2 個煙草青枯病菌菌株的致病力差異與基因組比較分析

管成偉，胡利偉，馮小虎，張超群，秦言敏，張志高，王利兵

（1.江西省煙草科學研究所，江西 南昌 330002；2.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南 鄭州 450001；3.江西省煙草公司撫州市公司，江西 撫州 344000；4.撫州市煙草公司黎川分公司，江西 撫州 344600）

【研究意義】青枯病菌也叫青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum），是引發青枯病的病原菌，具有侵染力強、寄主范圍廣的特點，目前已知能夠侵染50 多科200 多種作物，煙草就是其中之一。青枯病菌還有明顯的生理分化現象［1-2］，來源于不同地區和不同寄主植物的病原菌在寄主范圍、致病力和菌系特性等方面差異很大［3-4］。我國煙草青枯菌屬于生理小種1、生化型III 和IV，且均屬于演化型I［4］。盡管我國煙草青枯菌的生理小種、生化型及演化型等群體結構較為單一，但同一演化型的青枯菌致病力也存在較大差異［5-10］，給青枯病的防治帶來很大困難。截至目前，針對煙草青枯病防治，國內尚未有較為廣泛有效的技術方法。因此，了解煙草青枯菌致病力差異的內在基礎，對于探索更有針對性的防控措施、提高煙草青枯病的防治效果具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】煙草青枯病菌的致病力不但與溫度、濕度、pH 值以及營養條件等環境因素密切相關，還與病原菌的內在編碼基因有關，其中主要的內在編碼基因有III 型和VI 型分泌系統、胞外多糖（Extracellular polysaccharide，EPS）合成、鞭毛合成等基因（簇）［3-4,11］。目前已經有包括GMI1000 在內的多個青枯菌株系的基因組測序已經完成，通過基因組比較發現，不同青枯病菌細胞內部的巨大質粒上攜帶著大量特有的基因，大小變異幅度達到26%［4,12-13］,這些特有基因賦予不同青枯病菌株不同的生理特性和侵染能力?！颈狙芯壳腥朦c】雖然眾多研究學者已證實青枯病菌株的致病力差異主要與編碼III 型和VI 型分泌系統、胞外多糖合成、鞭毛合成等基因（簇）有關，但由于青枯病菌之間遺傳物質變化和差異大，同一區域內關系相近的青枯病菌株在致病力和基因序列方面仍存在不同，這些內在差異直接影響青枯病防治藥劑的防治效果。因此，比較不同致病力青枯病菌菌株之間基因序列上的差異，探索針對青枯病菌的遺傳差異的防治藥劑和技術，對提高青枯病防效具有重要意義?！緮M解決的關鍵問題】本研究從江西撫州廣昌縣頭陂鎮和南豐縣太源鄉種植的云煙87 上分離得到2 株序列變種為13 的青枯病菌，為首次在江西撫州地區發現能夠侵染煙草的青枯病菌序列變種13［14］。通過對2 株致病力有差異的菌株進行基因組測序,比對其編碼基因和編碼蛋白的差異，探索2 株菌株之間致病力差異的內在基礎，以期為根據致病力差異制定防治措施、開發針對性青枯病防治藥劑、提高防治煙草青枯病防治效果提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 青枯病菌的分離與鑒定

青枯病菌菌株RsTP2 和RsTY2 于2016 年7月分別分離自撫州市廣昌縣和南豐縣的發病煙草植株。將采集的青枯病煙草植株莖桿于室內切成5 cm 長的莖段，置于盛有濕紗布的塑料袋內3～5 h，將溢出的白色菌液挑入盛有 2～3 mL 無菌水試管中研磨制成菌懸液，靜置15 min 后用移菌環移取菌懸液并在牛肉膏蛋白胨選擇培養基平板上劃線［15］（選擇培養基含放線菌酮50 mg/L、氯霉素10 mg/L 和硫酸多粘菌素B 10 mg/L），28 ℃恒溫培養48 h，挑取2 個單菌落進行純化，分別命名為RsTP2 和RsTY2，于4 ℃冰箱內斜面保存備用。采用青枯病菌種特異引物對759/760 對菌株RsTP2 和RsTY2 的egl基因片段進行PCR 鑒定［14］，同時將菌株RsTP2 和RsTY2 置于中國工業微生物保藏中心（http://www.china-cicc.org/）保藏，保藏號分別為CICC24306 和CICC24305。

