基于網絡藥理學和動物實驗探討葛根芩連湯治療2 型糖尿病的作用

范堯夫，許 娟，孫洪平，曹 琳

（南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院內分泌科，江蘇 南京 210028）

目前全球有超過4.63 億糖尿病患者，到2045 年糖尿病患病人數將達到7 億［1-2］。在糖尿病人群中，約90%以上為2 型糖尿?。═2DM），其主要病理特征是胰島素抵抗及胰島β 細胞功能障礙［3］。目前針對T2DM 的治療主要以化學藥物為主，雖然降糖療效確切，但常伴隨各種不良反應的發生。研究已證實，肝臟糖異生作用的增加是糖尿病發病機制中極為關鍵的一點，且該作用可貫穿T2DM 的整個病程。因此，調控肝臟異常糖異生作用，減少肝糖原輸入是治療T2DM 的重要且有前景的方法。近年來，中醫藥在改善糖脂代謝方面取得了顯著成效。葛根芩連湯作為治療早中期腸道濕熱型T2DM 的代表方劑收錄于《中國2 型糖尿病防治指南》［4］。葛根芩連湯出自《傷寒論》，具有清利濕熱功效，在改善肝臟胰島素抵抗、調節肝糖異生方面具有獨特優勢［5-6］，但是其治療T2DM 的確切機制和靶點并不明確。本研究運用網絡藥理學及分子對接技術，構建“藥物-靶點-通路” 多維網絡，探討葛根芩連湯治療T2DM 的分子機制，并通過在體實驗驗證其可能機制，為葛根芩連湯改善糖脂代謝提供依據。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學

1.1.1 葛根芩連湯有效成分、靶點篩選 利用中藥系統藥理學技術平臺 （TCMSP），以藥物口服生物利用度（OB） ≥30%、類藥性（DL） ≥0.18 為篩選標準，獲取葛根芩連湯有效成分，再借助Uniprot 數據庫，將其信息轉換為對應的靶標基因。

1.1.2 2 型糖尿病疾病相關靶點基因收集 以“type 2 diabetes mellitus” 為檢索詞，檢索 GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank 數據庫中T2DM 靶點基因，刪除重復靶點，利用Uniprot 數據庫進行人源基因轉換。

1.1.3 葛根芩連湯有效成分、T2DM 共同靶點基因的篩選及韋恩圖構建 運用Rx64 軟件處理葛根芩連湯有效成分的靶點數據和T2DM 疾病靶點基因數據，然后進行匹配和交集基因篩選，繪制韋恩圖。

1.1.4 有效成分-潛在作用靶點調控網絡構建 采用Cytoscape 3.8.2 軟件構建“活性成分-潛在作用靶點” 網絡圖，應用“Network Analysis” 功能對網絡的拓撲屬性進行分析，根據Degree 值篩選出具有核心調控作用的化合物。

1.1.5 靶蛋白相互作用 （PPI） 網絡構建及核心靶點篩選 采用STRING （https： / /string-db.org） 在線數據庫對藥物-疾病共同靶點進行PPI 分析，物種定位為人，設定置信度閾值＞0.90，將篩選的蛋白導入Cytoscape 3.8.2 軟件中構建PPI 網絡，對節點連接度進行分析，篩選出核心靶點。

1.1.6 基因功能及生物通路富集分析 利用R 語言軟件包對潛在靶基因進行基因本體（GO） 功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG） 富集分析，設定閾值P＜0.05。GO 分析中從生物過程（biological process，BP）、細胞組成 （cellular component，CC）、分子功能 （molecular function，MF） 3 個方面來探究潛在靶基因的功能水平，KEGG 分析中識別葛根芩連湯干預T2DM 的生物學通路，以揭示其對T2DM 的干預機制。

1.2 動物實驗

1.2.1 動物 C57BL/6J 小鼠40 只，雄性，SPF 級，12 周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司［實驗動物生產許可證號SCXK （滬） 2012-0002］，飼養條件為相對濕度50% ～70%。所有實驗涉及動物的飼養和實驗過程均嚴格遵守南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院實驗動物管理與保護的相關準則。

