馬鈴薯根系分泌物及氨基酸對萎縮芽孢桿菌QHZ3趨化成膜的影響

龐婭楠,邱慧珍,成志遠,陳蘭蘭,董愛菊,張春紅,王友玲

(1.甘肅農業大學資源與環境學院/甘肅省干旱生境作物學重點實驗室,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省畜禽廢棄物資源化利用工程研究中心,甘肅 蘭州 730070)

馬鈴薯作為繼水稻、玉米、小麥后的第四大糧食作物,在保障我國糧食安全、調整種植業結構和農業生產轉型升級等方面發揮著重要作用[1-2]。甘肅省因其獨特的土壤和氣候特點成為我國重要的馬鈴薯種薯和商品薯生產基地,種植面積和產量均居全國前列[3-4]。然而,隨著馬鈴薯種植面積的擴大,其輪作倒茬難以實現,連作障礙日益嚴重,加劇了土傳病害的發生,特別是由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)侵染引起的馬鈴薯黑痣病嚴重制約著我國馬鈴薯產業的可持續發展[5-8]。

馬鈴薯黑痣病可通過化學防治、農業防治和生物防治等方法進行防治[9]。生物防治時施用添加植物根際促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)的生物有機肥具有顯著的防病、促生和增產效果,且其環保、安全、無毒,不會引起病原菌產生抗藥性[10-12],能有效防控香蕉枯萎病[13]、黃瓜枯萎病[14]、西瓜枯萎病[15]、小麥根腐病[16]和棉花黃萎病[17]等土傳病害。PGPR是一類能在植物根際存活和定殖的有益微生物,具有促進植物生長及防控土傳病害的作用[18]?？勺鳛樯谰腜GPR包括真菌、放線菌、弱毒或無致病力微生物菌株及細菌等[19],尤其是細菌中的芽孢桿菌,因其具有分布范圍廣、環境適應性強、易培養且抗逆性強等特點,其作為生防因子防治植物病害已成為熱點[20]。

萎縮芽孢桿菌QHZ3是本實驗室分離出的一株兼具促生及生防特性的根際促生菌[21-22],施用由其制成的生物有機肥可觀察到菌株能在馬鈴薯根際定殖且可顯著降低馬鈴薯黑痣病的發生[3,8,20],定殖主要包括促生菌向根際的趨化和在根際聚集形成生物膜兩個步驟[18,23],其信號物質可能是根系分泌物中的一些氨基酸、小分子糖、小分子有機酸、酚酸或次級代謝產物等[24-26],本實驗室前期研究發現酚酸和有機酸可介導其有效定殖[27]。有研究表明,氨基酸類物質能使促生菌在植株根系趨化成膜[26,28]。因此,本研究采用土培試驗,結合氣質聯用鑒定馬鈴薯3個關鍵生育時期(苗期、現蕾期及盛花期)的根系分泌物,并比較馬鈴薯不同生育時期根系分泌物及氨基酸對菌株QHZ3趨化成膜的影響,進一步揭示菌株QHZ3的定殖機制。

1 材料與方法

1.1 材料

供試品種:馬鈴薯‘大西洋’原原種,購于定西市農業科學研究院。

供試菌株:萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)QHZ3由本實驗室分離、鑒定和保存。

供試土壤:取自甘肅農業大學校內試驗地,使用前進行2次高壓滅菌處理,用干凈的布袋(以高壓鍋的鐵筐為模具制作)裝滿土壤后置于鐵筐中,扎緊布袋,在121℃的條件下滅菌30 min,每筐裝土20 kg,每次2筐,取出后晾2 h,繼續于同等條件下進行二次滅菌,最后置于陰涼處自然晾干。正式播種前用紫外照射以殺死空氣中的雜菌。土壤基本理化性質為:有機質18.50 g·kg-1,全氮1.18 g·kg-1,堿解氮132.4 mg·kg-1,速效磷90.75 mg·kg-1,速效鉀27.20 mg·kg-1,pH 8.26。

