葡萄籽提取物原花青素通過LncRNA NBR2/miR-650調節EMT抑制肝癌細胞Hep3B增殖、遷移和侵襲的分子機制

雷潔瓊 田迎霞 李正果 王興東

(甘肅省醫學科學研究院腫瘤醫院 1介入治療科,甘肅 蘭州 730050;2特需科)

肝癌是成年人中最常見的原發性肝癌,其惡性度高且預后差。在肝癌的許多治療選擇中,完整的腫瘤切除術是最好的治療策略之一〔1〕。對于不能手術的肝癌患者,化學療法是用于治療肝癌的選擇之一,但藥物功效仍然有限〔2〕。因此,迫切需要開發化學療法或化學預防方法來管理肝癌。葡萄籽提取物原花青素是由兒茶素和(或)表兒茶素聚合而成的二聚體、三聚體、四聚體和低聚物/聚合物的混合物〔3〕。迄今為止,葡萄籽提取物原花青素被證明在肝癌〔4〕、食管癌〔5〕、胰腺癌〔6〕、肺癌〔7〕等癌癥中顯示出一定的抗腫瘤活性,然而,葡萄籽提取物原花青素在肝癌中發揮的分子機制卻鮮為人知。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是參與許多生物學功能過程的重要因素,包括惡性腫瘤的發展和進展,如肝癌〔8〕。LncRNA NBR2位于眾所周知的腫瘤抑制基因乳腺癌易感基因(BRCA)1附近,在不同器官中廣泛表達。研究表明,LncRNA NBR2通過激活單磷酸腺苷激活的蛋白激酶和使哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路失活,介導姜黃素抑制大腸癌增殖的功能〔9〕。LncRNA NBR2在肝癌細胞中低表達,具有抑制肝癌生長和轉移的作用〔10〕。LncRNA NBR2在骨肉瘤組織中的表達下調,LncRNA NBR2過表達可以通過抑制上皮間充質轉化(EMT)過程來抑制骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移〔11〕。但是,沒有關于LncRNA NBR2是否介導葡萄籽提取物原花青素在肝癌惡性腫瘤中的作用和機制的信息。因此,本研究使用葡萄籽提取物原花青素處理肝癌細胞Hep3B,進行體外測定,并分析涉及的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 葡萄籽提取物原花青素(原花青素含量>95%)購自天津尖峰,肝癌細胞Hep3B購自美國ATCC細胞庫,si-NC、si-LncRNA NBR2、anti-miR-NC、anti-miR-650、miR-NC、miR-650購自上海GenePharma,細胞計數試劑盒(CCK)-8購自日本DojindoLaboratories,RNAiso Plus、PrimeScript RT、SYBR Master Mix試劑盒購自日本TaKaRa。

1.2細胞培養與分組 整個實驗過程肝癌細胞Hep3B使用RPMI1640培養基,在37 ℃的培養箱中,95%空氣和5% CO2的潮濕環境下,在RPMI1640培養基中添加了10%胎牛血清(FBS),100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素。將肝癌細胞Hep3B分為NC組、低、中、高劑量組、si-NC組、si-LncRNA NBR2組、si-NC+高劑量組、si-LncRNA NBR2+高劑量組、anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高劑量組、anti-miR-650+si-LncRNA NBR2+高劑量組。NC組未使用任何處理,低、中、高劑量組分別使用含25、50、100 μg/ml葡萄籽提取物原花青素的培養基處理48 h。將肝癌細胞Hep3B以每孔2×105個細胞接種在12孔板中。密度達到80%時,根據Invitrogen制造商的操作手冊,使用Lipofectamine2000試劑盒進行si-NC、si-LncRNA NBR2、anti-miR-NC、anti-miR-650瞬時轉染。6 h后根據分組,更換培養基為包含或不包含高劑量(100 μg/ml)葡萄籽提取物原花青素的培養基,繼續培養48 h備用。

1.3Western印跡檢測蛋白表達 Western印跡中使用的一抗包括抗細胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、β-肌動蛋白(actin)。首先將肝癌細胞Hep3B在放射免疫沉淀測定(RIPA)緩沖液中裂解。使用二喹啉甲酸(BCA)方法對蛋白質進行定量,然后將其加載到1×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上進行分離。然后將蛋白質轉移到聚氟乙烯膜上,依次將其與一抗孵育(抗β-actin的稀釋度為1∶2 000,其他抗體的稀釋度為1∶1 000)。清洗膜后,使用辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(山羊抗兔IgG,1∶5 000)在室溫下孵育2 h。之后,添加增強的電化學發光(ECL),并使用凝膠成像分析系統以β-actin作為內部參考來檢測每個條帶的光密度值。