1.2.2 藥物 葛根、黃芩、黃連、甘草均購自南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院，經江蘇省中醫藥研究院中藥制劑室吳軍教授鑒定為正品，四者按8 ∶3 ∶3 ∶2 比例進行配制［5］，采用傳統水煎法提取后濃縮至生藥量1.56 g/mL，取部分濃縮液稀釋至0.78 g/mL，分瓶保存于-20 ℃冰箱中。

1.2.3 試劑與儀器 鹽酸吡格列酮片（江蘇德源藥業股份有限公司，批號H20110048）。腫瘤壞死因子-α （TNF-α）、白細胞介素17 （IL-17） ELISA 試劑盒和TNF-α、核因子κB （NF-κB）、β-actin 抗體 （英國Abcam 公司，批號ab46070、ab100702、ab215188、ab16502、ab6276 ）。Biospectrum 凝膠成像系統（美國UVP 公司）； 組織切片機（德國Leica 公司）； 光學顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.2.4 建模與給藥 40 只小鼠適應性喂養1 周后隨機分為正常組（8 只） 和造模組（32 只）。正常組給予普通飼料喂養，造模組給予高脂飼料（南通特洛菲飼料科技有限公司，批號2017416，含脂量60%） 喂養，4 周后腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液（45 mg/kg），持續3 d，注射后72 h，經尾靜脈檢測隨機血糖≥16.7 mmol/L，即為造模成功。將造模組分為模型組、吡格列酮組和葛根芩連湯低、高劑量組，每組8 只，吡格列酮組灌胃吡格列酮30 mg/kg，葛根芩連湯低、高劑量組灌胃葛根芩連湯10、20 g/kg［5］，正常組和模型組灌胃等量蒸餾水，每天1 次，持續8 周，每周稱量小鼠體質量以調整灌胃量。

1.2.5 指標檢測 造模成功后，每周固定時間采大鼠尾靜脈血，用血糖儀檢測空腹血糖（FBG）。末次給藥后小鼠禁食不禁水24 h，稱量體質量，心臟采血后處死，全血離心后取血清，于-20 ℃下保存，根據ELISA 試劑盒說明書檢測血清空腹胰島素（FINS）、TNF-α、IL-17 水平； 采用穩態模型（HOMA） 評估胰島素抵抗（IR） 數值，公式為HOMA-IR＝FBG×FINS/22.5。取各組大鼠肝組織，部分于10%福爾馬林中固定，常規石蠟包埋、切片，HE 染色，部分冷凍保存，Western blot 法檢測KEGG 富集核心通路中相關蛋白表達，勻漿后使用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，采用BCA 試劑盒測定濃度，進行10% SDS-PAGE 電泳，電轉移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，孵育一抗、二抗，化學發光法曝光、顯影，使用凝膠成像分析系統檢測各蛋白條帶灰度值。

1.2.6 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，符合正態分布的計量資料以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析； 不符合正態分布或方差不齊者采用非參數秩和檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 葛根芩連湯有效成分及靶點篩選 葛根芩連湯化學成分共489 種，按OB≥30%、DL≥0.18 條件篩選后得到146種有效成分，其中葛根4 種，黃芩36 種，黃連14 種，甘草92 種，刪除重復后共140 種，見表1。再使用Uniprot 數據庫對上述有效成分對應的靶點進行人源基因轉換，去重合并后得到212 個靶點。

表1 葛根芩連湯有效成分（OB 值前二十位）

2.2 藥物-疾病共同靶點 將 GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank 數據庫中10 821 個T2DM 靶標基因利用Venn 作圖軟件，得到204 個葛根芩連湯治療T2DM 相關的潛在靶點，見圖1。

