寵物源性大腸桿菌分離鑒定和耐藥性分析

趙勇,楊丁龍,高感,武書杰,向斌,和鳳平,李 蕾,楊亮宇**,張立梅**

寵物源性大腸桿菌分離鑒定和耐藥性分析

趙勇1,2,楊丁龍1*,高感1,2,武書杰1,2,向斌1,2,和鳳平1,2,李 蕾1,2,楊亮宇1,2**,張立梅1,2**

1. 云南農業大學動物醫學院, 云南 昆明 650201 2. 云南農業大學家禽疫病防控中心, 云南 昆明 650201

為了分析昆明市寵物源性大腸桿菌的耐藥情況，并為臨床合理使用抗菌藥物提供依據，本研究對采自昆明市3家寵物醫院犬貓的26份棉拭子和5份灌洗液樣品進行大腸桿菌的分離鑒定，并基于腸桿菌基因間重復共有序列（ERIC-PCR）對分離株進行分型；使用紙片擴散法檢測分離菌株的耐藥性，并檢測了其耐藥基因攜帶情況。共分離到30株大腸桿菌，分離率為96.77%，其中犬源性14株，貓源性16株；ERIC-PCR分型顯示將30株大腸桿菌可分為9個亞型，健康犬貓與非健康犬貓源性大腸桿菌分型差異較大。耐藥性實驗顯示分離株對氨芐西林（93.33%）耐藥率最高，其次較高的是紅霉素（90.00%）、四環素(83.33%)、復方新諾明(76.67%)，而對多粘菌素B、亞胺培南均不耐藥；分離株中26株菌（86.67%）為多重耐藥菌，且具有多種耐藥譜；ESBLs基因檢出率：（70%）、（36.67%）其它耐藥基因檢出率分別為（73.33%），（33.33%），（26.67%），（26.67%）。綜上健康與非健康犬貓源性大腸桿菌基因型差異明顯；昆明寵物源性大腸桿菌多重耐藥形勢嚴峻，臨床中對氨芐西林、紅霉素、四環素、和復方新諾明應減少或停止使用。

寵物; 大腸桿菌; 耐藥基因

20世紀40年代以來，以青霉素為代表的抗生素藥物被廣泛運用于感染性疾病的治療[1]。但是隨著抗生素的不恰當使用，病原菌的耐藥問題越來越突出[2]。細菌耐藥性的產生,引起了全世界各界的廣泛關注,被世界衛生組織認為是21世紀最大的公共衛生安全問題之一[3]。隨著國內寵物產業的蓬勃發展，寵物用抗生素的使用量與日俱增，寵物源性抗生素耐藥問題越來越突出，嚴重威脅公共衛生安全[4]。大腸桿菌作為條件致病菌，在自然環境中廣泛存在，一般認為其對大部分常規使用的抗生素藥物均較為敏感，但研究卻發現普遍存在大腸桿菌耐藥菌[5]。人類感染大腸桿菌一部分被歸因于在寵物動物園、開放式農場和動物表演中與狗、羊、等動物的直接接觸[6]。由于大腸桿菌普遍存在且容易攜帶多種耐藥基因，所以在治療和預防疾病的過程中給人們帶來了很大困難[7]。為了了解昆明市寵物源性大腸桿菌的耐藥情況，本研究從3家寵物醫院共收集了31份健康或患病犬貓的泄殖腔棉拭子或灌洗液樣品，用于大腸桿菌的分離鑒定和耐藥性分析，本研究對于規范和指導寵物醫院抗生素的正確使用具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與耗材

LB肉湯、MH瓊脂、伊紅美藍瓊脂、麥康凱瓊脂均購自廣東環凱微生物科技有限公司，革蘭氏染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，細菌DNA提取試劑盒購艾克瑞生物公司，鏈霉素（STR）、四環素（TET）、復方新諾明（SXT）、氧氟沙星（OFX）、多粘菌素B（PB）、氨芐西林（AMP）、頭孢西叮（FOX）、慶大霉素（GEN）、紅霉素（EM）、頭孢他啶（CTA）、氟苯尼考（FIC）、亞胺培南（IPM）12種藥敏片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司，ESBLs檢測試劑盒購自北京普納德科技有限公司，比濁管購自廣東環凱微生物科技有限公司、DNA Marker DL2000 、premix Tap購自北京康潤誠業生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

