注射HCG 后不同授精時間對IVF-ET 患者胚胎發育和妊娠結局的影響*

王 寧，仲萬霞

(1 山東大學附屬生殖醫院，山東省生殖醫學重點實驗室，濟南 250001；2 上海市輔助生殖與優生重點實驗室，上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院生殖中心)

體外受精(in-vitro fertilization,IVF)治療是一種超生理過程，它模擬了正常人月經周期中發生的許多生理過程，即卵泡發育，卵母細胞成熟/排卵，受精和著床?？刂菩猿怕?controlled ovarian hyperstimulation,COH)是IVF-胚胎移植(embryo transfer,ET)的重要環節。促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)可以誘導多個卵泡的生長，隨著卵泡的生長，促黃體生成素(luteinizing hormone,LH)激增，通過使用促性腺激素釋放激素(gonadotrophin releasing hormone,GnRH)拮抗劑[1-2]，或持續使用GnRH 激動劑(GnRH agonist,GnRHa)下調GnRH 受體[3]從而抑制過早排卵。一旦卵泡達到所需的大小，注射LH，從而誘導卵母細胞成熟和排卵[4]。但獲取的卵母細胞并非都具有相同的發育潛力，它們的細胞核與細胞質的成熟程度往往并不同步[5]。研究[6]發現，人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)注射后不同的授精時間可能影響卵母細胞的成熟、后續受精及發育潛能。目前，一般取卵手術在HCG 注射后34～36 h 進行，有學者[7]發現常規IVF 的最佳授精時間在HCG注射后40～41 h，因為此時間段的臨床妊娠率較高、早期流產率較低。但HCG 注射后授精的時間尚未達成統一，因此本研究采用回顧性分析方法探討HCG 注射后授精時間與胚胎發育及臨床結局之間的關系，從而優化IVF-ET 實驗室操作規程、改善臨床結局。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組 本研究數據來源于山東大學附屬生殖醫院系統數據庫，回顧性分析2019 年1月—2021 年12 月進行IVF-ET 助孕患者的病歷資料。納入標準：(1)女方年齡≤38 歲；(2)獲卵數5～20枚；(3)本院第一周期促排卵；(4)行卵裂期胚胎移植；(5)夫婦雙方染色體正常；(6)女方因盆腔輸卵管因素不孕；(7)男方精液質量達到IVF-ET 治療標準。最終有5 743 個周期納入分析。根據HCG 注射后授精時間的不同分為3 組：38～39 h 授精(A 組,周期=474)；＞39～40 h 授精(B 組,周期=3 834)；＞40～41 h 授精(C組,周期=1 435)。

1.2 IVF-ET 方法

1.2.1 控制性超促排 本中心依據基礎激素水平及竇卵泡計數選擇5 種常用促排方案：超長方案、長方案、短方案、微刺激以及拮抗劑方案促排卵。經陰道B 超和激素水平監測卵泡發育，當至少2 個卵泡直徑≥18 mm 時注射重組HCG[8]，進行扳機處理。

1.2.2 取卵和卵母細胞的培養 HCG 注射后34～36 h 在陰道B 超引導下進行取卵操作，將獲取的卵泡液倒入100 mm 大皿中并在體視顯微鏡下收集卵冠丘復合體(oocyte-corona-cumulus complex,OCCC)，轉于IVF 培養液(G-IVF PLUS,Vitrolife)或FM 培養液(fertilization medium,Cook)中，標記好獲卵個數后放入6%CO2培養箱中培養。

1.2.3 IVF 和胚胎培養 精液采用密度梯度離心法結合上游法處理[9]，精子質量符合IVF 授精要求，授精時間為患者HCG 注射38 h 后，將提前調好濃度的精子按照1∶100 000 加入包含卵子的受精液(K-SIFM-100,Cook 或G-IVF PLUS,Vitrolife)中，每個授精孔中卵子≤5 個，然后置于G185 三氣培養箱中進行培養。授精5 h 后進行短時脫顆粒，將受精的卵子快速轉移至卵裂培養液(Cook 或G1 PLUS,Vitrolife)并置于G185 三氣培養箱中繼續培養。

1.2.4 胚胎評分和移植 在胚胎受精后16～20、25～26、43～45 及67～69 h 觀察早期胚胎發育的情況，根據F.PUISSANT 等[10]的早期胚胎評分標準進行評分：依據卵裂球形態大小以及有無核碎片進行分級。Ⅰ～Ⅱ級胚胎為優質胚胎，Ⅰ～Ⅲ級胚胎為可移植胚胎。綜合考慮患者臨床指征和早期胚胎發育評分，挑選1～2 枚正常受精(2PN)的胚胎進行移植。對于移植后有剩余胚胎的患者，經其知情同意后，進行第3 天早期胚胎冷凍或將剩余胚胎轉移至囊胚培養液(Cook 或G2 PLUS,Vitrolife)中行囊胚培養至第5 或第6 天進行囊胚冷凍，囊胚評分標準參照文獻[11]的方法。