供試培養基及試劑:LB液體培養基、LB固體培養基、LB半固體培養基、生理鹽水、趨化緩沖液,參考陳蘭蘭等[2]的方法配制。

氨基酸標準品:脯氨酸,甘氨酸,天冬氨酸,苯丙氨酸,酪氨酸,購于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原原種的播前處理 用0.1%的次氯酸鈉溶液對馬鈴薯原原種浸種消毒10 min后用無菌水沖洗,自然風干后避光平鋪于含脫脂棉的盤子里,置于通風處催芽,溫度以25℃為宜。待種子露白后,把頂芽以外的芽子掰掉,只留1個頂芽播種,每盆6株,重復15盆,盆缽內徑22 cm,深度17 cm,每盆裝土6 kg,播種深度3 cm,于2021年6月14日播種。

播種前先將每盆土壤用水澆透,隔夜播種。前期每2 d澆1次水,后期按照網室的溫度和土壤的干濕情況而定,每次澆水量及澆水時間相同。

1.2.2 根系分泌物的收集 參照張文明等[29-30]的收集方法:采用破壞性采樣,于馬鈴薯苗期(播種后35 d)、現蕾期(播種后55 d)和盛花期(播種后75 d)分別選取生長良好的植株3盆,每盆采樣5株,將15株植株混合后放入盛有500 mL色譜純甲醇溶液的燒杯中反復淋洗根系,得到根系分泌物的甲醇溶液,4 000 r·min-1離心5 min, 35℃下旋轉蒸發儀濃縮至100 mL,取50 mL蒸干后加50 mL蒸餾水,真空冷凍干燥得到根系分泌物干粉,于-80℃備用。

1.2.3 根系分泌物的衍生化 取5mL根系分泌物的甲醇溶液,用氮吹儀(35℃)吹干后進行硅烷衍生化。硅烷化過程具體操作如下[29-30]:加入0.5 mL Regisil試劑(99%N,O-雙三甲基硅烷基三氟乙酰胺+1%三甲基-氯硅烷)和1.16 mL嘧啶,在 70℃水浴中加熱30 min,冷卻后取樣品0.1 ml,用乙酸乙酯稀釋至2 mL,進行GC-MS分析。

1.2.4 根系分泌物的鑒定 氣相色譜型號:安捷倫7890;質譜型號:安捷倫5975C;色譜柱型號:HP-5;檢測器型號:FID。進樣量:1 μL;進樣口溫度:140℃;分流比:30∶1;加熱器溫度:280℃;電子能量:70 eV;離子源溫度:230℃;傳輸線溫度:300℃;質量掃描范圍:40～550 m·z-1。色譜條件:40℃保持5 min,10℃·min-1升溫至250℃,5℃·min-1升溫至280℃保持5 min。檢測完成后應用標準譜庫NIST05a進行物質的鑒定。

1.2.5 根系分泌物及其氨基酸對菌株QHZ3的趨化作用定性分析 定性分析參照Park等[31]的方法:按1%的體積比將過夜活化的菌株QHZ3種子液接種至LB液體培養基中,37℃、170 r·min-1、90 min培養至OD600=0.4。將直徑為6 mm的無菌濾紙片置于含有根系分泌物(60 μg·mL-1)和氨基酸(30 μmol·L-1)的半固體培養基中。取10 μL菌懸液滴加到濾紙片上,每個處理重復3次, 37℃培養12 h后用十字交叉法測量趨化圈直徑,測量3次求平均值。