1.2 侵染試驗

將青枯病菌株接入LB 液體培養基（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L）中，30 ℃、200 r/min，過夜培養至渾濁狀態，離心后菌體采用無菌水重懸，采用紫外分光光度計檢測菌液濃度，菌液稀釋至1.0×108CFU/mL 用于侵染試驗。

侵染試驗在鄭州煙草研究院溫室進行。測試品種為當地主栽品種云煙87，該品種對青枯病抗性為中感。當云煙87 苗齡4～5 周時，采用傷根灌菌液法分別接種1.0×108CFU/mL 的青枯病菌液，以清水處理為對照，每個處理侵染36 株苗。28～30 ℃條件下培養2 周后調查發病情況，病情指數和發病率調查按照國家標準 GB/T23222-2008進行。

1.3 青枯病菌基因組DNA 提取

青枯病菌基因組的提取采用Ezup 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒（生工生物工程(上海)股份有限公司）進行，提取方法參照試劑盒說明書進行操作。提取的DNA 可立即進行下一步實驗或-20 ℃保存。

1.4 青枯病菌基因組測序

采用Covaris ME220（美國Covaris 公司）將提取的DNA 片段化打斷，以Agencourt AMPure XP 核酸純化試劑盒（德國Beckman Coulter 公司）將破碎后的DNA 片段濃縮回收。使用Next?Ultra? DNA 文庫制備試劑盒（英國NEB 公司）進行建庫和連接接頭，磁珠分選純化連接產物，接著采用Next Q5 Hot Start HiFi PCR 預混液（英國NEB 公司）進行文庫的擴增和擴增產物磁珠純化，使用Qubit?2.0（美國Invitrogen 公司）進行文庫濃度測定，使用Agilent 2100 生物分析儀（美國Agilent 公司）進行文庫長度分布檢測，采用Hiseq XTen 平臺（美國Illumina 公司）進行測序。

1.5 基因序列的生物信息學分析與基因注釋

獲得測序數據后，采用FastQC 軟件對原始數據進行質量評估，過濾處理后使用IDBA_UD對各樣本有效序列進行拼接組裝［16-17］，獲得contigs，綜合評定多個Kmer 的組裝結果，采用Prodigal 對最佳拼接結果進行ORF 預測［18］，并將長度≥100 bp 的基因翻譯成氨基酸序列。采用CD-HIT 軟件對基因預測結果進行去冗，獲得非冗余基因集［19］。采用Bowtie2 將各樣本序列比對到非冗余基因集序列上［20-21］。將獲得的基因和蛋白序列與相關數據庫（包括NR）進行比對，獲得基因的功能及物種注釋信息［22-24］。

2 結果與分析

2.1 菌株RsTP2 和RsTY2 的分離與鑒定

菌株RsTP2和RsTY2的PCR鑒定結果如圖1，其擴增產物出現在青枯病菌預期位置（281 bp），同時將其回收純化送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，序列比對結果表明其均為青枯病菌。將菌株RsTP2 和RsTY2 的egl基因擴增測序結果提交NCBI 數據庫，獲得編號分別為MG669274 和MG669275，將其與亞洲分支序列變種12、13、15、17、34 和44 等序列變種egl基因進行比對分析，MG669274 和MG669275 序列與來自序列變種13 菌株JT523 的AF295252 序列相似度為100%，確定菌株RsTP2 和RsTY2 均為亞洲分支演化型I 中的序列變種13（圖2）。

圖1 菌株RsTP2 和RsTY2 的PCR 鑒定結果Fig. 1 PCR identification results of strains RsTP2 和RsTY2

