日本對蝦IKKβ基因克隆及其表達分析

范嗣剛 孫珍珠 郭靖 吳昊 鄧維德 李翔 黎源 陳燕飛 文菁

DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.06.025

摘要：【目的】明確日本對蝦NF-κB抑制蛋白激酶β基因（PjIKKβ）生物學特征及其在各組織和哈維弧菌刺激下的表達模式，為揭示IKKβ在日本對蝦先天免疫中的作用機制提供理論依據?！痉椒ā靠寺jIKKβ基因cDNA序列，通過ORF Finder、ExPASy ProtParam、SMART、SignalP 5.0、TMHMM、Prot-Comp等在線軟件進行生物信息學分析，并以實時熒光定量PCR檢測PjIKKβ基因在日本對蝦各組織及哈維弧菌懸液刺激后的表達模式?！窘Y果】PjIKKβ基因序列全長2794 bp，其開放閱讀框（ORF）長2373 bp，共編碼790個氨基酸殘基。PjIKKβ蛋白包含1個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域（S-TKc）、1個亮氨酸鋅指結構域（LZ）和1個螺旋—環—螺旋結構域（HLH），定位于細胞質和細胞核中，無跨膜結構，無信號肽。PjIKKβ與凡納濱對蝦IKKβ氨基酸序列相似性最高（98%），其次是與斑節對蝦IKKβ氨基酸序列（97%）；多序列比對分析結果顯示，各物種IKKβ蛋白序列在S-TKc結構域的保守性較高，而在其他區域的保守性低?；贗KKβ氨基酸序列相似性構建的系統發育進化樹顯示，在甲殼動物分支中日本對蝦先與凡納濱對蝦聚在一起，再與斑節對蝦聚為一個分支。PjIKKβ基因在日本對蝦肝胰腺、肌肉、鰓、神經節、胃、心臟、血淋巴和眼柄等8個組織中均有表達，以神經節、肌肉、血淋巴和眼柄中的相對表達量較高，顯著高于在其他組織中的相對表達量（P<0.05）；注射后24、48和72 h，PjIKKβ基因在注射哈維弧菌日本對蝦血淋巴中的相對表達量上調，且與注射PBS日本對蝦的相對表達量存在極顯著差異（P<0.01）?！窘Y論】PjIKKβ蛋白含有1個S-TKc 結構域、1個LZ結構域和1個HLH結構域，在進化過程中非常保守；PjIKKβ基因的組織表達特征及其在哈維弧菌刺激后的表達變化，進一步證實PjIKKβ基因參與了日本對蝦的先天免疫應答反應。

關鍵詞：日本對蝦；IKKβ基因；哈維弧菌；表達特征；先天免疫

中圖分類號：S945.45? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2023）06-1837-10

Cloning and expression analysis of IKKβ gene in Penaeus japonicus

FAN Si-gang1，2， SUN Zhen-zhu3， GUO Jing3， WU Hao3， DENG Wei-de3， LI Xiang3，

LI Yuan3，CHEN Yan-fei3， WEN Jing3*

（1Lingnan Normal University/Western Guangdong Engineering Research Center on Sustainable Utilization of Seafood

Resources，Zhanjiang，Guangdong? 524048，China；2South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou，Guangdong? 510300，China；3School of Biology and Agriculture，Shaoguan University，

Shaoguan，Guangdong? 512005，China）

Abstract：【Objective】To elucidate the biological characteristics of NF-κB inhibitory protein kinase-β gene （named PjIKKβ） in Penaeus japonicus and its expression pattern in various tissues and stimulated by Vibrio harveyi ， and to provide theoretical basis for revealing the mechanism of IKKβ in the innate immunity of P. japonicus. 【Method】 The cDNA sequence of PjIKKβ gene was cloned. The bioinformatics of PjIKKβ gene was analyzed by some online softwares， such as ORF Finder， ExPASy ProtParam， SMART， SignalP 5.0， TMHMM and Prot-Comp. The expression of PjIKKβ gene was examinated in various tissues under normal condition and in haemolymph after the treatment with V. harveyi by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The full length of PjIKKβ gene sequence was 2794 bp and the open reading frame （ORF） was 2373 bp which encoding 790 amino acid residues. PjIKKβ protein contained a serine/threonine protein kinases catalytic （S-TKc） domain， a leucine zipper （LZ） domain and a helix loop helix （HLH） domain. PjIKKβ protein was localized in cytoplasm and nucleus. No transmembrane structure and signal peptide were detected in PjIKKβ protein. PjKKβ protein shared the highest identity with IKKβ amino acid sequence of P. vannamei （98%） and P. monodon （97%）. Multiple sequence alignment analysis showed that S-TKc domain was highly conserved among various species and other domains were low conservation. The result of phylogenetic tree constructed based on IKKβ amino acid sequence showed that P. japonicus were clustered firstly with P. vannamei and then clustered with P. vannamei. PjIKKβ gene was ubiquitously expressed in all tested tissues （hepatopancreas， muscles， gills， ganglia， stomach， heart， hemolymph and eye stalk）. The highest expression level was detected in the ganglion， muscle， haemolymph and eye stalk. The expression of PjIKKβ gene in haemolymph was up-regulated at 24， 48 and 72 h after infected of V. harveyi and was extremely significantly different from that infected with PBS（P<0.01）. 【Conclusion】PjIKKβ protein contains a S-TKc domain， a LZ domain and a HLH domain， which is conservative in evolution. The expression of PjIKKβ in various tissues and its changes of expression after stimulation by V. harveyi indicate that PjIKKβ is involved in the innate immune response of P. japonicus.

