孕期慢性不可預知溫和應激致產后抑郁的實驗模型驗證

金素慧， 李泓諭， 李佳琪， 王 瑞， 劉紅婭， 關素珍

（1.同心縣人民醫院，同心 751300； 2.寧夏醫科大學公共衛生學院，銀川 750004； 3.寧夏環境因素與慢性病控制重點實驗室，銀川 750004）

隨著生活節奏的加快，女性在妊娠階段，既面臨著孕期及產后心理狀態的改變，又需應對此階段諸多因素作為應激源帶來的壓力，孕期女性常處于較高程度的壓力狀態，而經歷負面生活事件的產婦患產后抑郁癥（postpartum depression，PPD）的可能性更大。PPD 是產后出現過分焦慮、悲傷、絕望、快感喪失等情緒，甚至可能出現自殺或殺嬰的行為，是一種常見的產褥期精神障礙性疾病，國內發病率為13.1%～16.3%[1]。研究[2]表明，孕期壓力事件是PPD 的重要危險因素。一般在產后2 周內多發，產后4～6 周癥狀明顯，于產后6 個月開始癥狀逐漸緩解，約2/3 患者可于1年內康復，若再次妊娠，其復發率高達50%[3]。PPD 不僅對產婦的身心健康有著巨大影響，還可能對嬰兒情感和認知發育造成損傷[4]。但目前關于PPD 的診斷多以問卷調查為主，缺少生物學診斷標志物，導致其難以被及時發現和治療，故尋找可能的生物學標志物以了解致病機制尤為重要，而在實驗機制的相關研究中更多的產后抑郁模型是以激素誘導法及長期母嬰分離應激模型為主[5]，這些因素更多的是考慮產后環境及激素水平的改變，并未涵蓋PPD 與孕期諸多因素影響的相關性。本研究將模擬孕婦在妊娠期經受的社會心理因素影響來建立產后抑郁模型，進而為后期從圍產期出發研究產后抑郁發生的原因及機制提供科學依據。

1 對象與方法

1.1 實驗動物與分組

健康成年SD 大鼠購自寧夏醫科大學實驗動物中心，合格證編號：SYXK（寧）2020-0001。其中雌鼠32 只，體質量（240±20）g；雄鼠16 只，體質量（300±20）g。經寧夏醫科大學實驗動物中心實驗動物福利倫理委員會審核（IACUC-NYLAC-2021-121）。適應性飼養1 周后，將32 只雌鼠隨機分為對照組和模型組，每組16 只；將16 只雄鼠隨機分為對照交配組8 只和模型交配組8 只。其中雌鼠單籠飼養，雄鼠每籠2 只飼養。

1.2 實驗主要儀器及試劑

1.2.1 主要設備與儀器 電子天平［梅特勒托利多科技（中國）有限公司］；高速冷凍離心機（德國Thermo Fisher 公司）；-80 ℃超低溫冰箱（美國Thermo 生物技術有限公司）；超純水制備機（力康生物醫療科技控股有限公司）；VICTOR NivoTMMultimode Plate Reader［珀金埃爾默企業管理（上海）有限公司］。

1.2.2 實驗試劑 大鼠皮質酮/腎上腺酮（CORT）ELISA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；大鼠雌二醇（estradiol，E2）ELISA 試劑盒（上海酶免生物科技有限公司）；蔗糖分析純（天津市大茂化學試劑廠）。

1.3 建立孕期慢性不可預知溫和應激模型

選擇慢性不可預知溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）建立動物模型[6]。應激方式包括：禁食禁水12 h；擁擠環境24 h（8 只合籠），籠具傾斜30° 24 h；潮濕環境24 h（濕度60%～70%）；冰水游泳5 min；30 min 搖晃（1 次/s）；行為束縛2 h；熱應激5 min（42 ℃）；夾尾（距尾尖1 cm 處）2 min。模型周期為21 d，每天隨機安排應激方式，保證7 d 內不出現相同的應激方式。交配過程：在應激第3 天（17：00），對照組模型組分別與對照交配組和模型交配組1∶2 合籠飼養，第2 天早晨檢查雌鼠陰道涂片確定妊娠后，將雌雄分籠，雌鼠繼續單籠飼養，雄鼠每籠2只飼養。