圖2 菌株RsTP2 和RsTY2 與相關序列變種egl 序列的系統發育分析Fig. 2 Phylogenetic analysis based on egl gene sequences of strains RsTP2 and RsTY2 with related sequence variants

2.2 菌株RsTP2 和RsTY2 對云煙87 的致病力測試

將濃度為1.0×108CFU/mL 的菌株RsTP2 和RsTY2 菌液以傷根灌菌液法接種云煙87，2 周后調查發病率和病情指數。結果（圖3）顯示，未接種青枯病菌的對照煙苗生長正常，未發生青枯??；而接種菌株RsTP2 的云煙87 煙苗葉片基本上全部凋萎，發病率為100%、病情指數達76.9；接種菌株RsTY2 的云煙87 煙苗發病率為100%、病情指數達35.6。由此表明，菌株RsTP2和RsTY2 對云煙87 的致病力有顯著差異，菌株RsTP2 致病力較強，菌株RsTY2 致病力較弱。

圖3 云煙87 接種菌株RsTP2 和RsTY2 的發病情況Fig. 3 Disease incidence of Yunyan 87 inoculated with strains RsTP2 and RsTY2

2.3 菌株RsTP2 和RsTY2 的基因組測序

將菌株RsTP2 和RsTY2 進行基因組測序，總共獲得785 MB 和787 MB 數據，其Clean Data Q30（%）分別為92.52%和92.23%，基因組框架圖總共獲得5.43 MB 和5.23 MB，分別預測編碼基因4 967 和4 801 個，平均基因長度分別為965和970 bp（表1）。測序數據已上傳至NCBI，菌株RsTP2 和RsTY2 基因組序列登記號分別為SAMN35628657 和SAMN35628658。

表1 菌株RsTP2 和RsTY2 的基因組測序數據Table1 Genome sequencing data of strains RsTP2 and RsTY2

2.4 菌株RsTP2 和RsTY2 的差異基因篩選

為探究菌株RsTP2 和RsTY2 致病力差異的分子機制，對兩者的差異基因進行篩選，將菌株RsTP2 和RsTY2 編碼基因的蛋白序列進行BLASTP 分析，結果表明菌株RsTY2 有52 個蛋白序列與菌株RsTP2 的44 個蛋白存在差異，其相似度在50.00%～99.88%?；谏飳W過程的GO分析結果表明，其差異基因更多地參與含氮化合物代謝、雜環化合物代謝、芳香族化合物代謝、蛋白定位與細胞運輸等過程（圖4）。其中，凝集素（Hemagglutinin）類蛋白數量最多，RsTY2有10 個蛋白，菌株RsTP2 有9 個蛋白，其序列相似度在55.00%～99.61%；其次是細胞溶素分泌激活蛋白（Family hemolysin secretion activation protein），在菌株RsTP2 和RsTY2各有4個蛋白序列差異較大；穿孔素家族蛋白（Phage holin family protein）在兩者之間也存在較大差異，各有4 個蛋白序列差異較大（表2）。

表2 菌株RsTP2 和RsTY2 差異基因比對情況Table 2 Differential genes alignment between strain RsTP2 and RsTY2

圖4 基于生物學過程的菌株RsTP2 和RsTY2 差異基因GO 分析Fig. 4 GO analysis of strains RsTP2 and RsTY2 differential genes based on biological processes

2.5 菌株RsTP2 和RsTY2 凝集素家族的系統發育分析

將菌株RsTP2 和RsTY2 的差異凝集素蛋白進行比對后構建系統發育樹，結果（圖5）表明，以0.5遺傳距離進行劃分，可以將其分成a～h 共8 個亞類，其中d 亞類和g 亞類包含凝集素蛋白最多、分別為3 個和4 個，其他亞類均為2 個?？梢?，凝集素蛋白在菌株RsTP2 和RsTY2 之間差異蛋白較多、序列差異較大，可能是其致病力差異的因素之一。