圖1 葛根芩連湯與T2DM 交集靶點Venn 圖

2.3 PPI 網絡構建與核心靶點 利用STRING 數據庫和Cytoscape 軟件，構建了包含204 個藥物-疾病共同靶點的PPI 網絡，見圖2。采用網絡拓撲結構篩選得到核心靶點18個，處于核心位置前十的關鍵靶點有JUN、AKT1、STAT3、MAPK3、FOS、MAPK1、MYC、MAPK14、ERS1、TP53，見圖3。

圖2 葛根芩連湯與T2DM 共同靶點PPI 網絡

圖3 PPI 核心靶點篩選流程圖

2.4 “中藥有效成分-靶點-疾病” 網絡圖構建 將葛根芩連湯的4 味中藥、140 種有效成分、204 個潛在靶點采用Cytoscape 3.8.2 軟件構建“中藥有效成分-靶點-疾病” 可視化網絡，通過“Network Analyzer” 功能對節點、邊的數據進行拓撲分析，發現19 種活性成分的degree、BC、CC 均高于平均值，其中排名前三的為槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、漢黃芩素（wogonin），見圖4。

圖4 “中藥有效成分-靶點-疾病” 可視化網絡圖

2.5 GO 功能、KEGG 通路富集分析 將藥物-疾病共同靶點經R 語言處理后進行GO 功能、KEGG 通路富集分析。選取BP、CC、MF 顯著性排名前十者構成GO 富集氣泡圖。GO-BP 主要涉及對藥物的反應、細胞對化學應激的反應、對金屬離子的反應等，GO-CC 主要涉及膜筏、膜微區、膜區等，GO-MF 主要涉及DNA 結合轉錄因子結合、RNA 聚合酶Ⅱ特異的DNA 結合轉錄因子結合、酰胺結合等，見圖5。對藥物-疾病共同靶點進行KEGG 通路富集分析，共得到119 條信號通路，選取排名前二十者繪制氣泡圖，進行可視化分析，見圖6。進一步對GO 生物過程和KEGG 通路按照P值篩選分析，結果顯示，TNF 通路中的PI3K/p-AKT/p-IKKs/NF-κB 通路在T2DM 的發生和發展過程中起著重要作用，見圖7。

圖5 葛根芩連湯治療T2DM 的GO 功能富集分析

圖6 葛根芩連湯治療T2DM 的KEGG 通路分析

圖7 TNF 通路過程分析

2.6 葛根芩連湯對T2DM 小鼠體質量、FBG、FINS 及HOMA-IR 水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠體質量增加 （P＜0.01），FBG、FINS 及HOMA-IR 水平均升高（P＜0.01）； 與模型組比較，各給藥組小鼠體質量、FBG、FINS 及HOMA-IR 水平均降低 （P＜0.05，P＜0.01），見圖8。

圖8 各組小鼠體質量、FBG、FINS 及HOMA-IR 水平變化（±s，n＝8）

2.7 葛根芩連湯對T2DM 小鼠肝組織病理形態的影響 與正常組比較，模型組小鼠可見肝細胞結構不規則，肝臟脂質沉積、空泡變性及水樣變性； 與模型組比較，各給藥組小鼠肝細胞結構稍腫大，呈放射狀排列，肝臟組織形態學紊亂減輕，可見散在脂肪空泡，邊界稍模糊，見圖9。

圖9 各組小鼠肝組織HE 染色（×400）

2.8 葛根芩連湯對T2DM 小鼠血清TNF-α、IL-17 水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-17 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，各給藥組小鼠血清TNF-α、IL-17 水平降低（P＜0.01），見表2。

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-17 水平比較（±s，n＝8）

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-17 水平比較（±s，n＝8）

注： 與正常組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別IL-17/（pg·mL-1）TNF-α/（ng·L-1）正常組58.04±8.2626.45±2.51模型組103.59±14.02**58.19±7.82**吡格列酮組65.37±9.45＃＃32.27±4.43＃＃葛根芩連湯低劑量組66.78±10.26＃＃31.25±4.60＃＃葛根芩連湯高劑量組62.31±8.62＃＃28.96±2.67＃＃

