一種分離自茶卡鹽湖的鹽單胞菌Halomonas chakariensis strain CH40T的新種鑒定※

崔甜琦,張田田,唐超群,朱德銳,邢江娃

(青海大學醫學部,基礎醫學研究中心,西寧 810001)

青藏高原鹽湖蘊含著獨特的鹽湖嗜鹽微生物資源[1]。這些嗜鹽微生物為適應高鹽環境,能夠調節胞內酶活性并產生特殊的生物活性物質,具有廣泛的生物醫藥應用價值[1,2]。課題組從青藏高原茶卡鹽湖(海拔3017 m,總礦化度322.4 g/L,pH 6.8)[3,4]的水樣和底泥混合物中分離到一株中度嗜鹽菌CH40T,現做相關鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

菌株CH40T采自青海茶卡鹽湖。

1.1.2 儀器及試劑

電子天平[PL203,梅特勒托利多儀器(上海)有限公司],恒溫振蕩培養箱(ZQTY-90S,上海知楚儀器有限公司),生化培養箱(SPX-380,寧波普朗特儀器有限公司),分光光度計(SP-754,上海光譜儀器有限公司),高速冷凍離心機(3k15,德國希格瑪離心機有限公司),Illumina Hiseq、PacBio RS II單分子實時(SMRT)全基因組測序平臺(上海美吉生物技術有限公司)。

細菌微量生化鑒定管(青島高科技工業園海博生物技術有限公司),API ZYM(法國生物梅里埃公司),API 50CH(法國生物梅里埃公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化方法

取100 μL水樣直接涂布在RM固體培養基[酵母培養基2.0 g,檸檬酸鈉3.0 g,MgSO4·7H2O 20.0 g,氯化鉀2.0 g,無水氯化鈣0.2 g,蛋白胨10.0 g,葡萄糖7.0 g,NaCl 10%(w/v),瓊脂16.0 g,加水定容至1 L,pH 7.5]上,置培養箱(37℃)中培養18～24 h后觀察菌株形態。挑取形態一致的單個菌落在固體平板上重復劃線(至少三次),獲得純化的單一菌株。采用RM液體培養基擴大培養后保存于-80℃冰箱中(菌液含15%甘油)。

1.2.2 16S rRNA基因的擴增及序列分析方法

提取基因組DNA,采用通用引物27F(5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對16S rRNA基因進行PCR擴增和測序,最后將得到的16S rRNA基因序列提交到NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),并與EzBioCloud數據庫(https://www.EzBioCloud.net)[5-7]數據進行BLAST比對,通過多位點序列分析推斷菌株CH40T的系統發育關系。使用MEGA7軟件[8]采用鄰域連接法[9]構建系統發育樹,bootstrap值為1 000[10]。

1.2.3 菌株形態特征觀察方法

在RM培養基上培養(35℃)48 h,使用光學顯微鏡以及掃描電鏡觀察菌株的細胞形態和顏色,挑取單個菌落進行革蘭氏染色觀察,再利用KOH裂解試驗驗證染色結果。在RM半固體培養基上通過穿刺接種菌株,然后通過觀察擴散生長現象判斷其運動性。通過堿性復紅法對鞭毛染色,判斷是否存在鞭毛。

1.2.4 菌株生理生化特征測定方法

1.2.4.1 菌株需氧性測試

將CH40T接種在RM瓊脂平板上,置厭氧培養箱(37℃)中觀察第3、7、21天時的菌株生長情況。

1.2.4.2 菌株對鹽度、溫度及酸堿度的耐受性試驗

以3% NaCl的RM液體培養基為基礎培養基,測定菌株在不同溫度(4、10、25、30、35、37、40、45、50℃)下的生長情況。保持培養溫度(37℃)不變,在RM液體培養基中檢測不同NaCl濃度[(0～21)%,w/v]和pH值(4.0～13.0)對菌株生長的影響。采用分光光度計在600 nm波長下檢測菌液的吸光度值。

1.2.4.3 生理生化特征測定

使用細菌微量生化鑒定管進行以下生理生化特征的測定:氧化酶試驗;過氧化氫酶試驗;明膠液化試驗;七葉苷、淀粉的水解試驗;吲哚試驗;β-半乳糖苷酶試驗;甲基紅試驗;硫化氫試驗;硝酸鹽還原試驗;苯丙氨酸脫氨酶、尿素酶的活性測定試驗以及Voges-Proskauer(V-P)試驗。

使用酪蛋白瓊脂培養基進行酪蛋白水解試驗。

使用API ZYM鑒定酯酶、蛋白酶等酶的活性,使用API 50CH測試碳源的利用情況。

將CH40T點接在吐溫80為1%體積分數的固體培養基(蛋白胨10.0 g,NaCl 50.0 g,CaCl20.1 g,瓊脂16.0 g,加水定容至1 L)上,培養(35℃)7 d,觀察菌株周圍有無暈圈產生。