1.4CCK-8分析細胞增殖 肝癌細胞Hep3B經1.2中處理后,接種到96孔板中,每孔5×104個細胞。將肝癌細胞Hep3B培養48 h,10 μl CCK-8試劑被添加至孔中并反應2 h,用酶標儀讀取每個孔450 nm處吸光度A值,表示肝癌細胞增殖能力。

1.5Transwell法分析細胞遷移與侵襲 使用基質膠(侵襲)或不含基質膠(遷移)的Transwell室檢測細胞侵襲與遷移能力。收集2.5×105個肝癌細胞Hep3B,重懸于200 μl無血清培養基中,并添加到Transwell上部隔室中。將500 μl含10% FBS的培養基添加到下部隔室中,24 h后取出小室,用棉簽擦拭小室上表面的細胞,固定和染色發生侵襲或遷移的肝癌細胞Hep3B,顯微鏡下統計侵襲或遷移細胞數量。

1.6定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測LncRNA NBR2、miR-650的表達 通過RNAiso Plus試劑從肝癌細胞Hep3B中提取總RNA,并使用PrimeScript RT試劑盒將其反轉錄為cDNA。在Bio-Rad CFX96系統中使用SYBR Master Mix和特定引物進行qRT-PCR。用2-ΔΔCt法分析LncRNA NBR2與β-actin的相對水平及miR-650與U6的相對水平。NBR2正向引物5′-GAGGTCTCCAGTTTCGGTAA-3′;反向5′-GAACCAAGGTGAAGGACCAA-3′。β-actin正向引物5′-GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT-3′;反向5′-TGATCCACATCTGCTGGAAGGT-3′。miR-650正向引物5′-AGAGGAGGCAGCGCTCT-3′;反向5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。U6正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;反向5′-AACGCTTCACGAATTTGC GT-3′。

1.7雙熒光素酶活性檢測 在starbase軟件中預測LncRNA NBR2和miR-650的靶向結合區域。構建含有miR-650結合位點的LncRNA NBR2-野生型(WT)及突變型(MUT)報告基因載體WT(LncRNA NBR2)及MUT(LncRNA NBR2),在肝癌細胞Hep3B細胞中轉染miR-NC或miR-650和WT(LncRNA NBR2)或MUT(LncRNA NBR2),在雙熒光素酶報告基因檢測系統中進行轉染48 h后的熒光素酶活性檢測。

1.8統計學分析 每個獨立實驗均重復3次。采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1葡萄籽提取物原花青素對肝癌細胞Hep3B細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用 見圖1、表1。低、中、高劑量組Hep3B細胞中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達量、增殖能力、遷移和侵襲數量均顯著低于NC組(P<0.05)。

表1 葡萄籽提取物原花青素對肝癌細胞Hep3B細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用

1～10:NC組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、si-NC組、si-LncRNA NBR2組、si-NC+高劑量組、si-LncRNA NBR2+高劑量組、anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高劑量組、anti-miR-650+si-LncRNA NBR2+高劑量組

2.2葡萄籽提取物原花青素處理后LncRNA NBR2上調,miR-650下調表達 見表2,低、中、高劑量組葡萄籽提取物原花青素作用的肝癌細胞Hep3B細胞中LncRNA NBR2表達量分別約為NC組的1.35、1.79、2.37倍,miR-650表達量分別約為NC組的0.89、0.67、0.48倍,低、中、高劑量組與NC組之間的差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 LncRNA NBR2低表達減弱葡萄籽提取物原花青素對肝癌細胞Hep3B細胞增殖、遷移和侵襲的抑制影響