2.9 葛根芩連湯對T2DM 小鼠肝組織TNF-α、NF-κB 蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝組織TNF-α、NF-κB 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，各給藥組小鼠肝組織TNF-α、NF-κB 蛋白表達降低（P＜0.01），見圖10。

圖10 各組小鼠肝組織TNF-α、NF-κB 蛋白表達變化（±s，n＝8）

3 討論

越來越多研究證實，葛根芩連湯治療T2DM 療效確切［7-11］?！吨袊? 型糖尿病防治指南（2017 年版） 》 推薦葛根芩連湯用于治療早、中期腸道濕熱證T2DM［4］。然而，中藥復方的物質基礎十分復雜，這導致了其作用機制研究的不明確性。近年來，網絡藥理學的興起為中藥復方的研究提供了新的方法和思路，也為更好地理解中藥復方的藥效和療效機制提供了新的途徑。

本研究通過數據庫篩選，最終獲得葛根芩連湯140 種有效成分和212 個對應藥物靶點。采用Venn 分析后得到204 個交集靶點； 通過構建PPI 網絡及網絡拓撲結構篩選出關鍵基因18 個。根據degree 值篩選前3 位有效成分為槲皮素、山柰酚、漢黃芩素。這3 種成分均屬于黃酮類化合物，可以提高胰島素敏感性和改善胰島β 細胞數目［12-15］。我國一項大型橫斷面研究顯示槲皮素攝入量與T2DM 的患病率呈負相關［12］。槲皮素是一種天然多羥基黃酮類化合物，可以降低機體氧化應激水平，抑制INS-1 細胞凋亡，促進胰島素分泌［13］。山柰酚可以增加Akt 和己糖激酶活性，降低肝臟中葡萄糖-6 磷酸酶的活性，并通過抑制肝臟中的糖異生發揮降糖作用［16］。漢黃芩素可通過胰島素受體-1/PI3K/堿性磷酸酶途徑促進葡萄糖攝取和糖酵解，抑制肝細胞糖異生，改善胰島素抵抗［17］。上述研究表明，葛根芩連湯可能這3 種有效成分作用于關鍵靶蛋白來發揮治療T2DM 的作用。

GO 分析表明葛根芩連湯可能作用于多細胞組分產生不同生物學功能，從而發揮治療T2DM 的功效。KEGG 富集分析結果顯示葛根芩連湯治療T2DM 的關鍵靶點主要參與TNF 信號通路等。隨著T2DM 發病機制的深入研究，很多學者認為T2DM 可能是一種免疫性的炎性反應性疾病，其中TNF-α 參與炎癥反應及糖脂代謝的調節［18-20］。Skuratovskaia 等［21］發現，TNF-α 可以抑制胰島素受體底物-1的磷酸化進而導致胰島素抵抗的發生，增加T2DM 病程的進展。另外研究表明，TNF-α 可以導致血管內皮細胞的炎癥反應，增加內皮細胞的粘附性，使血管內皮屏障功能受損； 此外，TNF-α 還可以促進血管內皮細胞的凋亡，導致內皮細胞的損傷和脫落，從而增加糖尿病血管病變的發生風險［22］。以上研究均表明，TNF-α 信號通路在T2DM 中發揮重要作用。

為了驗證網絡藥理學預測結果，動物實驗結果發現，葛根芩連湯可以有效降低T2DM 小鼠胰島素、HOMA-IR、TNF-α 及IL-17 水平，改善高血糖狀態； 減少肝細胞內的脂滴積聚，有助于維持肝細胞的正常結構和功能； 降低肝組織TNF-α、NF-κB 蛋白表達。本研究發現網絡藥理學預測的藥物作用靶點與實際藥物作用靶點有較高的一致性，表明網絡藥理學方法可以較準確地預測藥物與疾病靶點的相互作用關系。

綜上所述，葛根芩連湯治療T2DM 具有多成分、多靶點特性，其可能通過TNF-α 信號通路抑制炎癥反應發揮降糖療效，這將為進一步研究葛根芩連湯治療T2DM 的基礎研究提供一定的理論依據。