基于FISH和SNP標記分析百農64對其衍生品種的遺傳貢獻

張金龍,閆林杰,贠艷鴿,李云香,介藝澤,陳向東,胡喜貴,周 鋒,郭冉冉,茹振鋼

(1.河南科技學院農學院/河南科技學院小麥中心/河南省雜交小麥重點實驗室, 河南新鄉453003;2.河南科技學院資源與環境學院,河南新鄉 453003)

骨干親本在農作物品種選育過程中發揮著重要的作用,自新中國成立到2000年止,我國大約一半的小麥(TriticumaestivumL.)品種是由16個骨干親本衍生出來的[1]。百農64因其高產、抗病、適應性廣,在黃淮麥區累計種植533萬hm2,成為黃淮麥區骨干親本之一,獲得了河南省科技進步二等獎。截止2021年,以百農64為親本,選育出的優良一代衍生品種達30多個,其中子一代衍生品種百農207累計種植面積約430萬hm2,獲得了河南省科技進步一等獎。

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)標記在各個物種中分布廣、易獲得且通量高,已越來越多的用于評價骨干親本對其衍生后代遺傳貢獻。Jiang等[2]利用小麥90K SNP芯片,解析寧麥9號對其17個衍生品種(系)的遺傳貢獻,結果表明,除楊輻麥4號外,16個衍生后代與寧麥9號遺傳相似系數均超過了0.7。李玉剛等[3]利用SSR和SNP標記分析魯麥14對其衍生品種青農2號的遺傳貢獻,SNP芯片結果顯示魯麥14與青農2號的一致性達72.55%,高于另一親本煙農15,且遺傳貢獻率大于50%的染色體有18對。白彥明等[4]利用660K SNP芯片分析了4份螞蚱麥、1份小白麥及其136份衍生品種(系)的遺傳多樣性,結果表明,在小麥三個基因組中,多態性最高的為B基因組,在7個同源群中,多態性位點數最多的是第3同源群,供試材料間遺傳多樣性較低,育種家應繼續努力豐富小麥遺傳資源。高 艷等[5]利用小麥55K SNP芯片,分析周麥22及其80個衍生品種(系)的遺傳多樣性,結果表明周麥22對其衍生后代的遺傳貢獻平均為0.658,且衍生系間遺傳多樣性存在差異。

近年來,已經開發了許多特異單鏈寡核苷酸(single strand oligonucleotide,SSON)探針,這種探針可由公司合成、分辨率高、成本低,通過一次熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)能夠清晰地區分小麥21對染色體[6-9]。杜海梅等[10]利用5個單鏈寡核苷酸探針,通過非變性熒光原位雜交(ND-FISH)技術,鑒定了小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系在9個綿麥37衍生品種中的遺傳傳遞情況,結果顯示其傳遞率為100%。Wu等[11]利用單鏈寡核苷酸探針套-熒光原位雜交技術(ONMP-FISH),分析了6個6VS/6AL易位系材料及其32個衍生后代品種(系),發現其中27個衍生后代含6VS/6AL易位系。Du等[6]開發了可以清晰地區分小麥21對染色體的SSON探針套,Huang等[8]對該探針套略作修改,利用FISH技術,在373份中國栽培小麥品種中鑒定出14種染色體結構變異,167種染色體多態(block)類型,表明SSON探針在小麥及其近緣物種染色體多樣性和結構變異鑒定研究中具有高效性。然而,目前分析骨干親本對其衍生品種遺傳貢獻的研究主要集中在農藝性狀、品質性狀和分子標記水平上,鮮有將SNP芯片和FISH技術相結合,同時從分子和染色體水平揭示骨干親本對其衍生后代遺傳貢獻的研究。

本研究旨在通過將FISH和小麥55K SNP芯片技術相結合,探討百農64對其衍生后代的遺傳貢獻,揭示生產上選育新品種過程中對染色體片段選擇的偏好性,以期為小麥遺傳研究和新品種選育過程中的親本選配提供理論支撐,輔助育種家選育出綜合性狀好的優良品種。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選用百農64(BN64)及其4個子一代衍生品種百農207(BN207)、百農160(BN160)、華育198(HY198)和04中36(04Z36),衍生品種的親本材料周麥11(ZM11)、周麥16(ZM16)、溫麥6號(WM6)共8份小麥材料為研究對象。百農207來源于雜交組合周麥16/百農64,而華育198是從其反交組合百農64/周麥16中選育而成;04中36來源于百農64/周麥11雜交組合;百農160來源于多抗893/溫麥6號//百農64/溫麥6號。所用試驗材料均由河南科技學院小麥中心提供。

1.2 根尖細胞有絲分裂中期染色體制片

小麥種子發根程序參照王丹蕊等[7],根尖分生區細胞用纖維素酶和果膠酶酶解,制成懸浮液滴于載玻片上,有絲分裂中期染色體制片程序參照Zhao等[12]和Komuro等[13]。