1.2.5 脂肪酸分析及呼吸醌測定方法

將菌株送中國科學院微生物研究所進行脂肪酸分析、呼吸醌測定。

脂肪酸分析:將在RM固體培養基上培養(30℃)3 d的菌苔進行皂化,萃取皂化后的物質,使用MIDI系統分析萃取物質中的脂肪酸的類型。

呼吸醌測定:取150 mg凍干的菌體,加入40 mL的混合液(氯仿:甲醇=2:1)進行抽提,置于黑暗處,用磁力攪拌器攪拌約10 h,過濾,將濾液減壓蒸干(40℃～45℃),再加入1～2 mL混合溶液(氯仿:甲醇=2:1)溶解,然后在GF254硅膠板上點樣,以混合溶液[己烷:乙醚=34:6(V/V)]為展層劑進行分離,最后在紫外燈(254 nm)下將Rf=0.3～0.4的熒光帶刮下重新溶解在氯仿中進行抽濾并收集濾液,利用高效液相色譜儀分析細胞醌類型。

1.2.6 全基因組測序與分析方法

基因組測序委托上海美吉生物技術有限公司完成。全基因組序列由PacBio、Illumina reads[使用Unicycler軟件(版本v0.4.7)]組裝。利用Glimmer、Prodigal軟件對基因組中的編碼序列(CDS)進行預測。利用tRNAscan-SE v2.0軟件和Barrnap軟件分別對基因組中的tRNA、rRNA進行預測。并與COG[11]數據庫比對,獲得各編碼序列的COG功能注釋信息。

通過NCBI獲取可利用的相近物種全基因組序列,使用ChunLab在線計算器[12]計算與最近鄰菌株的平均核苷酸同一性(ANI)參數,使用基因組到基因組距離計算器(GGDC 2.1)[13]計算DNA-DNA雜交(dDDH)值,判斷CH40T是否為新種。

基因組中的16S rRNA和gyrB、rpoD基因連接序列采用clustal_x軟件包[14],通過與相關菌株進行多重比對構建系統發育樹,確定CH40T的系統發育地位。

2 結果

2.1 16S rRNA系統發育分析情況

測定菌株CH40T幾乎完整的16S rRNA序列(1 528 bp),與GenBank、EzBioCloud數據庫中相似的16S rRNA基因序列進行比對,構建系統發育樹(圖1),表明菌株CH40T屬于鹽單胞菌屬(Halomonas)。與CH40T序列同源性最高的是H.azericaTBZ9T(99.06%),其次是H.aquamarinaS6-07T(98.73%)、H.bluephagenesisTD01T(98.17%)、H.venustaMA-ZP17-13T(97.91%)、H.ventosaeNRS2HaP1T(97.85%)和H.titanicaeGPM3T(97.85%)。CH40T與鹽單胞菌屬模式菌株H.elongataATCC 33173T的相似性僅有91.92%。

2.2 形態學特征

在RM培養基上的CH40T菌落呈乳白色,直徑約1～2 mm,圓形,表面光滑濕潤,邊緣完整。細胞形狀呈桿狀,有周生鞭毛(圖2),能運動。革蘭氏染色呈陰性。

圖2 細胞形態圖(左)和鞭毛染色圖(右)

2.3 生理生化特征

菌株CH40T為需氧菌,在溫度為10℃～40℃時可生存,適合生長溫度為30℃～37℃(圖3)?？缮娴乃釅A度范圍為6.0～10.0,其中酸堿度范圍為11.0 ～13.0時因為堿性較高使溶液顏色加深,所以出現較高的吸光度值,但并無細菌生長,當酸堿度為7.0時,生長最快(圖4)。鹽度生長范圍為1%～20%(w/v),最適鹽度為2%～7%(w/v)(圖5)。

圖3 CH40T的適合生長溫度

圖5 CH40T的鹽度生長范圍

細菌微量生化鑒定管結果顯示,氧化酶和過氧化氫酶試驗、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗、淀粉水解試驗、尿素酶試驗和V-P試驗等結果均為陽性,其余生化試驗結果均為陰性。吐溫80試驗結果為陽性,酪蛋白水解試驗結果為陰性。API ZYM結果顯示,堿性磷酸酶、酯酶(C4)、類脂酯酶(C8)、亮氨酸芳胺酶、纈氨酸芳胺酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α-葡萄糖苷酶為陽性之外其余均為陰性。API 50CH結果顯示,D-果糖、D-葡萄糖,D-木糖為可利用碳源,L-阿拉伯糖和D-甘露糖為不能被利用碳源。與鹽單胞菌屬相近菌株比較發現,CH40T的生存特性與H.azericaTBZ9T相似,而水解特性與碳源利用情況則分別接近于H.meridianaDSM 5425T和H.titanicaeBH1T(表1)。