1.2.5 分析指標及評價 主要分析指標有正常受精(2PN)率、多精受精率、優質胚胎率、囊胚形成率、優胚囊胚形成率、卵子利用率、臨床妊娠率、著床率、早期流產率和活產率。其中，卵子利用率=(移植胚胎數+冷凍胚胎數)/獲卵數×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%，著床率=超聲下可見孕囊數/移植胚胎數×100%，早期流產率=發生早期流產的周期數/臨床妊娠周期數×100%，活產率=活嬰出生周期數/胚胎移植周期數×100%。

1.2.6 臨床結局判斷 移植后2 周檢測血β-HCG，≥10 mIU/mL 為生化妊娠，繼續黃體支持，移植后1個月行B 超檢查，若宮腔見孕囊及胎心管搏動則判定為臨床妊娠；孕12 周內發生胚?；蛉焉镂锱懦鰟t為早期流產；孕12～28 周間妊娠終止為中晚期流產；妊娠滿28 周且至少有1 個存活新生兒分娩判定為活產[12]。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計軟件進行分析。計量資料以±s 表示，組間比較采用單因素方差分析；計數資料以率表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組患者基本臨床資料比較 3 組患者的女方平均年齡、不孕年限、BMI、基礎FSH、雌二醇(estradiol,E2)、移植內膜厚度比較差異均無統計學意義(均P＞0.05)(表1)。

表1 各組患者基本臨床資料比較

2.2 3 組患者胚胎發育和臨床結局的比較 3 組患者間正常受精率隨著授精時間的延遲逐漸提高(P＜0.05)；C 組的多精受精率顯著低于A、B 組(P＜0.05)；3組間優質胚胎率、囊胚形成率、優胚囊胚形成率、臨床妊娠率、著床率、早期流產率和活產率差異均無統計學意義(均P＞0.05)；但3 組間卵子利用率差異有統計學意義，且隨著授精時間的推遲，卵子利用率逐漸增高(P＜0.05)(表2)。

表2 3 組患者受精結局的比較(%,n)

2.3 不同促排卵方案患者受精結局比較 由于IVF-ET 患者在HCG 注射后40～41 h 授精可獲得更好的胚胎發育結局，進一步對C 組中不同促排方案患者的受精結局進行分析，3 種主要促排方案包括長方案(周期=264)、短方案(周期=110)及拮抗劑方案(周期=988)。結果發現優胚囊胚形成率：長方案(49.22%)＞拮抗劑方案(45.99%)＞短方案(41.85%)(P＜0.05)；與短方案、拮抗劑方案患者相比，長方案患者的活產率最高(P＜0.05)。3 組用藥方案間正常受精率、多精受精率、優質胚胎率、囊胚形成率、卵子利用率、臨床妊娠率、著床率和早期流產率差異均無統計學意義(均P＞0.05)(表3)。

表3 C 組中不同促排方案患者受精結局比較(%,n)

2.4 不同胚胎培養體系患者受精結局比較 在最佳授精時間范圍內(HCG 注射后40～41 h)，對Vitrolife(周期=903)和Cook(周期=532)兩種胚胎培養體系中IVF-ET 患者的受精結局進行分析，結果發現Cook胚胎培養體系的優質胚胎率、優胚囊胚形成率、卵子利用率均顯著高于Vitrolife 胚胎培養體系(均P＜0.05)，兩組胚胎培養體系間正常受精率、多精受精率、囊胚形成率、臨床妊娠率、著床率、早期流產率和活產率差異均無統計學意義(均P＞0.05)(表4)。

表4 不同培養體系患者受精結局比較(%,n)

3 討論

近年來，輔助生殖技術發展迅速。特別是，為了提高IVF-ET 的成功率，通常需要進行COH 以對抗單卵泡發育過程來獲得可觀數量的卵母細胞，用于后續受精和ET。通常COH 周期中，取卵時會發現一些未成熟卵子，因此在胚胎實驗室，通常在獲卵和授精之間等待一段時間，由于顆粒細胞在卵泡發育和卵母細胞成熟中是必不可少的，顆粒細胞通過自分泌和旁分泌方式分泌各種細胞因子和類固醇激素影響卵母細胞的發育和成熟[13]。也有研究[14]支持延長體外培養時間可以促進卵母細胞充分成熟。同樣，授精前培養卵母細胞可能會進一步促使胞質成熟，從而使卵母細胞完全激活，獲得正常的發育潛能，進而可能會提高胚胎的受精率和臨床妊娠率[15]。