1.3 寡核苷酸探針和熒光原位雜交

本研究利用的SSON探針和序列參見Huang等[8],分別為TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine,紅色)修飾的pAs1-1、pAs1-3、pAs1-4、pAs1-6、AFA-3和AFA-4,FAM(6-carboxyfluorescein,綠色)修飾的pSc119.2-1和(GAA)10,共8個SSON探針。探針由南京擎科新業生物技術有限公司(TSINGKE biological technology,南京)合成。每張制片的探針用量和熒光原位雜交程序見Huang等[8]。

FISH分析后的根尖有絲分裂中期染色體制片在BX51(Olympus,日本)熒光顯微鏡下進行鏡檢,通過Coolcube 1攝像系統及Isis核型分析系統(MetaSystems,德國)等攝取染色體FISH核型高清圖像,并進行染色體排隊,利用Adobe Photoshop CS6對各個品種染色體FISH核型進行剪切和排列。每個試驗材料至少選取6粒種子的根尖細胞進行觀察,攝取6～12個染色體形態較好的分裂相,從中選取1個染色體完整且形態良好的分裂相進行核型排隊,少數試驗材料由于部分染色體重疊,選取了兩個分裂相進行染色體排隊。

1.4 DNA提取和芯片檢測

取各個品種幼葉,每個品種20株混合取樣,采用CTAB法[14]提取葉片基因組DNA,將濃度及純度達標的DNA用于SNP芯片標記檢測。利用中國農業科學院作物科學研究所小麥基因組與基因資源研究團隊開發的小麥55K SNP芯片,對供試小麥葉片全基因組DNA進行掃描,SNP芯片檢測在中玉金標記(北京)生物技術股份有限公司進行。

1.5 數據分析

SNP芯片數據初步過濾由公司完成,設置閾值DQC≥0.82 &&CR≥95進行SNP位點質控,獲得基因型原始數據。篩選閾值Best and Recommended=1 &Best Probeset=1 &Conversion Type=Poly High Resolution &call rate≥97的標記,得到初步過濾后的基因型數據;同時刪除沒有匹配到參考基因組物理位置或匹配到多個物理位置的SNP標記,初步獲得32 498個分布于小麥21條染色體上有特異位置的SNP位點。

利用Tassel V5.2.81軟件[15](http://www.maizegenetics.net/),去除最小等位基因頻率小于1%的SNP標記,共獲得23 323個多態性SNP標記用于后續分析。利用Tassel V5.2.81軟件,設置檢測窗口500 bp,步長100 bp,計算核苷酸多樣性指數(nucleotide diversity,Pi)。利用Power marker V3.0 軟件[16]計算SNP位點的多態性信息含量(polymorphic information content,PIC)、基因多樣性(gene diversity,D)、主要等位基因頻率(major allele frequency,MAF),同時計算供試材料之間Nei1983遺傳距離,基于該遺傳距離構建UPGMA聚類樹,使用MEGA V5.02繪制聚類樹。遺傳相似系數(genetic similarity,GS)采用NTSYSpc V2.10e 軟件計算。

2 結果與分析

2.1 百農64對其衍生后代染色體結構變異和多態性的影響

本研究構建了百農64、4個衍生品種及其親本的SSON探針FISH核型(圖1)。與Huang等[8]檢測到的小麥染色體結構變異相比,百農64含臂間倒位perInv6B(圖1箭頭所示),在其衍生品種中僅百農207檢測到了此結構變異,且百農207和華育198的6B染色體短臂端部紅色信號強,百農64與4個衍生后代間6B染色體FISH核型均有差異。除百農207之外,其他3個衍生品種都含有小麥-黑麥T1RS/1BL易位,且在親本材料周麥11和周麥16中均鑒定到了此易位系(圖1箭頭所示)。

綠色信號為FAM修飾的寡核苷酸探針pSc119.2-1和(GAA)10,紅色信號為TAMRA修飾的寡核苷酸探針pAs1-1、pAs1-3、pAs1-4、pAs1-6、AFA-3和AFA-4,背景為藍色(DAPI);箭頭所指分別為T1RS/1BL易位系和perInv6B染色體。

分析所研究材料的染色體多態性(圖2),共鑒定了48種多態類型(block),B基因組染色體block類型最多,為20種,其次是A基因組有18種,D基因組最少10種(圖2)。不同染色體間block類型也有差異,變異范圍為1～4;1A和6B染色體的block類型最多,有4種;3A、3D、5D、6D和7D最少,只有1種。其衍生后代中,5A染色體中僅百農160,5B染色體中僅華育198,1B、7A染色體中僅百農207與百農64染色體核型相似;1A染色體僅04中36,2D、4B、4D、7B染色體僅百農160,2A、6A染色體僅百農207與百農64不同;百農160和04中36的3B染色體與百農64不同。