電熱恒溫培養箱購（DHP-500BS）自北京市永光明醫療儀器有限公司、氣浴恒溫震蕩器(THZ-82B)購自常州市國旺儀器制造有限公司、梯度PCR儀（T100）購自BIORAD欣博盛生物科技有限公司、凝膠成像系統(SH-510)購自杭州申花科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1樣品的來源 寵物取自昆明市3家寵物所，一次性無菌棉簽采集犬貓肛腔拭子或直腸灌洗液(表1)。

表1 樣品類型及來源

1.3.2大腸桿菌的分離采集樣品加入到肉湯中，以37 ℃、220 rpm的條件培養24 h。培養后的樣品劃線接種于麥康凱瓊脂，37 ℃培養18～24 h。挑取(粉)紅色、邊緣光滑的可疑菌落劃線接種于伊紅美藍瓊脂進行純化，分離獲得的大腸桿菌使用LB肉湯甘油于-20 ℃冰箱保存[8]。

1.3.3 特異性PCR鑒定對疑似大腸桿菌菌株進行特異性PCR鑒定，分離菌株DNA提取采用細菌DNA提取試劑盒。引物序列見表2，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，預計擴增片段長度為756 bp。配置25 μL的PCR反應體系：2 μL DNA模板，上下引物各1 μL，12.5 μL Premix Taq，8.5 μL ddH20。退火溫度：55 ℃。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，陽性產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果在NCBI進行比對。

表2 大腸桿菌鑒定及ERIC分型引物

1.3.4 革蘭氏染色和鏡檢革蘭氏染色后記錄細菌在鏡下的形態特征。

1.3.5 腸桿菌基因間重復共有序列-聚合酶鏈式反應（ERIC-PCR條帶聚類分析）對大腸桿菌進行ERIC-PCR擴增，擴增引物見表2[9]，配置25 μL的PCR反應體系：2 μL DNA模板，上下引物各1 μL，12.5 μL Premix Taq，8.5 μL ddH20。退火溫度：54 ℃。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析電泳圖條帶，有條帶記作“1”，無條帶記作“0”。使用NTsys2.10e軟件分析確定菌株間的相似性，對ERIC產物進行聚類分析。

1.3.6 耐藥表型試驗采用K-B紙片擴散法測定分離菌株對12種抗菌藥物的敏感性,測量并記錄抑菌圈直徑，結果判斷參照CLSI（2018標準）[10]。待檢測的細菌對三類或者超過三類的抗生素表現耐藥，就可將其判定是多重耐藥菌（MDR）[11]。

1.3.7 大腸桿菌耐藥基因的檢測7類9種耐藥基因的引物參照文獻[12-16]設計，耐藥基因引物序列見表3。配置10 μL的PCR反應體系：0.5 μL DNA模板，上下引物各0.5 μL，5 μL mix，3.5 μL ddH20。

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌培養特性及形態

大腸桿菌接種選擇性培養基后的菌落形態如圖1所示。麥康凱瓊脂平板上呈大顆菌落，淡粉色突起；伊紅美藍瓊脂平板上呈金屬光澤黃綠色且邊緣整齊的菌落。

2.2 大腸桿菌鏡下的形態鑒定及PCR鑒定結果

將上述菌落進行革蘭氏染色鏡檢，可看到紅色、點狀、短桿狀密集分布的菌體（圖2）。使用大腸桿菌鑒定引物進行PCR擴增，電泳后可見約765 bp的條帶（圖3），PCR產物測序后在NCBI BLAST比對后鑒定為大腸桿菌。