表3 miR-NC或miR-650與報告質粒共轉染肝癌細胞Hep3B細胞后雙熒光素酶活性檢測

2.3LncRNA NBR2低表達減弱葡萄籽提取物原花青素對肝癌細胞Hep3B細胞增殖、遷移和侵襲的抑制影響 見圖1、表2。si-LncRNA NBR2組Hep3B細胞中LncRNA NBR2表達量約為si-NC組的0.46倍,CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達量依次約為si-NC組的1.59、1.52、1.44倍,并且細胞增殖能力、遷移和侵襲數量均比si-NC組高,差異均有統計學意義(P<0.05)。si-LncRNA NBR2+高劑量組Hep3B細胞中LncRNA NBR2表達量約為si-NC+高劑量組的0.56倍,但CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達量和增殖能力、遷移和侵襲數量均高于si-NC+高劑量組,差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.4LncRNA NBR2靶向調控miR-650的表達 starbase對LncRNA NBR2和miR-650結合的預測結果見圖2。WT(LncRNA NBR2)熒光素酶活性在miR-NC組與miR-650組之間差異有統計學意義(P<0.05),MUT(LncRNA NBR2)熒光素酶活性在miR-NC組與miR-650組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。si-NC組、si-LncRNA NBR2組、pcDNA-NC組、pcDNA-LncRNA NBR2組Hep3B細胞miR-650表達量依次為1.00±0.10、1.88±0.12、1.02±0.09、0.46±0.03,si-NC組與si-LncRNA NBR2組之間、pcDNA-NC組與pcDNA-LncRNA NBR2組之間差異均有統計學意義(P<0.05)。

圖2 通過starbase對LncRNA NBR2和miR-650結合進行預測示意

2.5anti-miR-650可以逆轉LncRNA NBR2低表達影響葡萄籽提取物原花青素對肝癌細胞Hep3B細胞增殖、遷移和侵襲的作用 見圖1、表4。anti-miR-650+si-LncRNA NBR2+高劑量組Hep3B細胞CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白、LncRNA NBR2表達量及增殖能力、遷移和侵襲數量均低于anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高劑量組,差異有統計學意義(P<0.05)。

表4 anti-miR-650可以逆轉LncRNA NBR2低表達影響葡萄籽提取物原花青素對肝癌細胞Hep3B細胞增殖、遷移和侵襲的作用

2.6EMT通路相關蛋白的表達 見表5、圖3。高劑量組或anti-miR-650+si-LncRNA NBR2+高劑量組肝癌細胞Hep3B細胞中E-Cadherin蛋白表達量高于NC組或anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高劑量組,N-Cadherin、Vimentin蛋白表達量低于NC組或anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高劑量組,高劑量組與NC組之間、anti-miR-650+si-LncRNA NBR2+高劑量組和anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高劑量組之間差異有統計學意義(P<0.05),而si-LncRNA NBR2+高劑量組E-Cadherin蛋白表達量低于si-NC+高劑量組,N-Cadherin、Vimentin蛋白表達量高于si-NC+高劑量組,差異有統計學意義(P<0.05)。

表5 Western印跡檢測E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin蛋白的表達

1～6:NC組、高劑量組、si-NC+高劑量組、si-LncRNA NBR2+高劑量組、anti-miR-NC+si-LncRNA NBR2+高劑量組、anti-miR-650+si-LncRNA NBR2+高劑量組

3 討 論

葡萄籽提取物原花青素擁有抗氧化〔12〕、抗炎〔13〕、降血糖〔14〕、保護心肌〔15〕、抗腫瘤等多種生物學功能〔16〕。最近,葡萄籽提取物原花青素已被證明可以通過調節細胞增殖、周期、凋亡等過程抑制各種癌癥的進展〔4～7〕,如葡萄籽中的原花青素被發現以濃度和時間依賴方式抑制骨肉瘤細胞增殖〔17〕。葡萄籽提取物原花青素F2能夠減慢膠質瘤細胞生長和血管生成發揮抗腫瘤活性〔18〕。親脂性葡萄籽原花青素導致前列腺癌PC3細胞增殖受阻,這可以通過減少CyclinD1和CDK4的表達并增加腫瘤抑制因子p21和p27的表達來證實〔19〕。最新研究顯示,葡萄籽原花青素抑制肝癌細胞HepG2的生存能力,誘導細胞凋亡和G2/M期細胞周期停滯,并調節細胞周期蛋白B1、MMP水平〔4〕。本研究中,葡萄籽提取物原花青素同樣表現出抗肝癌細胞Hep3B增殖的作用。此外,葡萄籽提取物原花青素還可抑制細胞的遷移和侵襲。作為研究較多的MMP,MMP-2和MMP-9以其在癌細胞侵襲和腫瘤轉移中的關鍵作用而備受關注。MMP-2和MMP-9的下調證實了葡萄籽提取物原花青素的肝癌細胞Hep3B遷移、侵襲抑制活性?？傊?這些結果表明,葡萄籽提取物原花青素對肝癌具有抑制作用。