1.4 血漿皮質酮水平測定

孕期不同時間點尾靜脈取血，采用ELISA 試劑盒，按說明書對血漿皮質酮水平進行檢測，酶標儀在450 nm 波長處測量各孔的光密度（OD）值。

1.5 產后抑郁情緒測定

分別于產后1 周、3 周進行以下實驗測定。

1.5.1 蔗糖偏好實驗 通過動物甜味溶液的攝入量占總液體量的比重，評價抑郁情緒。實驗開始前進行適應性訓練，取兩個相同的飲用瓶，其中一個放入1%蔗糖溶液，另一個放入純水，同時將兩瓶水放入籠中，訓練24 h。訓練結束后，動物禁食禁水24 h，開始正式實驗。分別記錄1 h 內純水消耗量，1%糖水消耗量、液體總消耗量。計算1%蔗糖偏好百分比（1%糖水消耗量/液體總消耗量×100%）。

1.5.2 曠場實驗 通過動物在不熟悉環境下的探索行為，評估動物的焦慮及緊張程度。曠場實驗箱采用100 cm×100 cm×50 cm 的無蓋敞箱，底部用記號筆畫出25 個4 cm×4 cm 的小格。實驗前1 天將動物飼養于曠場實驗室內熟悉環境。將動物放入曠場中央，讓其在敞箱內自主活動5 min，分別記錄其在外周和中心運動的時長。每只動物測試結束后，清理曠場內的糞便，噴灑75%乙醇去除動物留下的氣味。

1.5.3 懸尾實驗 通過動物放棄掙扎的靜止狀態，評價抑郁情緒。將實驗動物尾部固定懸掛于懸尾實驗箱上，使其頭部向下并與實驗臺保持約20 cm 的距離，記錄其5 min 內靜止時間。

1.5.4 強迫游泳實驗 使用直徑20 cm、高度40 cm 的圓柱形透明裝置，加入22 ℃左右的水，保持水面高度為25 cm，將大鼠放入水中，記錄其5 min 內靜止時間。通過動物在水中的不動狀態，評價抑郁情緒。

1.6 E2 水平測定

在應激第21 天、產后1 周、產后3 周尾靜脈采血，分離血清，利用E2ELISA 試劑盒進行測定。酶標儀450 nm 波長測量各孔吸光度值，實驗重復3 次。

1.7 統計學方法

數據使用SPSS 24.0 軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，同一指標不同時點比較用重復測量方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 孕期應激刺激對血漿皮質酮水平的影響

應激第7 天、21 天模型組雌鼠血漿皮質酮水平高于同時點對照組，差異均有統計學意義（P 均＜0.05），表明孕期雌鼠處于慢性應激狀態，見表1。

表1 孕期應激對雌鼠血漿皮質酮水平的影響（±s，ng·mL-1）

表1 孕期應激對雌鼠血漿皮質酮水平的影響（±s，ng·mL-1）

組別n應激前1 天應激第7 天應激第14 天應激第21 天對照組81.68±0.941.34±0.241.58±0.231.90±0.22模型組81.54±0.732.00±0.262.39±1.092.38±0.21 F 值0.07118.0652.60212.264 P 值0.7960.0030.1450.008

2.2 孕期應激對雌鼠產后情緒的影響

2.2.1 孕期應激對產后雌鼠曠場實驗各指標的影響 與對照組相比，模型組產后1 周外周運動時長延長、中心運動時長縮短（P 均＜0.05），但產后3 周兩組中心運動時間、外周運動時間差異均無統計學意義（P 均＞0.05），見表2。

表2 孕期應激對雌鼠產后行為學各指標的影響（±s）

表2 孕期應激對雌鼠產后行為學各指標的影響（±s）

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2.2.2 孕期應激對產后雌鼠1%蔗糖偏好百分比的影響 產后1 周、3 周模型組1%蔗糖偏好百分比均低于對照組（P 均＜0.05），提示孕期應激會導致雌鼠產后出現快感消失的問題，見表2。

2.2.3 孕期應激對產后雌鼠懸尾實驗指標的影響 模型組產后1 周、產后3 周的靜止時間均高于對照組（P 均＜0.05），見表2。

2.2.4 孕期應激對產后雌鼠強迫游泳實驗各指標的影響 產后1 周模型組靜止時間長于對照組（P＜0.05）。在產后3 周，模型組靜止時間與對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

2.3 孕期應激致產后E2 水平變化

經重復測量方差分析，組間比較發現模型組與對照組E2水平存在差異（F=6.273，P＜0.05），產后對照組和模型組E2水平均下降，且模型組產后1 周和產后3 周E2水平均低于對照組（P 均＜0.05）。提示孕期應激使產后雌鼠E2水平迅速降低，見表3。

