竹葉花椒-飛龍掌血嫁接樹表型及生理性狀的抗旱響應

王 飛,郝佳波,胡 青,郭永清,饒紹松,陸 斌,辛培堯

(1. 西南林業大學,國家林業和草原局西南風景園林工程技術研究中心,云南 昆明 650224;2.云南省林業和草原科學院,云南 昆明 650201;3.魯甸縣林業和草原局,云南 昭通 657199)

竹葉花椒(Zanthoxylumarmatum)又稱青花椒,隸屬蕓香科(Rutaceae)花椒屬(Zanthoxylum),是一種兼具食用和藥用價值的木本油料植物,廣泛分布于云南、四川、重慶等地[1]。早在《詩經》中就有文字記載其可用作調味料及中藥材[2]。多年來,國內外研究人員致力于花椒栽培管理[3-4]、遺傳育種[5-6]、主成分分析與利用[7-8]以及產品貯藏加工[9-10]等多方面的研究,且取得了顯著成效。竹葉花椒是云南省傳統主栽花椒種之一,主要分布在金沙江、牛欄江流域的干熱河谷區以及麗江、楚雄等部分地區[11]。隨著花椒產業的發展和良種推廣,花椒現已成為云南主要經濟樹種之一[6]。但由于干熱河谷地區特殊的環境和立地條件,干旱少雨、土壤貧瘠等問題日益突出,這嚴重影響了花椒的推廣種植。因此,針對云南竹葉花椒種植區的生態條件,開展提高竹葉花椒相關抗旱性研究,對擴大花椒產區、促進花椒產業的發展至關重要。

嫁接苗是經濟林木栽培最常用的苗木類型,而優良砧木的選育對后期嫁接苗木的長勢、抗逆性、果實的產量和品質等至關重要[12]。應用砧木良種嫁接可增強栽培品種的抗逆性,如抗旱[13-14]、抗寒[15]、抗鹽堿[16-17]以及抗病蟲害[18]等。目前,國內外在蘋果(Maluspumila)[19]、柑橘(Citrusreticulata)[20-21]、葡萄(Vitisvinifera)[22-23]等果樹中有關砧木選育嫁接的研究報道較多,且大部分是通過研究植株各組織表型、解剖結構以及各生理指標的變化來反映砧木嫁接對接穗的影響。但有關花椒砧木選育及利用砧木嫁接來提高花椒抗逆性等方面的研究鮮見報道。龔霞等[24]選用大紅袍作砧木,通過嫁接不同接穗品種,為四川南部花椒產區篩選出了少刺且具有一定抗病蟲害特性的砧穗組合。蔡麟閣等[25]通過觀測3種砧木材料嫁接無刺花椒后接口愈合情況、成活率、生長結果狀況及抗病性等指標,發現豆椒作為無刺花椒砧木效果最好。在花椒抗旱砧木選育研究中,龔霞等[26]設置了不同干旱脅迫梯度,測定了6種花椒砧木的膜透性、葉片含水量、生長量等,利用隸屬函數法對其抗旱性強弱進行了排序;而有關花椒的解剖結構、內在生理生化抗旱響應機制等卻鮮見報道。

飛龍掌血(Toddaliaasiatica)是蕓香科飛龍掌血屬(Toddalia)多年生木質藤本植物,自然分布于云南、貴州等干熱河谷區的路旁、山坡疏林中,其主根深扎,側根及毛細根密集,對干旱、貧脊的土壤適應性較強[27]。另外,在系統發育研究中,Li等[28]基于16個物種的葉綠體基因組構建最大似然系統發育樹,發現飛龍掌血屬與花椒屬的親緣關系最為密切。根據前期嫁接和初步栽培觀測,發現以飛龍掌血作砧木嫁接竹葉花椒后其嫁接親和性較好,無“大小腳”現象,且嫁接苗在干旱條件下生長表現良好,是選育抗旱花椒砧木的優良材料。目前有關飛龍掌血嫁接竹葉花椒后的主要性狀表現及抗旱響應機制尚未清楚。因此,本研究在觀測竹葉花椒和飛龍掌血1年生實生苗根系特征的基礎上,對比分析了飛龍掌血做砧木嫁接竹葉花椒后葉片的解剖結構、色素含量及主要生理指標的差異,并測算了果實產量,以期揭示飛龍掌血作為竹葉花椒抗旱砧木的特性和栽培價值,為竹葉花椒抗旱砧木的選育及該嫁接組合的應用推廣提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料采集在魯甸明德花椒莊園進行。明德花椒莊園位于云南省昭通市魯甸縣小寨鎮,屬低緯度山地季風氣候;年平均氣溫14.7℃,年均無霜期289 d,年均降水量僅74.1 mm。從莊園育苗基地隨機各選5株竹葉花椒和飛龍掌血1年生實生苗作為根系觀測材料。同時,以2年生飛龍掌血實生樹為砧木,接穗在4年生竹葉花椒上采集,用枝接法嫁接。待嫁接樹接口愈合后,在園內選取長勢基本一致的2年生飛龍掌血、4年生竹葉花椒及其嫁接樹各5株作為試驗樣木,在每株樣木樹冠外圍向陽面采集1年生枝條4～6葉位上完好的健康成熟功能葉,裝入采樣管,標記后置于液氮中帶回實驗室備用。所有材料于2022年4—5月采集,保證采樣前2個月無降雨及人工灌溉,且此時正值云南旱季末期,植株受干旱的影響較大,嫩葉略卷曲,采集的樣品更具代表性。