探針顏色同圖1。

用“1”和“0”分別表示每個小麥品種21對染色體“是”和“否”為某一種染色體block類型,利用Power marker V3.0 軟件計算了供試材料間48種染色體block類型的MAF、D和PIC的值(表1),MAF變異范圍為0.500～1.000,平均值為0.797;D值變異范圍為0.000～0.500,平均值為0.289;PIC變異范圍在0.000～0.375 之間,平均值為0.237。

表1 供試材料間的遺傳差異參數比較Table 1 Comparison of genetic diversity parameters among the test varieties

2.2 供試材料多態性SNP位點分布及其多態性

利用Tassel V5.2.81軟件篩選后,共獲得均勻分布于小麥21條染色體上的23 323個多態性SNP標記用于后續分析。在每條染色體上多態性SNP分布變幅為429～1780,最少的是4D,最多的是2A,平均為1 110個(圖3a),不同染色體上SNP分布差異明顯。多態性SNP標記在7個染色體同源群中分布變幅為2 569(第6同源群)～3 950(第2同源群)個,按照SNP從多到少分布順序依次是2>5>7>3>1>4>6(圖3b)。在小麥三個基因組中,A和B基因組多態性SNP標記較多,分別為8 504和9 726個,D基因組最少,為5 093個(圖3c)。

基于23 323個多態性SNP位點,利用Tassel V5.2.81軟件計算得到供試材料核苷酸多樣性指數(Pi)變異范圍為0.259～0.512,平均值為0.419。利用Power marker V3.0 軟件計算了23 323個多態性SNP位點的MAF、D和PIC值(表1),MAF變異范圍為0.500～0.938,平均值為0.725;D值變異范圍為0.117～0.500,平均值為0.370;PIC范圍在0.110～0.375 之間,平均值為0.295。

2.3 百農64 特異SNP位點在其衍生品種基因組上的分布

比較百農64與衍生品種的另外3個親本周麥11、周麥16和溫麥6號間的差異SNP標記,獲得3 646個百農64特異SNP位點,其中A、B和D基因組分別為1 341、1 108和1 197個(表2),用于分析百農64特異性SNP位點在其衍生后代染色體上的分布。分別比較4個衍生品種與百農64的相同SNP位點比例(SSLR),結果顯示,同一衍生品種不同染色體之間的SSLR差異明顯,比如04中36,3D染色體僅為1.6%,而4B染色體高達100.0%;同一染色體不同品種之間的SSLR差異也明顯,以6B染色體為例,華育198為10.0%,而百農207高達92.7%。4個衍生后代與百農64在21對染色體上SSLR平均值變幅為21.5%～85.4%,其中2B,3D,6D低于30.0%;在30.1%～50.0%之間的最多,有12對染色體;超過50.0%的有6對染色體,其中6A染色體達到了85.4%。A、B和D三個基因組之間SSLR平均值也有差異,分別為54.2%、46.9%和36.5%。除百農160外,其它3個衍生品種的21對染色體SSLR平均值均超過了50.0%。

2.4 百農64及其衍生后代的遺傳相似性分析

將供試材料FISH鑒定的48種染色體block類型作為細胞學標記,結合23 323個多態性SNP位點,共23 371個標記,利用NTSYSpc V2.10e軟件計算了供試材料間的GS值(表3)。百農207、華育198和04中36三個衍生品種與百農64的GS都超過了0.700,華育198最高為0.762,這表明百農64對其后代遺傳貢獻率高。百農160與百農64的GS值為0.564,而溫麥6號對百農160貢獻較高,兩者之間GS為0.613。四個衍生系之間的GS變幅為0.464～0.652,平均值為0.544,華育198與百農207之間GS最高,為0.652,華育198與百農160之間GS最低,為0.464。

表3 供試材料間遺傳相似系數Table 3 Genetic similarity of the test varieties

2.5 聚類分析

基于供試材料染色體多態性block類型和多態性SNP共23 371個標記,利用Power marker V3.0軟件,計算了Nei1983遺傳距離,并根據遺傳距離構建了UPGMA聚類樹,在Nei1983遺傳距離0.20處,可分為三大類群(圖4)。百農64及其4個衍生后代均屬于類群Ⅰ,華育198與百農64遺傳距離最近。溫麥6號也聚在了類群Ⅰ,且百農160與其遺傳距離較近,這與其系譜及遺傳相似系數相吻合。周麥11和周麥16各為一類,與其它材料遺傳距離相對較遠。Nei1983遺傳距離與遺傳相似系數結果一致。