Key words： Penaeus japonicus； IKKβ gene； Vibrio harveyi； expression feature； innate immunity

Foundation items：National Natural Science Foundation of China （31872571）； Guangzhou Municipal Science and Technology Plan Project （202206010138）； Guangzhou Rural Science and Technology Correspondent Project（2021 2100051）

0 引言

【研究意義】核因子κB（Nuclear factor-κB，NF-κB）能選擇性結合到B細胞κ-輕鏈編碼基因的調節區域而調控相關基因表達，參與生物體先天免疫和適應性免疫反應（Xu et al.，2022）。NF-κB抑制蛋白激酶（Inhibitor of NF-κB kinase，IKK）是一種常見的轉錄因子激活蛋白，被上游調控因子（Toll樣受體、白介素及脂多糖等）激活后參與調控NF-κB信號途徑，從而抵御病原體的侵襲（Negi and Sharma，2015；Jiang et al.，2018）。IKKβ是IKK家族的重要成員之一，是IKK復合物的主要催化亞基（Rothwarf et al.，1998）。在未受刺激的細胞中，IKKβ與IκBα（κB-α抑制劑）緊密結合，致使NF-κB核轉錄因子無法在細胞質中定位，而導致NF-κB無法啟動下游基因（Kai et al.，2014）。在受刺激的細胞中，IKKβ被一些受體信號通路中的激酶激活后催化IκBα蛋白磷酸化，導致IκBα降解。NF-κB與IκBα蛋白解離后進入細胞核，結合到與其相關的DNA反應元件上，激活目的基因的轉錄與翻譯，參與免疫細胞的發育及分化等生理過程（Oh et al.，2017；Zhao et al.，2018）。因此，研究IKKβ在機體免疫生理過程中的功能作用，對揭示生物體的免疫分子機制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】至今，脊椎動物IKK介導的信號轉導通路及免疫功能已得到系統研究，但在無脊椎動物中針對IKK的研究相對較少。果蠅（Drosophila melanogaster）的IKK家族與脊椎動物的類似，其中IRD5與IKKβ同源，通過IMD信號途徑參與免疫反應（Pomerantz and Baltimore，1999；Sun，2011）。Chen等（2011）研究發現傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV）感染MFF-1細胞后，鱖魚（Siniperca chuatsi）的IKKβ基因表達明顯上調。Huang等（2019）研究表明，太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）IKKα和IKKβ-2能誘導哺乳動物細胞中NF-κB、TNFα和 IFNβ的表達，從而啟動抵御細菌或病毒入侵的免疫反應。He等（2020）研究表明，石斑魚（Epinephelus coioides）感染副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）后，其體內的IKKα表達量增加。Li等（2020）研究發現海參（Holothuria leucospilota）的IKKβ轉染HEK-293T 細胞后能激活NF-κB活性，并誘導促炎細胞因子TNF-α和IL-1β分泌。Li等（2022）研究證實華貴櫛孔扇貝（Chlamys farreri）的IKK1是TLR信號途徑的重要轉導因子，參與先天免疫調控。此外，在凡納濱對蝦（Penaeus vannamei）、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）和斑節對蝦（P. monodon）等甲殼類動物中均發現IKKβ能激活NF-κB信號途徑（Wang et al.，2013；Jiang et al.，2018；Nhnhkorn et al.，2019），故推測IKKβ參與機體先天免疫反應過程?！颈狙芯壳腥朦c】日本對蝦（P. japonicus）又名花蝦或車蝦，個體大、色澤鮮艷、營養豐富、市場價格高，是我國重要的海水蝦類養殖品種之一，2020年的產量達4.2萬t（農業農村部漁業漁政管理局等，2021）。日本對蝦先天免疫的分子機制已有文獻報道（Cowley，2020；Ito et al.，2021），但有關IKKβ是否參與日本對蝦先天免疫的結論至今尚未明確?！緮M解決的關鍵問題】在線分析日本對蝦IKKβ基因cDNA序列及其編碼蛋白序列，并通過實時熒光定量PCR檢測IKKβ基因在日本對蝦各組織及哈維弧菌（V. harveyi）刺激下的表達模式，為揭示IKKβ在日本對蝦先天免疫中的作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