圖5 菌株RsTP2 和RsTY2 的凝集素基因遺傳多樣性分析Fig. 5 Genetic diversity analysis of lectin genes in strains RsTP2 and RsTY2

3 討論

煙草青枯病菌具有很強的侵染性，目前已知能夠侵染450 余種寄主植物，其致病性主要與編碼III 型和VI 型分泌系統、胞外多糖合成、鞭毛合成等基因（簇）有關［4］。然而，即使同屬于一個亞型或序列變種的青枯病菌，不同菌株之間的致病性仍然存在較大差異。Remenant 等［25］從泛基因組學的角度對6 個基因組的比對結果顯示，青枯菌核心基因組的權重僅占28%，非必需基因組占35%，各菌株擁有數量不等的菌株特異基因，因此，各菌株獨有的特異基因可能是導致菌株間致病力差異較大的重要原因［26］。

本研究從江西撫州廣昌縣頭陂鎮和南豐縣太源鄉等地種植的云煙87 上均分離到青枯雷爾氏菌菌株RsTP2 和RsTY2，egl測序表明其為亞洲分支序列變種13，侵染試驗表明菌株RsTP2 對云煙87 致病力較強、菌株RsTY2 致病力較弱。分析兩者基因組序列發現，菌株RsTY2 的52 個蛋白序列與RsTP2 菌株的44 個蛋白存在差異，其相似度在50.00%～99.88%之間，其中凝集素類蛋白數量最多，其次是細胞溶素分泌激活蛋白和穿孔素家族蛋白。編碼凝集素的基因廣泛存在于動植物病原菌中，如青枯雷爾氏菌的基因組中就有27 個與凝集素相關的編碼基因，這些基因編碼的蛋白主要作用是促使病原菌附著到寄主細胞表面［27-28］，已有研究證明其在青枯雷爾氏菌（R.solanacearum）［12］、百日咳桿菌（Bordetella pertussis）［29］、流感嗜血桿菌（Haemophilus inf luenzae）［30］、苛養木桿菌（Xylella fastidiosa）［31］等致病菌侵入寄主細胞中起著重要作用。細胞溶素對致病菌在寄主細胞表面的黏連和侵染、寄主組織中細胞間的生存及毒力發揮方面起著重要作用，而細胞溶素分泌激活蛋白可促進細胞溶素的分泌、進而促進侵染發生［32-33］。穿孔素（Holin）可協助自溶素(Autolysin) 作用于宿主細胞的細胞壁，并通過切割肽聚糖聚合物中的各種鍵來發揮作用，具體作用取決于自溶素的類型［34-35］。由此可見，凝集素、細胞溶素分泌激活蛋白和穿孔素家族蛋白等與青枯病菌的侵染能力和致病能力高度相關。

4 結論

本研究從廣昌縣頭陂鎮和南豐縣太源鄉的青枯病發病煙株上分離到青枯雷爾氏菌菌株RsTP2和RsTY2，egl測序證明其為亞洲分支序列變種13，侵染試驗表明菌株RsTP2 對云煙87 致病力較強、菌株RsTY2 致病力較弱。通過對比屬于同一序列變種、但致病力存在差異的2 株青枯病菌RsTP2 和RsTY2 基因序列，發現菌株RsTY2 的52 個蛋白序列與菌株RsTP2 的44 個蛋白存在差異，其相似度在50.00%～99.88%。差異基因更多地參與含氮化合物代謝、雜環化合物代謝、芳香族化合物代謝、蛋白定位與細胞運輸等過程。其中，編碼凝集素類蛋白數量差異最大，其次是細胞溶素分泌激活蛋白和穿孔素家族蛋白，這3 類蛋白與青枯病菌的吸附侵染能力相關性較高。凝集素類蛋白、細胞溶素分泌激活蛋白和穿孔素家族蛋白3 類基因編碼的蛋白序列差異可能是導致RsTP2 和RsTY2 致病力差異的重要原因。