1.2 實生苗根系觀測

清水浸泡并沖洗干凈的完整苗木根系,利用萬深LA-S植物根系分析儀(杭州萬深檢測科技有限公司)測量并統計竹葉花椒和飛龍掌血1年生實生苗的根系總根長、體積、平均直徑、根尖數以及分叉數等指標。

1.3 葉片解剖結構觀察

參考李亞男等[29]提出的石蠟切片法,分別制作飛龍掌血、竹葉花椒及其嫁接樹葉子最寬處橫切面切片(厚度10～12μm),利用徠卡Leica顯微鏡觀察并拍照。根據圖像中標注的比例尺大小,用Image J軟件測量葉片組織厚度,取值為多視野下的平均值,并計算柵海比、葉肉組織緊密度及疏松度。

1.4 葉片光合色素含量測定

參考李萍[30]采用的光合色素含量測定方法,利用相關公式分別對應計算飛龍掌血、竹葉花椒及其嫁接樹葉片中葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素的含量。

1.5 葉片生理指標測定

分別測定飛龍掌血、竹葉花椒及其嫁接樹葉片中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)活性和丙二醛(MDA)含量3種主要生理指標。超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性和丙二醛含量的測定方法分別為比色法、愈創木酚法和硫代巴比妥酸法[31]。

1.6 果實產量測算

選取冠幅基本一致的竹葉花椒和嫁接樹各5株,在果實成熟期測量各單株枝條數、枝條長度、枝條果穗數、鮮果產量及單位面積產量,并計算各指標平均值。

1.7 數據統計分析

用Excel 2003、SPSS 20.0等軟件進行數據整理和統計學分析。

2 結果與分析

2.1 竹葉花椒和飛龍掌血的根系特征

結合根系掃描結果(圖1)和掃描數據方差分析(表1)可以看出,竹葉花椒和飛龍掌血1年生苗木根系之間的各項掃描參數均呈現顯著差異,其中飛龍掌血的總根長、根體積和平均直徑分別是竹葉花椒的1.3、1.8、1.2倍。從根系各指標的描述統計可以看出飛龍掌血苗木根系更為密集、發達,說明其對干旱的適應能力更強。

表1 飛龍掌血和竹葉花椒苗木根系特征比較Table 1 Comparison of root characteristics of seedlings in T. asiatica and Z. armatum

圖1 竹葉花椒和飛龍掌血苗木根系掃描Fig.1 Root scanning of seedlings in Z. armatum and T. asiatica

2.2 砧木嫁接對竹葉花椒葉片解剖結構的影響

飛龍掌血、竹葉花椒及其嫁接樹的葉片解剖結構和各微觀形態指標統計分析結果如圖2、表2所示。由圖2可以直觀地看出,飛龍掌血葉片的柵欄組織非常發達,厚度占到葉片總厚度的50%以上;經計算,發現嫁接樹葉片的柵欄組織、海綿組織厚度與竹葉花椒相比分別顯著提高了46.57%和35.38%。但相比飛龍掌血,嫁接樹葉片的柵欄組織顯著降低了45.81%,而海綿組織卻顯著增加了50.61%。從葉片柵海比(PSR)來看,嫁接樹的柵海比與竹葉花椒相比雖提高了9.24%,但兩者差異不顯著。竹葉花椒和嫁接樹葉片的葉肉組織緊密度和疏密度在P<0.05水平上差異顯著。相比竹葉花椒,嫁接樹葉片的葉肉組織緊密度增加了21.82%(表2)。

表2 飛龍掌血、竹葉花椒及其嫁接樹葉片解剖結構特征比較Table 2 Comparison of anatomical features of T. asiatica, Z. armatum and their grafted tree

注:STT:海綿組織厚度;PTT:柵欄組織厚度。Note: STT: Spongy tissue thickness; PTT: Palisade tissue thickness.圖2 飛龍掌血、竹葉花椒及其嫁接樹葉片解剖結構橫切面Fig.2 Cross-section of leaf anatomy of T. asiatica, Z. armatum and their grafted tree