1.2.6 根系分泌物及其氨基酸對菌株QHZ3的趨化作用定量分析 定量分析參考Ling等[24]的方法:按1.2.5小節的方法培養QHZ3至OD600=1.0,4℃、5 000 r·min-1離心5 min后重懸于等體積的趨化緩沖液中,將吸取了100 μL根系分泌物(60、120、240 μg·mL-1)和氨基酸 (10、25、50、75、100 μmol·L-1)的1 mL無菌注射器針頭插入吸取了100 μL菌懸液的槍頭細口端,針頭朝上,置于超凈工作臺中2 h后,對注射器中的溶液進行稀釋涂布,稀釋倍數為103,涂布體積為100 μL,37℃培養24 h后,計算移動的細菌數及趨化性指數,每個處理3次重復。

每毫升待測組分中的細菌數=C÷V×M

式中,C代表平均菌落數,V代表涂布體積(mL),M代表稀釋倍數。

趨化性指數(RCI)=處理菌落數÷對照菌落數

當RCI≥2時代表處理的趨化作用與對照相比差異顯著。

1.2.7 菌株QHZ3生物膜的形成過程 生物膜的形成過程參考曹啟航等[32]的方法:按1.2.5小節的方法培養QHZ3至OD600=0.2,稀釋100倍后吸取12 mL加入放有無菌載玻片的無菌培養皿中,置于37℃培養6、12、24、36、48、72 h后,取出載玻片用無菌生理鹽水沖洗3次,甲醇固定30 min后,用無菌生理鹽水沖洗3次,再用0.1%結晶紫染色30 min后,用無菌生理鹽水沖洗4次,室溫晾干后置于光學顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.8 根系分泌物及其氨基酸對菌株QHZ3生物膜形成的影響 將根系分泌物和氨基酸加入到1.2.7稀釋后的菌懸液中,渦旋混勻后分裝至96孔細胞培養板中,每孔200 μL,每個處理8個重復,37℃培養24 h后將培養基吸出,用250 μL無菌生理鹽水沖洗3次以清除尚未形成的生物膜,室溫干燥后,加入200 μL 0.1%結晶紫溶液染色30 min,然后用200 μL無菌生理鹽水沖洗4次以去除未結合的結晶紫,室溫干燥后,加入200 μL 95%乙醇溶液脫色后稀釋40倍,用酶標儀測定光吸收值(OD562)。

1.3 數據統計與分析

試驗數據采用Excel 2010進行試驗數據統計分析,Origin 2019制圖,SPSS 24進行方差分析和差異顯著性檢驗,顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯不同生育時期根系分泌物的鑒定

馬鈴薯苗期、現蕾期及盛花期根系分泌物總離子質譜圖分別見圖1、圖2及圖3,通過計算機檢索系統對總離子質譜圖進行搜索得到馬鈴薯不同生育時期根系分泌物的主要組分(表1)。

表1 馬鈴薯不同生育時期根系分泌物的GC-MS分析結果Table 1 GC-MS analysis results of potato root exudates at different growth stages

圖1 馬鈴薯苗期根系分泌物總離子質譜圖Fig.1 Total ion mass chromatogram of potato root exudates at seedling stage

圖2 馬鈴薯現蕾期根系分泌物總離子質譜圖Fig.2 Total ion mass chromatogram of potato root exudates at squaring stage

圖3 馬鈴薯盛花期根系分泌物總離子質譜圖Fig.3 Total ion mass chromatogram of potato root exudates at anthesis stage

由表1可知,馬鈴薯的3個生育時期根系分泌物中所檢測出的物質可分為8個大類,即糖類、有機酸類、醇類、胺類、氨基酸類、酯類、酰胺類和脂肪酸類,但各個大類的物質數量及其相對含量在不同生育期之間有較大差異,苗期、現蕾期和盛花期根系分泌物中分別含有24種、31種和31種主要物質,3個生育時期均檢測出的物質共7種,分別是D-果糖、D-核糖、蔗糖、3,4-二羥基丁酸、甘油、甘露醇和肌醇,苗期和現蕾期的根系分泌物中有8種相同物質,相對含量分別占苗期和現蕾期根系分泌物總量的51.30%和39.81%;現蕾期與盛花期的根系分泌物中有18種相同物質,分別占現蕾期和盛花期根系分泌物總量的67.43%和55.58%;苗期與盛花期的根系分泌物中有10種相同物質,分別占苗期和盛花期根系分泌物總量的57.21%和33.46%。這些差異說明,在馬鈴薯的生長發育過程中,根系分泌物中的有些物質一直存在且不斷地累積,有些物質則發生轉化或降解,同時還有新物質陸續產生。