圖2 革蘭氏染色鏡檢結果

圖3 部分菌株的鑒定引物PCR擴增結果

2.3 大腸桿菌分離結果

31份樣品中共分離出30株大腸桿菌，檢出率為96.77%。貓中檢出16株，犬中檢出14株，其中非健康貓分出11株菌(35.48%)，非健康犬分出10株菌(32.26%)，健康貓分出5株菌(16.13%)，健康犬分出4株菌(12.90%)，綜合來看，非健康犬貓來源的大腸桿菌占比更高（圖4）。

2.4 大腸桿菌ERIC-PCR圖譜分析

ERIC-PCR擴增序列用NTsys2.10e軟件進行聚類分析，總相似度介于0.35～1.0，相似度0.84處可以分為9個基因型（圖5）。除了II型、VI型和IX型外，犬貓來源的大腸桿菌分型差別不大；而健康與非健康犬貓來源的大腸桿菌基因型差異較大。其中，健康犬源性大腸桿菌分為III型和VIII型，非健康犬源性大腸桿菌為I、IV、V、VII和IX型；健康貓源性大腸桿菌以II型、VII型為主，非健康貓源性大腸桿菌為I、IV、V和VI型（表4）。

圖5 菌株UPGMA樹狀圖

表4 大腸桿菌ERIC基因分型的分布

2.5 大腸桿菌藥物敏感性實驗

30株菌對于AMP、EM、TET、SXT的耐藥率已超過70%，分別為93.33%、90.00%、83.33%、76.67%，對FOX、CTA、FIC、GEN 、STR、OFX耐藥性較低，耐藥率不超過50%，對IPM和PB不耐藥（圖6）。

圖6 分離菌株對12種藥敏紙片的耐藥率

健康犬貓與非健康犬貓源性大腸桿菌對AMP、EM、TET耐藥率均在80%以上，對PB、IPM耐藥率均為0，表明犬貓來源的大腸桿菌耐藥性差異不大（表5）。

表5 不同來源大腸桿菌的耐藥性比較

2.6 多重耐藥分析

有26株菌株屬于多重耐藥菌株，占比86.67%。30株大腸桿菌共存在8種耐藥類型，17個耐藥譜，其中6耐占比高達56.67%。耐藥譜為TET-SXT-AMP-GEN-EM-CTA，占比最大，為23.33%（表6）。

2.7 大腸桿菌耐藥基因檢測結果

用9對耐藥基因引物對30株大腸桿菌進行耐藥基因檢測，結果六種耐藥基因可被檢測到，PCR擴增后的耐藥基因產物片段與預期片段大小基本一致（圖7）。

M.DL2000 DNA Marker；－.陰性對照；1-8（1-3）.PCR擴增產物

M.DL2000 DNA Marker; －.negative control; 1-8（1-3）.PCR amplification product

2.8 大腸桿菌耐藥基因的統計分析

的檢出率最高，為73.33%，其次的檢出率為70%，的檢出率為36.67%，的檢出率為33.33%，sul1和的檢出率為26.67%，而、和均未檢出（圖8）。共存在10種耐藥基因譜，其中（20%）（20%）為主要耐藥基因譜，同時含有3種以上耐藥基因譜的菌株有19株（63.33%），提示本研究中分離的菌株具有較高的多重耐藥潛力（表7）。

健康犬貓大腸桿菌耐藥基因譜以（33.3%）、（44.4%）為主，非健康犬貓大腸桿菌耐藥基因譜以（28.6%）、（28.6%）為主，健康犬貓與非健康犬貓源性大腸桿菌基因型差異明顯。（表8）

圖8 分離菌耐藥基因檢測結果

表7 大腸桿菌耐藥基因譜

表8 不同健康情況犬貓分離菌耐藥基因譜對比

3 討 論

本研究從昆明市寵物醫院采集了健康或非健康犬貓的肛拭子和灌洗液共 31份樣品，共分離到 30 株大腸桿菌。ERIC-PCR將大腸桿菌分為9個亞型，犬貓源性大腸桿菌基因型差異不顯著，而健康犬貓與非健康犬貓源性的大腸桿菌的基因型差異明顯，提示大腸桿菌基因型與宿主無關，而與宿主的健康狀態相關。

