桑葉非結構性碳水化合物的測定對比研究

劉 巖，林天寶，盧紅伶，朱 燕，計東風，呂志強

（浙江省農業科學院 蠶桑與茶葉研究所，浙江 杭州 310021）

碳水化合物是植物生長發育過程中主要的碳源和供能物質［1］，占干物質總量的90%以上，對植物生命活動有著極其重要的作用。碳水化合物包括結構性碳水化合物和非結構性碳水化合物兩大類。其中，非結構性碳水化合物是光合作用的主要同化產物，其合成、運輸和積累很大程度上決定植物能量循環、生長發育和對環境的適應能力，是參與植物生命代謝的重要物質［2-3］。非結構性碳水化合物主要包括葡萄糖、果糖、蔗糖等可溶性糖（Soluble sugars，SS）和淀粉（Starch，ST）2類物質?？扇苄蕴强芍苯訁⑴c植物生長、代謝過程，并具有調節細胞滲透壓的作用；淀粉可作為短期或長期貯存的碳源，供給植物生長所需，可溶性糖與淀粉兩者之間還可以相互轉換［4-5］。

桑樹是一種多年生深根性木本闊葉型經濟林木，在我國有悠久栽培歷史。桑葉作為家蠶完成全世代生長的天然飼料，是影響繭絲綢產業發展的重要物質基礎。我國作為種桑養蠶大國，蠶桑生產遍及全國1 000余縣，蠶桑產業還在脫貧攻堅、鄉村振興和特色產業發展中起到重要作用［6-7］。近年來，隨著國家“一帶一路”重要倡儀的實施推進，以及桑樹除了用來養蠶外，還在醫藥、食品、生態等領域進行了多元化拓展，桑樹產業迎來新的發展機遇。生產上對適宜不同生長環境的優質高產高抗桑樹品種需求增加，而碳水化合物的含量和轉運分配與植物產量、品質相關，碳水化合物還參與鹽、旱、澇等逆境脅迫適應性。測定桑樹非結構性碳水化合物含量具有重要生產指導意義。然而，目前對桑葉中非結構性碳水化合物測定方法報道較少。為此，本研究開展對比分析和優化桑葉非結構性碳水化合物的測定方法，為今后開展桑樹理化性質研究和品種相關的生產應用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以資源圃種植10 年生的‘強桑1 號’桑樹品種為研究對象，于2022年5月中旬采集枝條自上而下第4～7位完全展開葉片，清洗干凈并擦干，液氮研磨后-80 ℃低溫冷凍保存，備用。

1.2 可溶性糖抽提

1.2.1 乙醇抽提法

參考文獻［8］方法進行改進方法如下：取適量冷凍保存的桑葉粉，加入1.4 mL體積分數為80%的乙醇，70 ℃分別恒溫振蕩，10 000g離心10 min，收集上清液用于可溶性糖的測定。

1.2.2 甲醇抽提法

參考文獻［9］取適量冷凍保存的桑葉粉，加入1.4 mL的75%（V/V）甲醇，70 ℃分別恒溫振蕩抽提，10 000g離心10 min，上清液吸出并分別轉入10 mL離心管，加入1.5 mL預冷的雙蒸水和750 μL的三氯甲烷，充分渦旋振蕩，10 000g離心10 min，收集上層上清液用于可溶性糖的測定。

參考文獻［10-11］方法，取適量冷凍保存的桑葉粉，加入1.4 mL 的MCW 抽提液（甲醇∶氯仿∶水=12∶5∶3，體積比），70 ℃恒溫振蕩抽提，10 000g離心10 min，各組上清液吸出并分別轉入2 mL離心管，加入800 μL 預冷的雙蒸水，充分渦旋震蕩，10 000 g離心10 min，收集各組上清液用于可溶性糖的測定。

1.2.3 可溶性糖抽提條件的優化對比

設置不同抽提時間（0.5、1、3 h）和不同抽提次數，檢測對比優化可溶性糖抽提條件。

1.3 淀粉抽提

參考文獻［8］報道的淀粉測定方法，將上述可溶性糖抽提離心后的沉淀殘渣，在通風處干燥10 min，然后各管分別加入1 mL熱蒸餾水，沸水浴煮15 min，然后再加入0.5 mL 9.2 mol/L的高氯酸溶液，沸水攪拌15 min。室溫自然冷卻后，4 000 r/min離心5 min，收集上清液測定淀粉含量。

1.4 蒽酮比色法測定碳水化合物含量

配制硫酸蒽酮溶液，利用蒽酮比色法［12］，配制不同濃度葡萄糖和可溶性淀粉溶液，取標準液或一定稀釋后的抽提液，加入3倍體積的蒽酮試劑，混勻后沸水浴中5 min，然后水浴冷卻至室溫，在分光光度計測定D（620 nm）值，根據繪制標準曲線計算可溶糖和淀粉含量。

1.5 數據分析

可溶性糖與淀粉兩者含量之和即為非結構性碳水化合物含量，兩者之商即為SS/ST［13-14］。測得的可溶性糖、淀粉和非結構性碳水化合物含量及SS/ST實驗數據采用Excel 進行數據的統計與分析，用OriginPro 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 基于乙醇抽提的可溶性碳水化合物含量檢測