LncRNA NBR2已被證明是一種肝癌發生發展的抑制因子〔10〕。根據報道,LncRNA NBR2通過靶向下調miRNA-21抑制大腸癌細胞的遷移和侵襲〔20〕。本研究中,LncRNA NBR2低表達使肝癌細胞Hep3B增殖、侵襲和遷移顯著增強,與相關蛋白CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達的上調相一致,而這些蛋白水平進一步證明了LncRNA NBR2低表達可以促進肝癌細胞Hep3B增殖和轉移。這些數據表明,LncRNA NBR2在肝癌中用作抑癌基因,并抑制肝癌細胞Hep3B的增殖,侵襲和遷移,與前人研究〔10〕相符。此外,葡萄籽提取物原花青素可顯著增加肝癌細胞Hep3B中LncRNA NBR2的表達。當LncRNA NBR2低表達時,葡萄籽提取物原花青素對肝癌細胞Hep3B的抑制作用被減弱。這些結果表明葡萄籽提取物原花青素通過調節LncRNA NBR2的水平來調節肝癌進程。

本研究生物信息學分析后,miR-650被確定為LncRNA NBR2的靶標。在先前的研究中,miR-650在肝癌中高度上調〔21〕,miR-650表達增加與肝癌患者的不良臨床特征密切相關,并且miR-650起促進肝癌細胞遷移、侵襲和上皮間質轉化的作用〔22〕?？梢妋iR-650是肝癌的致癌因子,加速肝癌進展。本研究發現,LncRNA NBR2低表達減弱葡萄籽提取物原花青素對肝癌細胞Hep3B細胞增殖、遷移和侵襲的作用可被anti-miR-650所逆轉。結合雙熒光素酶活性檢測和qRT-PCR實驗中LncRNA NBR2對miR-650的靶向負調控作用,證明葡萄籽提取物原花青素影響肝癌進程與上調LncRNA NBR2靶向下調miR-650有關。

腫瘤的惡性轉化的重要特征之一是細胞的侵襲和轉移。EMT是上皮細胞轉化為間充質表型細胞的過程,其在癌癥轉移和多纖維化疾病中起著重要的作用〔23〕。在EMT期間,上皮細胞標志分子E-cadherin被下調,而間質細胞標志物(例如N-cadherin和Vimentin)表達的增加,可能導致細胞侵襲和遷移特性的增強〔24〕。獲得間質細胞樣特性后,腫瘤細胞可從原發組織擴散開,這是癌癥轉移的關鍵步驟〔25〕。因此本研究檢查了EMT過程標志蛋白的水平,發現葡萄籽提取物原花青素通過上調E-cadherin、下調N-cadherin和Vimentin水平對肝癌細胞Hep3B的EMT進程起抑制作用。我們進一步研究了LncRNA NBR2/miR-650可能的下游信號通路。正如先前的研究表明,LncRNA NBR2的過表達抑制了骨肉瘤細胞的N-cadherin和VimentinmRNA表達,并增加了腫瘤組織中E-cadherin的mRNA表達〔11〕,此外,N-cadherin和Vimentin在LncRNA NBR2過表達的非小細胞肺癌細胞中被下調,E-cadherin被上調〔23〕,可見LncRNA NBR2可以抑制EMT進展。另外,LncRNA NBR2低表達減弱了葡萄籽提取物原花青素抑制肝癌細胞Hep3B EMT的作用,而這些作用又被anti-miR-650所逆轉,這些表明葡萄籽提取物原花青素可以通過LncRNA NBR2調節miR-650有效抑制EMT進程,從而抑制肝癌的發展。

綜上,葡萄籽提取物原花青素通過LncRNA NBR2/miR-650途徑調節EMT發揮對肝癌進展的抑制作用,這些數據為葡萄籽提取物原花青素抑制腫瘤提供了進一步的證據,并可能為肝癌治療提供新的見解。未來仍需要進一步的研究來說明葡萄籽提取物原花青素在體內腫瘤模型中的作用。