表3 孕期應激對雌鼠E2 水平變化的影響（±s，pmol·L-1）

表3 孕期應激對雌鼠E2 水平變化的影響（±s，pmol·L-1）

組別n 應激第21 天產后第1 周第3 周對照組840.49±4.48 39.36±6.00 38.40±6.63模型組838.10±2.94 33.29±0.86 29.19±2.55 F 值1.1916.04310.071 P 值0.3010.0340.010

3 討論

PPD 的影響因素有很多，包括經濟、社會、遺傳、生理等多種因素[7-8]。孕期慢性不可預知溫和應激模型是Willner 通過改變動物生存環境（如禁食、禁水、潮濕墊料等）使動物長期處于應激狀態建立的經典抑郁模型，其建立原理是動物處于不適宜生存環境時會出現緊張、焦慮、抑郁等情緒，有研究[9]表明CUMS 會導致下丘腦-垂體－腎上腺（HPA）軸功能失調?？梢娫衅诼詰ひ钟裟Ｐ团c臨床PPD 患者的病因相似。PPD 的病程持續時間較長，可長達半年至1 年[10]，CUMS 可使動物的抑郁情緒持續時間較一般應激模型更長。此外CUMS 造模方法可靠、穩定、可操作性強，因此本研究選用慢性不可預知溫和應激建立PPD動物模型。

慢性壓力在抑郁癥的發病過程中發揮著重要作用，當機體產生長期的應激，就會導致HPA功能障礙，糖皮質激素是HPA 軸激活的標志，而皮質酮是糖皮質激素的主要成分[11-12]，因此血漿皮質酮常作為慢性應激模型建立成功的指標。本研究模型組雌鼠應激第7 天、應激第21 天血漿皮質酮水平高于對照組，表明雌鼠處于應激狀態，孕期慢性應激模型建立成功。在應激后期模型組雌鼠血漿皮質酮水平增長緩慢，可能與HPA軸對應激的適應有關。有研究[13]發現慢性應激開始時血漿皮質酮水平明顯升高，一段時間后升高速度變緩，與本研究結果相似。并且在不同的應激模型中均能發現皮質酮水平的升高，如急性應激[14]、慢性社交失敗應激模型[15]等，說明皮質酮在應激過程中發揮著重要作用。

行為學評價常用于評價PPD 動物模型，PPD的臨床表現為焦慮、快感喪失甚至出現自殺傾向。在以往的研究中多以產后1 周為觀察終點，但PPD 的病程時間可長達半年至1 年，因此本研究觀察了雌鼠產后1 周和產后3 周兩個時間點的行為學變化情況，并以產后3 周作為觀察終點。行為學中曠場實驗常被用來觀察動物的緊張、焦慮情緒[16]，本研究發現在產后1 周模型組大鼠中心運動時長低于對照組，外周運動時長高于對照組，模型組的探索行為減少，產生焦慮、緊張情緒。蔗糖偏好實驗用1%糖水消耗率來評價快感缺失程度，這一指標常常作為抑郁與否發生的標志[17]?？旄腥笔荘PD 的臨床表現之一，CUMS大鼠與之出現了相同的情緒損傷。懸尾實驗和強迫游泳實驗以靜止時間作為評價指標觀察動物的絕望情緒。有研究[18]已證實CUMS 會使大鼠產生絕望情緒，且持續時間較長，與本研究結果相似。本研究顯示，CUMS 會使產后大鼠產生焦慮、緊張、快感缺失、絕望等情緒，出現了與PPD 相似的臨床表現。

神經內分泌因素與PPD 發病密切相關，而性腺軸（HPG）是女性分泌性激素的重要神經內分泌調節體系。妊娠期女性性激素水平的明顯波動可引起情緒障礙，其機制主要與HPG 軸的反饋性調節有關。E2作為性激素的一種，其水平變化是目前較為公認的評價PPD 發生的指標。孕期E2水平波動較大，在孕晚期時可達到正常水平的40 倍，分娩后E2水平迅速下降[19]，導致產婦的情緒起伏大。有研究[20]表明PPD 患者的E2水平明顯低于健康產婦。而CUMS 會導致產后E2水平降低[21]，進一步加劇抑郁樣情緒的產生，能夠很好地解釋本研究結果。

從本研究中行為學實驗及血清中E2變化情況可見，孕期慢性不可預知溫和應激刺激可用來建立產后抑郁大鼠實驗模型，進而可為后期從圍產期出發研究產后抑郁發生原因及機制提供新方法。