圖4 供試材料基于48種染色體多態性block和23 323個多態性SNP標記的聚類分析

3 討論

依據重復序列探針在不同小麥品種的豐度和分布不同,利用FISH技術可以清晰地檢測染色體結構變異和多樣性,對解析小麥基因組結構和組成具有重要參考價值[7-8]。利用pSc119.2和pAs1兩個重復DNA質粒探針,對21個小麥品種進行FISH分析,以中國春(CS)核型作為參考,鑒定到7對B組染色體均存在染色體多態性[17]。Huang等[8]對CS和373份中國栽培小麥品種進行FISH分析,從中鑒定出167種染色體多態(block)類型,其中A組和B組較多,分別為78種和64種,而D組只有25種。Carvalho等[18]利用(AAC)5作為探針,對葡萄牙5個面包小麥和5個硬粒小麥進行FISH核型分析,發現5個面包小麥的1B和6B染色體具有多態性。本研究與前人研究結果相似,A和B基因組染色體多態Block類型差異不大,D基因組最少,這表明D基因組序列比較保守。本研究在百農64中鑒定出了臂間倒位perInv6B,且遺傳給了其子代品種百農207,在百農64及其衍生品種間6B染色體多態性較豐富。同時,本研究在親本材料周麥11、周麥16和3個衍生品種中均鑒定出了小麥-黑麥T1RS/1BL易位,表明華育198和04中36的T1RS/1BL易位分別來自其親本周麥16和周麥11。百農160含T1RS/1BL易位,而其親本百農64和溫麥6號都不含,其易位可能來自另一親本多抗893。小麥育種過程中,小麥-黑麥T1RS/1BL易位系被育種家廣泛選擇。本研究表明FISH核型可以追蹤小麥品種系譜。

本研究利用小麥55K SNP芯片,對百農64及其衍生品種進行全基因組掃描,結果顯示在3個基因組中,B基因組多態性SNP標記最多,A基因組與B基因組差異不大,D基因組最少,且D與A和B兩個基因組差異較大,這與本研究的FISH染色體多態性block類型結果一致,同時與之前大多數研究結果一致[4,19-20]。這與D基因組來源單一,序列比較保守有一定關系[19],且在六倍體小麥進化過程中,A和B基因組組裝到一起形成四倍體的時間較早,而AABB與D基因組結合形成六倍體栽培小麥的時間較短[21]。Jia等[21]通過對小麥D基因組供體材料節節麥(AegilopstauschiiL.)進行全基因組測序分析,發現其基因家族與抗病性、非生物脅迫及谷物品質相關,而育種家在品種選育過程中,偏向于選擇具有這些優良性狀的品系,這種長期的定向選擇導致了其遺傳多樣性比A、B基因組低。白彥明等[4]、曹廷杰等[19]和劉易科等[20]研究均表明,小麥第四同源群多態性SNP標記最少,且4D染色體上的多態性SNP標記最少,而本研究結果顯示第四和第六同源群多態性標記數均少,多態性標記最少的染色體同樣是4D染色體。已有報道顯示4D染色體上攜帶控制育種目標性狀的基因較多,多年來育種家的定向選擇導致了4D染色體遺傳多樣性降低[19]。

FISH技術可以從細胞學上鑒定染色體結構變異和多態性,而染色體結構變異和多態性在品種環境適應性、抗病性、抗逆性、馴化和優良農藝性狀形成等過程中發揮的作用比SNP大;SNP標記可在單核苷酸水平上檢測物種遺傳差異,且在各個物種全基因組水平上均有廣泛分布。將這兩項技術結合起來,可以用于構建重組自交系群體遺傳圖譜[12],也可進行染色體結構變異和農藝性狀的關聯分析[22],但鮮有將兩種技術結合起來研究骨干親本遺傳貢獻的報道。本研究將FISH和SNP芯片技術相結合,從細胞學和單核苷酸等不同水平分析百農64與其衍生一代品種之間的遺傳相似性。除百農160與百農64遺傳相似系數小于0.6外,其它的品種都超過了0.7,且百農64特異性SNP位點在百農207、04中36和華育198染色體上分布的平均比例均超過了50%,這與核型分析結果一致,這3個品種分別有16、14、17對染色體核型與百農64一致。百農64及其4個衍生品種聚為一類,聚類分析結果與遺傳相似系數結果一致。SNP標記和核型分析結果均表明百農64對這些衍生品種的遺傳貢獻較高,生產上育成新品種的遺傳構成不是理論上的雙親平均值,而是偏向于綜合性狀好的骨干親本,骨干親本許多優良性狀被育種家定向選擇,遺傳給了子代[23-24]。對百農160遺傳貢獻率最高的親本是溫麥6號,兩者之間遺傳相似系數為0.613,聚類分析結果顯示百農160與溫麥6號遺傳距離最近,這是因為百農160是以溫麥6號為共同親本與另外兩個親本進行三親本雙交選育而成的,這些研究結果與其系譜信息相吻合。