然而有研究[16]發現授精前卵母細胞過度培養可能伴隨紡錘體不穩定，導致一些不良后果，如胚胎質量差，受精率和臨床妊娠率降低。在人類中，卵母細胞的衰老與卵母細胞超微結構的變化有關：線粒體-光滑內質網聚集物減少，線粒體-囊泡復合物的大小和數量增加，皮質顆粒和微絨毛減少，紡錘體結構改變[17]。據報道[18]，取卵后與卵胞漿內單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)授精之間2～4 h 的體外培養可以改善卵母細胞成熟、受精率和胚胎質量。此外，與HCG 注射后38～39 h 和40～42 h 相比，HCG 注射后36～37 h 具有可見紡錘體的卵母細胞數量更少[19]，與無法看到紡錘體的卵母細胞相比，具有可見紡錘體的卵母細胞受精率更高。D.DOZORTSEV 等[6]發現卵母細胞的最佳授精時機是HCG注射后37～41 h，也有研究[7]發現，就受精率和妊娠率而言，ICSI 最佳時間是在HCG 注射后41～42 h。在較寬的時間范圍內，ICSI 對胚胎發育和臨床結局均無不良影響，這表明卵母細胞可能存在較長的受精窗口期[20]。

目前最佳授精時機尚未統一。董娟等[12]發現注射HCG 后38～42 h 授精獲得的臨床妊娠率和胚胎種植率均高于HCG 注射后42 h 授精的胚胎周期。本研究發現，在HCG 注射后38～41 h 范圍內授精，隨著授精時機的延遲，正常受精率逐漸提高(P＜0.05)，多精受精率逐漸降低(P＜0.05)。提示適當延長HCG 注射后的授精時間，有可能利于胚胎早期正常受精發育，分析可能原因是COH 周期中獲得的卵母細胞有一部分卵子未成熟，適當的延長體外培養時間，共培養的顆粒細胞分泌的各種細胞因子和類固醇激素促使卵母細胞和細胞質成熟，從而使卵母細胞完全激活，進而提高胚胎正常受精率降低多精受精率。但組間優質胚胎率、囊胚形成率、優胚囊胚形成率、臨床妊娠率、著床率、早期流產率和活產率差異均無統計學意義(均P＞0.05)，這與既往研究結果[12,21-22]相似。本研究還發現，隨著授精時間的推遲，卵子利用率逐漸增高(P＜0.05)，進一步驗證在一定時間范圍內，適當延遲授精增加卵子體外培養時間，可以促進卵子成熟，進而獲得更佳的胚胎發育結局和更高的卵子利用率。長方案患者的優胚囊胚形成率和活產率明顯高于短方案和拮抗劑方案(P＜0.05)，提示在最佳授精時間內，長方案患者可能獲得更好的胚胎發育和臨床結局，這與馬超等[23]的研究結果一致。同時，本研究還發現Cook 胚胎培養體系的優質胚胎率、優胚囊胚形成率和卵子利用率要優于Vitrolife 胚胎培養體系(P＜0.05)。提示在HCG 注射后40～41 h 進行授精，Cook 胚胎培養體系對胚胎發育有促進作用[24-25]。

綜上所述，IVF-ET 患者在一定時間范圍內(HCG 注射后38～41 h)，適當延遲授精時機可提高胚胎正常受精率和卵子利用率，降低多精受精率，但不影響臨床結局。在最佳授精時機內(HCG 注射后40～41 h 授精)，長方案患者的胚胎發育和妊娠結局更優，同時Cook 胚胎培養體系僅促進胚胎發育并不影響妊娠結局。

考慮到本生殖中心用藥方案以及HCG 注射時間較為集中，實驗室胚胎培養體系與其他生殖中心可能存在差異，導致不同生殖中心在IVF-ET 治療中HCG 注射后的最佳授精時間一直未能達到統一。本文也存在一些不足之處，由于實驗室標準操作規程，HCG 注射后41 h 以上的患者較少，缺少對其結果的對比分析，且缺少對IVF-ET 患者后代的出生周數、體質量、性別、順產與否等后續隊列數據的跟蹤報道，未對男性的一些基本臨床指標和精液常規進行研究，也未對凍融周期ET 的患者進行比較。因此，實際工作中可以根據患者情況選擇錯時注射HCG，錯時取卵，以便實驗室人員根據患者HCG 注射時間選擇最佳授精時機，后續工作也可以聯合多中心進行更詳細的HCG 注射時間分組以及隊列隨訪數據的比較，盡可能使患者獲得一個最佳的胚胎發育和妊娠結局，同時為臨床醫師提供較為細致的數據參考。