利用80%乙醇對桑葉樣品的可溶性碳水化合物進行抽提，檢測數據顯示隨著振蕩抽提時間的延長，檢出可溶性碳水化合物濃度逐漸增加（圖1）。上述抽提液經氯仿萃取處理后，可溶性碳水化合物溶液脫色明顯；脫色后測定可溶性碳水化合物含量略有下降，這可能與色素干擾測定結果有關。

圖1 乙醇法抽提可溶性碳水化合物Fig. 1 The extraction of water soluble carbohydrates based on ethanol

2.2 基于甲醇抽提的可溶性碳水化合物含量檢測

由檢測數據（圖2）顯示，隨著抽提時間的延長，甲醇介導的可溶性碳水化合物抽提檢測得率呈現增加；比較75%甲醇和MCW 介導的方法發現，本研究單次抽提0.5-3 h的處理時，前者檢測可溶性糖水化合物含量水平高于后者，但隨著抽提次數的增加，利用MCW 方法組抽提得率增加顯著，而利用75%抽提的樣品僅在抽提1 h 重復2 次組呈現相對明顯的檢測值增加。

圖2 甲醇法抽提可溶性碳水化合物Fig. 2 The extraction of water soluble carbohydrates based on methanol

2.3 不同方法測定的淀粉含量

對上述不同方法抽提可溶性碳水化合物后的殘渣，烘干后利用高氯酸介導的方法抽提淀粉，并結合硫酸蒽酮方法測定淀粉含量。結果（圖3）顯示，隨著抽提時間的延長，淀粉含量測量值呈現下降趨勢，與測得的可溶性碳水化合物趨勢不同。

圖3 淀粉含量測定對比Fig. 3 Comparison of the starch content treated with different method

3 討論

非結構性碳水化合物是植物體內碳水化合物的一種重要存在形式，在植物生長代謝中起重要作用［5］。本研究利用80%乙醇、75%甲醇和MCW 介導的不同抽提方法，并設置不同抽提條件對桑葉中非結構性碳水化合物含量進行對比檢測分析。從結果的綜合對比來看，乙醇抽提方法獲得的非結構性碳水化合物濃度最高，其次是MCW 抽提產物，75%甲醇抽提得到產物濃度最低；從可溶性碳水化合物與淀粉含量的比率對比發現，75%甲醇單次抽提組SS/ST高于乙醇和MCW處理組，且多次抽提組的SS/ST數值更高，提示利用甲醇介導抽提可溶性糖分的方法的更完全，這與Wang 等在蘋果糖分檢測分析中的報道一致［9］。另外，盡管本研究中乙醇抽提產物中測定可溶性糖分含量高于另外2 種測定方法，但經三氯甲烷萃取脫色后，可溶性糖的測定值下降（圖1）。推測這可能與抽提產物中葉綠素素含量較高，影響可溶性碳水化合物測定，以及非結構性碳水化合物總量和比值的統計有關。綜合對比分析后發現，MCW多次重復抽提和75%甲醇抽提的及檢測效果更佳；其中，75%甲醇抽提方法更為高效快速，適合用于桑葉非結構性碳水化合物的測定分析。

非結構性碳水化合物與植物器官間碳平衡、以及逆境脅迫條件下的響應性都密切相關［4］。植物各器官中非結構性碳水化合物的濃度與不同生長環境下的植物光合固碳以及呼吸分泌等的耗碳相關［15］，對維持樹木滲透調節、生長發育，以及植物氮吸收能力和環境脅迫反應都具有重要作用［16］。我們前期研究已發現，受鹽、旱共脅迫后，桑苗總碳含量在源器官葉片中下降，在庫器官根部中增加；源庫器官中差異表達蛋白主要富集在蔗糖等代謝通路［17］。碳水化合物相關代謝通路在雜交桑受干旱脅迫反應中也起重要作用［18］。李思源等也報道桑苗幼苗葉片內可溶性糖含量隨水淹時間增加呈現先增后減趨勢，具有一定耐水淹能力［19］。Mac-Neill 等認為淀粉濃度的升高也提升了林木抗旱能力［4］，這可能與脅迫條件有關，光合固碳能力下降后，植物選擇優先將光合產物貯藏起來，并分配參與滲透調節等過程，來抵抗脅迫環境有關［15］。這種非結構性碳水化合物含量和分配的調整，在一定程度上反映植物響應逆境脅迫影響的變化，這與能量釋放、細胞滲透調節有關，進而在植物生長和脅迫響應方面具有的重要影響作用［20-21］。

鑒于可溶性糖和淀粉在植物生命活動過程中起重要作用，今后可在本研究確立適合桑葉樣品中的檢測方法基礎上，利用高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）或 氣相色譜（Gas chromatography，GC）等技術進一步分析可溶性碳水化合物各組分含量，再結合現代組學等生物技術，鑒定分析糖代謝關鍵性功能及基因，深入開展桑樹糖代謝相關的生理學、逆境生物學以及生產品種的選育工作。