥相關細胞的激活,減輕機體內的炎癥反應與氧化應激。

CRP是一種急性時相反應蛋白,會對IL-6的水平變化作出反應,作為血液炎癥標志物應用于臨床診斷當中〔15〕。PCT能夠反映機體全局炎癥反應的活躍程度,預測COPD患者的死亡率〔16〕。IL-6與IL-8能夠激活中性粒細胞、巨噬細胞和嗜酸性粒細胞,TNF-α會進一步提高IL-8的水平〔17〕。本研究說明,糖皮質激素抑制了COPD大鼠機體內炎性細胞因子的水平。

正常機體內氧化物與抗氧化物處在動態平衡的狀態中〔18〕,若機體攝入外源性氧化物,如香煙的煙霧和可吸入顆粒物,就會消耗體內的抗氧化物,影響原本的平衡狀態。進入肺部的外源性氧化物可以直接傷害肺組織和氣道,還能夠通過多種途徑刺激肺部產生炎癥反應,釋放內源性氧化物,加劇氧化應激反應與氧化物-抗氧化物失衡〔19〕。SOD能夠消除代謝過程中產生的自由基,CAT負責促進具有氧化劑毒性的過氧化氫分解,二者都屬于抗氧化物〔20〕。MDA是脂質過氧化產物的一種,本研究結果說明,糖皮質激素能夠糾正COPD大鼠機體內氧化物-抗氧化物的失衡狀態。

Nrf2/HO-1信號通路具有抵抗氧化應激損傷,保護組織臟器的能力〔10〕。Nrf2通過位移至細胞核中與抗氧化反應元件(ARE)結合,激活SOD、CAT及Ⅱ相解毒酶等靶基因,提高抗氧化物表達水平〔21〕。HO-1是Ⅱ相解毒酶的一種,由它引發的下級信號通路具有抗氧化作用〔10〕,HO-1的代謝產物還具有抗炎的作用〔22〕。本研究結果說明,糖皮質激素能起到激活Nrf2/HO-1信號通路的作用。