鑒定得到氨基酸類物質主要有5種,分別是脯氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸,苗期、現蕾期和盛花期根系分泌物中分別有2種、3種和2種,相對含量分別占相應時期根系分泌物總量的0.35%、0.42%和0.96%。雖然氨基酸類物質種類及所占比例較少,但王玉雙等[33]、馮海超[34]、Yao等[35]、沈怡斐等[26]、Liu等[28]的研究發現其能影響促生菌趨化成膜,因此針對氨基酸組分進行研究。

2.2 根系分泌物及氨基酸對菌株QHZ3趨化性的影響

2.2.1 不同生育時期根系分泌物對菌株QHZ3趨化作用的定性分析 測定不同生育時期根系分泌物對菌株QHZ3的趨化性,結果如圖4所示。與對照組相比,苗期、現蕾期和盛花期根系分泌物均對菌株QHZ3有顯著趨化性,其趨化圈直徑分別是4.33、4.93 cm和5.43 cm,分別相當于對照(3.48 cm)的1.24、1.42倍和1.56倍,以現蕾期和盛花期的趨化作用最為顯著,說明隨著生育進程的推進,馬鈴薯生物量變大的同時對菌株QHZ3產生趨化作用的物質也隨之增加。

注:不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05),下同。Note: Different letters indicate significant differences among treatments (P<0.05), the same below.圖4 不同生育時期根系分泌物對QHZ3趨化性的影響Fig.4 Effects of root exudates at different growth stages on chemotaxis of QHZ3

2.2.2 氨基酸對菌株QHZ3趨化作用的定性分析 由圖5可知,與對照相比,除脯氨酸外,其他氨基酸對菌株QHZ3趨化性均有顯著影響,其中影響最大的是甘氨酸,趨化圈直徑為6.40 cm,是對照(3.48 cm)的1.84倍;其次是天冬氨酸(5.70 cm)、苯丙氨酸(5.35 cm)和酪氨酸(5.07 cm),分別是對照的1.64、1.54倍和1.45倍。

圖5 氨基酸對菌株QHZ3趨化性的影響Fig.5 Effects of amino acids on chemotaxis of QHZ3

2.2.3 不同濃度根系分泌物對菌株QHZ3趨化作用的定量分析 不同濃度根系分泌物對菌株QHZ3的趨化作用如圖6所示:根系分泌物對菌株QHZ3均有正趨化作用,且隨著根系分泌物濃度的增加,對QHZ3的趨化作用越強,其中240 μg·mL-1的現蕾期和盛花期根系分泌物趨化性指數最大,毛細管中細菌數量均達到對照組的2.8倍。

注:數字代表趨化性指數,下同。Note: Figures represent chemotaxis index, the same below.圖6 不同濃度根系分泌物對QHZ3的趨化作用Fig.6 Chemotactic of root exudates on QHZ3 with different concentrations

2.2.4 氨基酸對菌株QHZ3趨化作用的定量分析 氨基酸對菌株QHZ3的趨化作用如圖7所示:各濃度氨基酸對菌株QHZ3均有趨化性作用,但趨化程度不同,趨化性指數(RCI)大于2的氨基酸為甘氨酸(10～50 μmol·L-1)、天冬氨酸(50～75 μmol·L-1)和苯丙氨酸(25～50 μmol·L-1),即在該濃度下的氨基酸對菌株QHZ3有顯著的正趨化作用,其中以25 μmol·L-1的甘氨酸趨化性指數最大,毛細管中細菌數量達到5.13×105CFU·mL-1,是對照組(1.53×105CFU·mL-1)的3.3倍,而脯氨酸和酪氨酸所有濃度下的趨化性指數均小于2,說明脯氨酸和酪氨酸對菌株QHZ3沒有顯著趨化作用。