30株大腸桿菌對氨芐西林、四環素、紅霉素的耐藥率均在80%以上，可能與寵物醫院常用β-內酰胺類和四環素類藥物可能有關，因為抗生素的壓力是細菌產生耐藥的主要驅動力[17]。其中非健康犬貓源性大腸桿菌對四環素、復方新諾明、氨芐西林、紅霉素耐藥性更高，這可能與其用藥有關。

產ESBLs菌株最早于1982年在英格蘭發現，此后世界各地均相繼報道，且各地的ESBLs類型的流行情況各不相同[18]。研究發現我國以CTX-M型ESBLs為主[19]，本研究中blaCTX-M（36.67%）較少，而blaTEM（70%）較多。本研究中86.67%的菌株為多重耐藥菌，耐藥譜多達13種，提示本地寵物源性大腸桿菌抗生素耐藥現狀嚴峻。

4 結 論

昆明地區健康犬貓與非健康犬貓源性大腸桿菌耐藥表型大致相同，而基因型差異明顯；大腸桿菌多重耐藥形勢嚴峻，臨床中對氨芐西林、紅霉素、四環素、和復方新諾明應減少或停止使用。

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Isolate, Identify and Drug Resistance Analysis offrom Pets

ZHAO Yong1,2, YANG Ding-long1*, GAO Gan1,2, WU Shu-jie1,2, XIANG Bin1,2, HE Feng-ping1,2,LI Lei1,2, YANG Liang-yu1,2**, ZHANG Li-mei1,2**

1.650201,2.650201,

In order to analyze the drug resistance of pet-derivedin Kunming and to provide a basis for the rational use of antimicrobial drugs in clinical practice, 26 cotton swabs and 5 irrigation fluid samples collected from dogs and cats in three pet hospitals in Kunming were used for the isolation and identification of, and the isolates were typed based on intergenic repetitive shared sequences ( ERIC-PCR ) of;the drug resistance of the isolated strains was detected using the paper diffusion method, and their drug resistance gene carriage was examined. A total of 30strains were finally isolated, with an isolation rate of 96.77%, including 14 strains of canine origin and 16 strains of feline origin；ERIC-PCR typing showed that 30 strains ofcould be classified into nine subtypes, with large differences in the typing of healthy and non-healthy canine- and cat-derived.Resistance assays showed that the isolates were most resistant to ampicillin ( 93.33% ), followed by erythromycin ( 90.00% ), tetracycline ( 83.33% ), cotrimoxazole ( 76.67% ), while they were not resistant to polymyxin B and imipenem;26 of the isolates (86.67%) were multi-drug resistant bacteria with multiple resistance profiles;the detection rates of ESBLs genes: blaTEM (70%), blaCTX-M (36.67%) and other resistance genes were tetA ( 73.33% ), qnrS ( 33.33% ), acc(6')-Ib-cr (26.67%), and sul1 ( 26.67% ), respectively.In summary healthy and non-healthy dog and cat-derived E. coli genotype differences are obvious; Kunming pet-derived E. coli multi-drug resistance situation is serious, clinical use of ampicillin, erythromycin, tetracycline, and cotrimoxazole should be reduced or discontinued.

Pet;; drug resistance

S855.1

A

1000-2324(2023)04-0530-09

10.3969/j.issn.1000-2324.2023.04.008

2023-07-03

2023-08-04

云南省“萬人計劃”產業技術領軍人才專項(YNWR-CYJS-2019-020)

趙勇(2000-),男,碩士研究生,主要從事動物臨床疾病研究. E-mail:3067916283@qq.com

同等貢獻作者:楊丁龍(2000-),男,本科生,主要從事動物疫病的檢測工作. E-mail:1730174087@qq.com

通訊作者:Authors for correspondence. E-mail:745863086@qq.com; 20073175@163.com