從廣東省徐聞縣對蝦養殖場購買500尾日本對蝦，平均體重24.3±1.5 g。隨機剪取4尾日本對蝦的心臟、眼柄、肝胰腺、鰓、神經節、胃和肌肉等組織樣品；同時用1 mL注射器加入30.0 μL ACD抗凝劑（檸檬酸鈉1.32%，檸檬酸0.48%，葡萄糖1.47%，溶于100 mL的ddH2O）抽取血淋巴，800 r/min離心10 min，棄上清液，即獲得血淋巴組織。所有組織樣品均以液氮冷凍保存。隨機挑選450尾肢體完整且富有活力的日本對蝦，置于1000 L塑料桶中養殖（海水鹽度34‰，水溫23 ℃），每個塑料桶養殖90尾，共5個塑料桶。每天按時按量投喂對蝦飼料，及時清除桶內的飼料殘留物和糞便，并更換1/2～2/3體積的海水。哈維弧菌由中國水產科學研究院南海水產研究所漁業生物病害防治研究室提供（蔣魁等，2016，2017）。

1. 2 哈維弧菌刺激試驗

日本對蝦暫養3 d后開始進行菌液注射試驗，分為試驗組和對照組，每組設3個平行，即每組有3個塑料桶（1000 L），每桶放養50尾日本對蝦。哈維弧菌懸液濃度1×106 CFU/mL。試驗組每尾日本對蝦注射50.0 μL哈維弧菌懸液，對照組日本對蝦注射等體積的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）。注射部位為腹部肌肉。注射后0、6、12、24、48和72 h各抽取5尾日本對蝦血淋巴組織，液氮凍存運回實驗室，-80 ℃冰箱保存備用。

1. 3 RNA提取及cDNA合成

采用TIRzol提取各組織樣品RNA，分別以1.2%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000檢測RNA完整性及其濃度。以Oligo（dT）18為反轉錄引物（表1），通過M-MLV反轉錄試劑盒合成肌肉組織cDNA第一條鏈，用于IKKβ基因cDNA序列驗證。使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）反轉錄合成cDNA，濃度稀釋至50 ng/μL，用于實時熒光定量PCR檢驗。

1. 4 IKKβ基因序列驗證

根據日本對蝦轉錄組數據（SRX2030618）獲得IKKβ基因片段，用引物IKKβ-S/IKKβ-R（表1）進行PCR擴增。PCR反應體系20.0 μL：10×Ex Taq Buffer（Mg2+ Plus）2.0 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.6 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA模板0.8 μL，Ex Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，ddH2O 13.8 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1min，進行35個循環；72 ℃延伸10 min。使用膠回收試劑盒（TaKaRa）純化回收PCR擴增產物，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果與轉錄組數據進行比對，以確定轉錄組測序結果的正確性。

1. 5 生物信息學分析

使用NCBI中的ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預測開放閱讀框（ORF）及其編碼氨基酸序列，運用Global Align分析氨基酸序列相似性；利用ExPASy ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）預測IKKβ蛋白理化特性及親水性；通過SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）預測蛋白結構域；應用SignalP 5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）預測蛋白信號肽；使用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預測蛋白跨膜結構；通過SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsaautomat.pl？page=npsasopma.html）和SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）分別預測蛋白二、三級結構；運用Prot-Comp（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？group=programs&subgroup=proloc&topic=protcomppl）預測蛋白亞細胞定位；利用Clustal Omega（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進行多重序列比對；并以MEGA 7.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育進化樹（Kumar et al.，2016），Bootstrap設為1000次。