圖7 不同濃度氨基酸對QHZ3的趨化作用(定量)Fig.7 Chemotaxis of QHZ3 by amino acids with different concentrations (Quantitative)

從圖7也可以看出,隨著各氨基酸濃度升高,除酪氨酸的RCI變化呈下降趨勢外,其他氨基酸的RCI變化均呈先上升后下降的趨勢。

2.3 馬鈴薯不同生育時期根系分泌物及氨基酸組分對菌株QHZ3生物膜形成的影響

2.3.1 菌株QHZ3生物膜的形成過程 QHZ3生物膜的形成過程如圖8所示。整體來看,菌株QHZ3生物膜隨著培養時間的增加呈現增加趨勢。培養6 h后,有少量細菌粘附在載玻片上,空白區域占整個視野的80%左右;培養12 h后,粘附在載破片上的細菌數量明顯增多,且形成微菌落,空白區域占整個視野的50%左右;培養24 h后,微菌落聚集形成菌落,呈片狀結構,空白區域明顯減少;培養36 h后,菌落鋪滿整個視野且具有一定厚度;培養48 h后,菌落間相互疊加,形成團狀結構;培養72 h后,團狀結構聚集變厚,形成致密的生物膜。

圖8 不同培養時間菌株QHZ3生物膜的形成能力Fig.8 Biofilm formation capacity of strain QHZ3 at different culture time

2.3.2 不同濃度根系分泌物對菌株QHZ3生物膜形成的影響 不同濃度根系分泌物對菌株QHZ3生物膜形成的影響結果如圖9所示。馬鈴薯根系分泌物可明顯促進菌株QHZ3生物膜形成,與未添加根系分泌物相比,苗期各濃度與對照組間差異不顯著;現蕾期和盛花期,根系分泌物濃度為120 μg·mL-1和240 μg·mL-1時可顯著促進菌株QHZ3生物膜的形成。

圖9 不同濃度根系分泌物對各生育期QHZ3生物膜形成的影響Fig.9 Effects of different concentrations of root exudates on QHZ3 biofilm formation at different growth stage

2.3.3 不同濃度氨基酸對菌株QHZ3生物膜形成的影響 如圖10所示,各濃度的氨基酸對菌株QHZ3生物膜形成的影響各不相同。其中甘氨酸(25～100 μmol·L-1)、脯氨酸(75～100 μmol·L-1)和苯丙氨酸(25～100 μmol·L-1)可以顯著促進菌株QHZ3生物膜的形成,而酪氨酸和天冬氨酸則對QHZ3的生物膜形成影響不顯著。

圖10 不同濃度氨基酸對QHZ3生物膜形成的影響Fig.10 Effects of different concentrations of amino acids on QHZ3 biofilm formation

從圖10可知,隨著各氨基酸濃度的升高,甘氨酸和苯丙氨酸對菌株QHZ3生物膜形成的影響效果呈先上升后下降的趨勢,脯氨酸和天冬氨酸呈上升趨勢,而酪氨酸呈現下降趨勢。

3 討 論

根系分泌物能夠聯系植物與根際土壤微生物且可以為根際微生物提供生存和繁衍所需的營養和能源物質,并可作為信號物質吸引特異微生物從而促進根際有益微生物的定殖[36]。已有研究表明,根系分泌物中可作為信號物質來介導根系與微生物間的互作關系[26]。陳蘭蘭[27]通過研究發現,酚酸和有機酸能促進萎縮芽孢桿菌QHZ3定殖。趙大君等[37]研究發現鳳眼蓮根系分泌物中的氨基酸可以誘導腸桿菌屬F2的趨化性。本研究通過氣質聯用從不同生育時期馬鈴薯的根系分泌物中鑒定出的物質主要有糖類、有機酸類、醇類、胺類、氨基酸類、酯類、酰胺類和脂肪酸類等,其中包括5種氨基酸,分別是甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、酪氨酸。