2.3 砧木嫁接對竹葉花椒葉片光合色素含量的影響

嫁接樹葉片的3種光合色素含量均介于飛龍掌血和竹葉花椒之間。嫁接樹葉片葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量相比竹葉花椒對應顯著增加了13.5%、87.3%、33.5 %;但與飛龍掌血相比,嫁接樹對應的3種光合色素含量則顯著降低了13.4%、9.9%、29.2%(圖3)。嫁接組合的3個物種之間葉片各光合色素含量均達顯著差異水平,說明砧木嫁接顯著提高了竹葉花椒的光合色素含量,促進了光合作用。

注:圖中不同小寫字母表示不同材料間差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant differences among materials (P <0.05).圖3 飛龍掌血、竹葉花椒及其嫁接樹葉片光合色素含量比較Fig.3 Comparison of photosynthetic pigment content in leaves of T. asiatica, Z. armatum, and their grafted tree

2.4 砧木嫁接對竹葉花椒抗旱生理指標的影響

從飛龍掌血、竹葉花椒及其嫁接樹葉片的SOD、POD活性和MDA含量的測定分析結果可以看出(表3),與竹葉花椒相比,嫁接樹葉片的SOD和POD活性分別提高了22.1%和6.4%,但MDA含量減少了4.6%;與飛龍掌血相比,嫁接樹葉片的SOD和POD活性分別減少了6.2%和15.7%,而MDA含量卻提高了84.1%。這3項生理指標在嫁接組合的3個物種間均達顯著差異水平。

表3 飛龍掌血、竹葉花椒及其嫁接樹主要生理指標分析Table 3 Analysis of main physiological indexes of T. asiatica,Z. armatum, and their grafted tree

2.5 葉片解剖結構、光合色素含量和抗旱生理指標的相關關系

表4中3種光合色素含量之間呈極顯著正相關,Chl.a與Chl.b、Caro.的相關系數r分別為0.89和0.97;柵海比與柵欄組織厚度(PTT)、3種光合色素含量、SOD和POD活性均呈極顯著正相關關系,但與海綿組織厚度(STT)和MDA含量呈極顯著負相關關系,而丙二醛(MDA)含量除了與海綿組織厚度極顯著正相關之外,與其余各指標(PTT、PSR、Chl.a、Chl.b、Caro.、SOD和POD)均顯著或極顯著負相關,其中與柵海比的相關系數最大(r=-0.98)。而值得注意的是,海綿組織厚度與3種光合色素含量之間均不相關。

表4 葉片解剖結構、光合色素含量及抗旱生理指標間的相關性分析Table 4 Analysis of leaf anatomy, photosynthetic pigment content and correlation between main physiological indicators

2.6 竹葉花椒和嫁接樹產量比較分析

竹葉花椒和嫁接樹的樹體特征及果實產量統計結果見表5。方差分析顯示,竹葉花椒和嫁接樹的平均枝條長度、枝條果穗及單位面積產量呈顯著差異。其中,相比竹葉花椒,嫁接樹的平均枝條果穗和單位投影面積產量分別顯著提高了57.1%和34.1%,而平均枝條長度顯著降低了31.6%。

表5 竹葉花椒和嫁接樹果實產量分析Table 5 Analysis of fruit yield of Z. armatum and its grafted tree

3 討 論

抗逆性是植物在長期抵抗和適應極端環境的過程中,經自然選擇形成的穩定的、可遺傳的特性,這種特性可在植物體內部各組織結構及生理生化反應等方面得以體現[32]。竹葉花椒受干熱河谷地區特殊氣候的影響,干旱成為限制其生長、分布的主要因素[33]。因此,通過優良砧木的選擇來提高竹葉花椒抗旱性在生產上有著重要的實踐意義。相關研究表明,通過優良砧木嫁接可在一定程度上改變植物內部原有的組織結構及生理生化過程,增強樹體抗旱、抗寒等能力,以達到經濟林果提質增產的目的[34]。

植物根系是評判植物抗旱性強弱的重要指標,扎根越深、根系越發達就越能適應干旱和貧瘠的環境[35]。通過對竹葉花椒和飛龍掌血1年生實生苗根系掃描數據的分析,發現兩者根系的各項掃描指標間均呈顯著差異,其中飛龍掌血的總根長、體積和平均直徑分別是竹葉花椒的1.3、1.8倍和1.2倍;從數據描述統計結果可以看出飛龍掌血苗木根系更為密集、發達,說明其對干旱的適應能力更強。