1. 6 IKKβ基因表達模式分析

以qIKKβ-1s/qIKKβ-1a為引物，通過實時熒光定量PCR檢測IKKβ基因在日本對蝦各組織及哈維弧菌懸液刺激后的表達模式，在LightCycler@480 II（Roche）完成檢測分析。實時熒光定量PCR反應體系25.0 μL：2×SYBR Real-time PCR Master Mix（TaKaRa）12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA模板（50 ng/μL）1.0 μL，RNase-free H2O 10.5 μL。擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環。每個樣品均設3個平行，以β-actin為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算IKKβ基因相對表達量（Livak and Schmittgen，2001）。使用SPSS 19.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA），以Excel 2020制圖。

2 結果與分析

2. 1 PjIKKβ基因序列分析結果

基于轉錄組測序結果，經PCR擴增及測序驗證，獲得日本對蝦IKKβ基因cDNA序列（命名為PjIKKβ）。PjIKKβ基因序列全長2794 bp，其中，ORF長2373 bp，5'端非翻譯區（5'-UTR）長66 bp，3'端非翻譯區（3'-UTR）長355 bp，共編碼790個氨基酸殘基。PjIKKβ蛋白理論分子量為89327.78 Da，理論等電點（pI）為7.56，總親水性平均系數為-0.373，即該蛋白屬于疏水性蛋白。PjIKKβ蛋白含有1個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域（Serine/threonine protein kinases，catalytic domain，S-TKc）（位于第13～307位氨基酸處）、1個亮氨酸鋅指結構域（Leucine zipper domain，LZ）（位于第438～492位氨基酸處）和1個螺旋—環—螺旋結構域（Helix loop helix domain，HLH）（位于第528～615位氨基酸處）（圖1）。Prot-Comp預測結果表明，PjIKKβ蛋白定位于細胞質和細胞核中。PjIKKβ蛋白無跨膜結構，亦無信號肽。

SOPMA預測結果顯示，PjIKKβ蛋白二級結構中α-螺旋占52.28%、β-折疊占4.18%、無規則卷曲占32.66%、延伸鏈占10.88%（圖2）。以SWISS-MODEL對PjIKKβ蛋白三級結構進行預測，結果發現該蛋白三級結構與人類IKKβ蛋白的三級結構高度相似（圖3），說明IKKβ在進化過程中非常保守。

2. 2 PjIKKβ與其他物種IKKβ的比對分析結果

PjIKKβ氨基酸序列與其他物種IKKβ氨基酸序列進行比對，結果如表2所示。PjIKKβ與凡納濱對蝦IKKβ氨基酸序列相似性最高（98%），其次是與斑節對蝦IKKβ氨基酸序列（97%），與斑馬魚、小鼠和黑腹果蠅等模式動物的IKKβ氨基酸序列相似性分別為34%、35%和22%。多序列比對分析結果顯示，各物種IKKβ蛋白序列在S-TKc結構域的保守性較高，而在其他區域的保守性較低（圖4）?；贗KKβ氨基酸序列相似性構建的系統發育進化樹顯示，同類物種聚為一支，如甲殼動物聚為一支，昆蟲聚為一支，哺乳動物聚為一支；在甲殼動物分支中日本對蝦先與凡納濱對蝦聚在一起，再與斑節對蝦聚為一個分支（圖5）。

2. 3 PjIKKβ基因在日本對蝦不同組織中的表達情況

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，PjIKKβ基因在日本對蝦肝胰腺、肌肉、鰓、神經節、胃、心臟、血淋巴、眼柄等8個組織中均有表達（圖6），以神經節、肌肉和血淋巴和眼柄中的相對表達量較高，顯著高于在其他組織中的相對表達量（P<0.05，下同），而在胃、心臟和肝胰腺中的相對表達量較低。

2. 4 PjIKKβ基因在哈維弧菌刺激后的表達變化

采用實時熒光定量PCR檢測不同注射時段（0、6、12、24、48和72 h）日本對蝦血淋巴中的PjIKKβ基因表達變化，結果（圖7）顯示：與注射前（0 h）的PjIKKβ基因相對表達量相比，至注射后6和12 h試驗組和對照組日本對蝦血淋巴中的PjIKKβ基因相對表達量均呈下調趨勢；但注射后24、48和72 h，PjIKKβ基因在試驗組日本對蝦血淋巴中的相對表達量上調，與對照組日本對蝦血淋巴中的相對表達量存在極顯著差異（P<0.01）。注射72 h后，PjIKKβ基因在試驗組日本對蝦血淋巴中的相對表達量略有降低。