表1 菌株CH40T與鹽單胞菌屬相近菌株的生理生化差異特征對照表

2.4 主要脂肪酸及呼吸醌

CH40T的主要的呼吸醌為CoQ-9。主要脂肪酸成分為C18:1w7c(46.07%),C16:0(17.87%),C16:1w7c/16:1w6c(20.47%),C12:03OH(6.52%)。

2.5 全基因組分析情況

菌株CH40T全基因組大小為3.76 Mbp(圖6),DNA G+C的含量為55.7%,共預測到3 375個CDS和79個RNA基因,后者共包括61個tRNA和18個rRNA基因(表2)?；蜃⑨尡砻靼被徂D運與代謝(E),復制、重組和修復(L)及信號轉導機制(T)是最豐富的COG,分別占8.84%、6.47%和6.40%。

表2 測序平臺及全基因組分析情況

最外面一圈為基因組大小的標識,向里依次為正負鏈上的CDS、rRNA和tRNA、GC含量及GC-Skew值

為了確定菌株CH40T的物種分類學地位,我們通過NCBI獲取可利用的相近物種全基因組序列,測定了與最近鄰菌株的ANI、dDDH值。菌株CH40T與H.azericaTBZ9T、H.bluephagenesisTD01T、H.titanicaeGPM3T、H.ventosaeNRS2HaP1T、H.venustaMA-ZP17-13T的ANI值依次為94.63%、74.01%、74.36%、74.07%和73.48%,dDDH值依次為57.80%、20.80%、21.10%、21.10%和20.90%(表3),均低于ANI 95%和dDDH 70%的標準閾值[18,19]。上述結果表明菌株CH40T是鹽單胞菌屬中的一個新物種。

表3 菌株CH40T和與其近鄰菌株的ANI、dDDH值

其他標記基因如gyrB(DNA gyrase B subunit)、rpoD(RNA polymerase sigma factor)被認為是能夠高度區分Halomonas物種的工具[20]。本研究從CH40T的基因組測序中獲得了gyrB(2421 bp)、rpoD(1851 bp),利用EzBioCloud服務器分析gyrB、rpoD的序列相似性,利用GenBank數據庫檢索gyrB和rpoD的相似序列,然后進行系統發育分析。相比于16S rRNA基因序列,CH40T與鄰近株gyrB和rpoD基因序列的相似性較低,分別為72.39%～80.41%和78.78%～85.18%?；?6S rRNA和gyrB、rpoD基因序列的鄰域連接樹顯示,CH40T聚集在鹽單胞菌屬內(圖7)。

圖7 基于16S rRNA、gyrB和rpoD基因序列的鄰域連接樹

3 討論

近年來,國內外均有一些新種鹽單胞菌被發現,發現者對菌株做了詳盡的種屬鑒定和生理生化特征研究[21,22]。鹽單胞菌屬是鹽單胞菌科的最大屬[23],最早由Vreeland等描述[24],目前發表確認的物種有117個(http://www.bacterio.net/halomonas.html)。鹽單胞菌在鹽場、鹽湖以及鹽堿地等特殊的極端鹽環境中分布較多[25],作用廣泛,可做各種生物技術應用[26],如污水和土壤的改良[27]、四氫嘧啶等次級代謝產物的合成[28]、生物酶的利用[29]和可降解生物塑料的產生[30]等,近年來受到越來越多的關注。

本研究從青海茶卡鹽湖的水樣和底泥混合物中分離到一株中度嗜鹽菌CH40T,根據16S rRNA基因序列相似性比對、生理生化特性測定、全基因組測序、系統發育分析和ANI、dDDH分析等實驗認定,CH40T為鹽單胞菌屬的一個新種,命名為茶卡鹽單胞菌(Halomonaschakariensis)。CH40T可以耐受較寬的鹽濃度范圍,且其生長對鹽具有依賴性。CH40T具有產淀粉酶、尿素酶、酯酶等功能酶的能力,這些酶作為嗜鹽酶,相比于普通酶類,在高鹽環境中具有更好的穩定性和活性[31],具有重要的研究和應用價值。與此同時,CH40T作為中度嗜鹽菌,在應對鹽脅迫時,其調控機制復雜,很可能伴隨著各種相容性溶質的產生,如四氫嘧啶、甜菜堿、氨基酸等[32],具有廣闊的應用前景。因此,在后續的研究中,可對CH40T的功能酶、鹽境適應機制以及溶質合成等方面進行深入研究,挖掘其潛在的應用價值。