葉子是絕大多數植物進行光合作用的器官,對外界環境變化敏感,其葉形和內部解剖結構均能反映植物對周邊環境的適應性[36]。如植物比葉面積小,具角質層或蠟質層,柵欄組織發達,上表皮細胞排列緊密等特征都是對干旱生境的響應[37-38]。李鴻雁等[39]對6種牧草葉片的9項與抗旱相關的解剖結構參數進行了測定,并利用葉片各項抗旱相關參數對抗旱能力進行了綜合評價,發現不同牧草的葉片厚度、柵欄組織和海綿組織的厚度之間差異顯著,且指出柵欄組織越緊密其抗旱能力越強。而本研究通過對飛龍掌血、竹葉花椒及其嫁接樹葉片解剖結構分析發現,利用抗旱砧木飛龍掌血嫁接,可顯著增加竹葉花椒柵欄組織、海綿組織及葉片總厚度,提高柵海比和葉肉緊密度,這與上述研究結論相符,說明砧木嫁接在一定程度上增強了竹葉花椒的干旱適應性。

植物光合色素含量與其光合生產力緊密正相關,尤其是葉綠素。長期的干旱環境會阻礙植物光合色素的積累,使光合生產力下降[40]。而通過砧木嫁接顯著增加了竹葉花椒葉片中3種光合色素的含量,提高了其在干旱環境下的光合生產力,這為植株有機物的積累和正常生長奠定了基礎。植物體內部的組織結構與其生理生化過程密切相關[41],如葉片柵欄組織的厚度、緊密度與光合作用相關;氣孔的密度、大小與呼吸作用相關。本研究通過對葉片解剖結構、光合色素含量及主要生理指標的相關性分析,發現3種光合色素含量與葉片柵欄組織厚度顯著相關,但與海綿組織厚度卻不相關,這是因為葉綠體主要存在于葉片柵欄組織中,而光合作用的主要場所就是葉綠體。孫旺旺等[42]在研究連翹葉片解剖結構和色素含量時指出,葉綠體中含有葉綠素、類胡蘿卜素等多種光合色素,而葉綠體則主要位于葉片柵欄組織的細胞內。

植物為了適應干旱環境,其抗氧化能力、滲透調節作用以及膜脂過氧化程度等均會隨之改變。相關研究表明,在干旱脅迫過程中,各蛋白酶(POD、SOD、CAT等)活性、滲透調節物的含量如脯氨酸(Pro)以及膜脂過氧化反應產物(MDA)含量等均會變化以響應干旱脅迫[43],這對判斷植物抗旱性強弱有著重要的指示作用。其中,抗氧化酶POD、SOD等主要參與清除細胞內產生的活性氧自由基(ROS),進而幫助植物體抵御和忍耐干旱、高溫等非生物逆境造成的傷害[44]。石曉英等[19]研究了干旱脅迫下3種中間砧對蘋果苗生理特征的影響,發現從脅迫開始到結束,POD和SOD活性呈先升后降的趨勢,且各砧穗組合的變化幅度存在差異,指出干旱脅迫初期植物體會通過提高抗氧化酶活性來適應干旱環境,這與本研究結果基本一致。通過砧木嫁接,發現嫁接樹的POD、SOD活性相比竹葉花椒有了顯著的提高,這說明在干旱條件下嫁接樹能更多地同時利用POD、SOD清除細胞內的ROS,避免細胞膜損傷以應對干旱環境。另外,干旱脅迫下會加快膜脂過氧化反應,致使MDA過多積累。有研究表明MDA含量和植物抗旱性呈負相關[45]。本研究經測定發現,干旱環境下竹葉花椒的MDA含量最高,而抗旱性較強的飛龍掌血則最低,嫁接樹介于飛龍掌血和竹葉花椒之間,在一定程度上表明花椒抗旱性與MDA含量呈反比關系,這與前人研究結果相一致。經相關性分析,發現除了海綿組織厚度之外,MDA含量與其他各指標均呈顯著負相關關系,而現有的研究已表明植物抗旱性與海綿組織呈反比關系,與柵海比、光合色素含量及抗氧化物活性呈一定的正相關關系[46],這進一步說明竹葉花椒MDA含量與其抗旱性為負相關。相比竹葉花椒,嫁接樹的MDA含量顯著降低,這間接反映出嫁接樹在干旱環境下細胞膜脂損傷程度較低,說明其干旱適應性更強。

4 結 論

飛龍掌血作砧木嫁接竹葉花椒后,可顯著增加竹葉花椒葉片的柵欄組織厚度和葉肉緊密度,促進葉片中光合色素含量的積累,增強光合作用能力,調節主要生理指標的含量,進而提高竹葉花椒的抗旱性。研究結果可為竹葉花椒抗旱砧木選育和該嫁接組合的應用推廣奠定理論基礎。