3 討論

本研究獲得的日本對蝦PjIKKβ基因序列全長2794 bp，其ORF長2373 bp，共編碼790個氨基酸殘基，較凡納濱對蝦和斑節對蝦的IKKβ基因少編碼1個氨基酸殘基（Wang et al.，2013；Nhnhkorn et al.，2019）。PjIKKβ蛋白含有1個S-TKc 結構域、1個LZ結構域和1個HLH結構域，與其他甲殼動物、海參等無脊椎動物的IKKβ蛋白結構相同（Wang et al.，2013；Jiang et al.，2018；Nhnhkorn et al.，2019；Li et al.，2020），說明無脊椎動物IKKβ蛋白結構非常保守。這些結構域是組成IKK復合物及產生催化功能的主要結構（Hinz and Scheidereit，2014）。此外，PjIKKβ氨基酸序列與其他對蝦的IKKβ氨基酸序列相似性高達97%～98%，與人類的IKKβ氨基酸序列相似性為34%，與黑腹果蠅的IKKβ氨基酸序列相似性最低（22%）。

為了解PjIKKβ基因在日本對蝦機體中的生物學功能，本研究采用實時熒光定量PCR檢測PjIKKβ基因在不同組織中的表達情況，結果表明，PjIKKβ基因在日本對蝦肝胰腺、肌肉、鰓、神經節、胃、心臟、血淋巴和眼柄等8個組織中均有表達，與IKKβ基因在其他動物中的組織表達特性（Chen et al.，2011；Wang et al.，2013；Jiang et al.，2018；Nhnhkorn et al.，2019）一致，說明IKKβ基因在生物體內的功能具有多樣性。IKKβ基因在凡納濱對蝦肌肉中的表達量遠高于其他組織，其次為神經節（Wang et al.，2013）；IKKβ基因在擬穴青蟹血淋巴、胃和心臟中的表達量較高（Jiang et al.，2018）；IKKβ基因在斑節對蝦血淋巴中的相對表達量最高（Nhnhkorn et al.，2019）。本研究結果表明，PjIKKβ基因在日本對蝦的神經節、肌肉、血淋巴和眼柄中的相對表達量較高，顯著高于在其他組織中的相對表達量，但至今鮮見有關IKK在水產動物肌肉和神經節方面的研究報道。在哺乳動物中，IKK通過NF-κB信號途徑調控肌肉生長（Bakkar et al.，2008）；在小鼠中依賴于IKK/NF-κB的神經膠質活化能誘導脊髓小膠質細胞活化及神經損傷后的神經性疼痛（Lim et al.，2017）。血淋巴是甲殼動物的重要免疫組織，通過機體的開放式循環系統流動于各組織間，參與機體的細胞免疫和體液免疫等先天免疫（Tassanakajon et al.，2013）。PjIKKβ基因在日本對蝦血淋巴中高表達，說明其可能參與日本對蝦的先天免疫。

本研究還分析哈維弧菌侵染日本對蝦機體后PjIKKβ基因在血淋巴中的表達變化，結果顯示，注射哈維弧菌后6和12 h，PjIKKβ基因在血淋巴中的相對表達量下調；至注射后24、48和72 h，注射哈維弧菌日本對蝦血淋巴的PjIKKβ基因相對表達量極顯著高于注射PBS日本對蝦的相對表達量。在凡納濱對蝦中，注射溶藻弧菌后IKKβ基因在血淋巴中的相對表達量呈先下降后上升的波動變化趨勢，但在各時間段的相對表達量均低于注射PBS的凡納濱對蝦（Wang et al.，2013）。在斑節對蝦中，注射哈維弧菌后PjIKKβ基因在血淋巴中的相對表達量先呈下降趨勢，注射24 h后開始上升，注射48 h的相對表達量明顯高于注射前（0 h），但與注射PBS的斑節對蝦相比無顯著差異（Nhnhkorn et al.，2019）?？梢?，IKKβ基因參與了甲殼動物的先天免疫應答反應。

4 結論

PjIKKβ蛋白含有1個S-TKc 結構域、1個LZ結構域和1個HLH結構域，在進化過程中非常保守；PjIKKβ基因的組織表達特征及其在哈維弧菌刺激后的表達變化，進一步證實PjIKKβ基因參與了日本對蝦的先天免疫應答反應。

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（責任編輯 蘭宗寶）

收稿日期：2022-08-03

基金項目：國家自然科學基金項目（31872571）；廣州市科技計劃項目（202206010138）；廣州市農村科技特派員項目（20212100051）

通訊作者：文菁（1982-），https：//orcid.org/0000-0001-8169-7740，博士，教授，主要從事海洋生物學研究工作，E-mail：jw82123@126.com

第一作者：范嗣剛（1982-），https：//orcid.org/0000-0002-4265-4964，博士，副研究員，主要從事海洋生物學研究工作，E-mail：fansigang @cscfri.ac.cn