半固體平板法的趨化圈大小和深淺可以反映趨化物對菌株的趨化能力。本研究發現除脯氨酸外,其他4種氨基酸均能使QHZ3形成明顯的趨化圈,同時也發現,3個生育時期根系分泌物對QHZ3有顯著正趨化作用。胡小加等[38]研究發現天冬氨酸對枯草芽孢桿菌Tu-100具有顯著正趨化作用,沈怡斐等[26]研究發現多黏類芽孢桿菌SQR-21對甘氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸具有強烈的正趨化作用,本試驗結果與其一致。

類毛細管試驗發現趨化物對細菌的作用往往存在一個最適濃度范圍,高于或低于該濃度都表現出相對較弱的正趨化作用[26]。本試驗發現除脯氨酸和酪氨酸外,其他3種氨基酸(甘氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸)均對菌株QHZ3具有明顯趨化性,且當其處于中濃度(25～75 μmol·L-1)時,菌株QHZ3趨化能力均強于低、高濃度,同時,根系分泌物(120 μg·mL-1和240 μg·mL-1)也對菌株QHZ3具有明顯趨化性,這與Mesibov等[39]研究大腸桿菌對氨基酸的趨化性時得到的結果相同,說明菌株對某些氨基酸的趨化依賴于濃度梯度,濃度過大或過小都可能對菌株的趨化作用產生抑制。

生防細菌在植物根際的定殖能力與其生防效果相關,并且生防細菌根際定殖能力與其生物膜形成相關[40]。本試驗觀察得到不同生育時期根系分泌物及氨基酸對菌株QHZ3的生物膜形成的影響不同,研究發現根系分泌物和氨基酸均可促進菌株QHZ3 生物膜形成,尤其是現蕾期和盛花期(120 μg·mL-1和240 μg·mL-1)根系分泌物、甘氨酸(25～100 μmol·L-1)、脯氨酸(75～100 μmol·L-1)和苯丙氨酸(25～100μmol·L-1)可顯著促進菌株QHZ3生物膜的形成。Goh等[41]發現添加適宜濃度的L-脯氨酸和賴氨酸能夠顯著提高大腸桿菌BL21菌株的生物膜形成能力。趙衛松等[42]發現L-脯氨酸可顯著促進枯草芽胞桿菌NCD-2菌株生物膜形成。Price[43]研究發現,加入脯氨酸能顯著提高氣單胞菌屬細菌的生物膜形成。從以上研究結果可知,菌株生物膜形成能力可能與外源添加劑種類和濃度及菌株的種類有關,濃度過大或過小時,可能會抑制生物膜的形成。

4 結 論

1)從不同生育時期馬鈴薯的根系分泌物中鑒定出的物質有8類,即糖類、有機酸類、醇類、胺類、氨基酸類、酯類、酰胺類和脂肪酸類等,其中氨基酸類物質有5種,分別是甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、酪氨酸。

2)馬鈴薯不同生育時期根系分泌物對菌株QHZ3的趨化成膜均有顯著影響,尤其添加現蕾期及盛花期根系分泌物作用顯著,且促生效果隨著根系分泌物濃度增大而明顯加強。

3)5種氨基酸對菌株QHZ3趨化成膜的作用程度不同,其中天冬氨酸和酪氨酸對菌株QHZ3具有顯著正趨化作用,脯氨酸能顯著影響菌株QHZ3生物膜的形成,而甘氨酸和苯丙氨酸則能顯著影響菌株QHZ3的趨化成膜。