稻田土壤可溶性有機碳熒光組分對砷甲基化的影響

李令儀，張楠，張洋，吳翠霞，曾希柏，蘇世鳴

（中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所/農業農村部農業農村生態環境重點實驗室，北京 100081）

砷（As）是一種廣泛存在于環境中的有毒類金屬元素，通常以無機態砷包括砷酸鹽[As（Ⅴ）]、亞砷酸鹽[As（Ⅲ）]和有機態砷如一甲基砷（MMAs）、二甲基砷（DMAs）和三甲基砷（TMAsO）等形式存在[1]。不同形態砷的毒性差異較大，一般認為無機砷的毒性遠高于有機砷，其中As（Ⅲ）毒性約是As（Ⅴ）的25～60倍，約是有機砷的70 倍[2]。稻田淹水后As（Ⅴ）易還原為As（Ⅲ），從而增加了砷的移動性與活性[3]，而水稻根系可分別通過磷酸鹽和硅酸鹽的通道蛋白實現對As（Ⅴ）和As（Ⅲ）的吸收，進而造成水稻對砷的累積[3-4]。有研究發現，與其他類型作物如葉類蔬菜、玉米等的可食部位砷累積狀況相比，稻米中砷含量高出10～22 倍[5]。稻米是我國特別是南方地區居民飲食的主要作物，也是人體通過食物鏈攝入砷的主要來源[6-7]。

水稻直穗病是水稻穎殼畸形病變造成無法成功灌漿，表形為稻穗直立，可造成水稻減產甚至絕產[8-9]。近年來研究發現，水稻籽粒穎殼中積累較多的DMAs 是導致直穗病發生的主要原因[9]。然而水稻植株本身不會合成有機砷，其主要是通過根系吸收土壤中的DMAs，DMAs 在根系中具有較高的向上轉運能力，從而導致水稻穎殼和籽粒中DMAs 過量積累[10]。研究表明，土壤微生物通過胞內arsM基因編碼的S-腺苷甲硫氨酸甲基轉移酶（SAM）使As（Ⅲ）發生甲基轉化，主要依次產生MMAs、DMAs和TMAsO[2，11]。稻田土壤中影響砷甲基化的因素有很多，例如底物As（Ⅲ）濃度水平[12]、arsM功能微生物活性[11]、水分狀況[13]、溫度[12]以及有機質含量狀況[14]等。砷超標稻田施用有機物料不僅易造成孔隙水As（Ⅲ）濃度增加，還易增加砷甲基轉化效率和水稻籽粒累積As（Ⅲ）和DMAs的風險[15]。不同類型及不同投入量的有機物料對砷甲基化過程的促進作用存在明顯差異[16-17]，這可能是由于有機物料分解后的有機碳分子組成、性質和含量存在差異，進而導致其介導砷甲基轉化過程差別化。Yan 等[18]研究發現，稻田土壤中砷甲基化效率隨著可溶性有機物中烷基碳、羧基碳等活性碳官能團豐度的增加而顯著提高。田翔等[19]發現秸稈和牛糞的分解產物的芳香性、疏水性和腐殖化水平存在明顯差異，芳香性較高的有機質會絡合甲基汞，降低其植物可利用性。Lei 等[20]的研究表明藻類分解過程中芳香性低的富氧富氮小分子碳，如芳香蛋白類有機物，提高了攜帶有汞甲基化基因的微生物豐度，從而提高了湖泊中的汞甲基化效率。目前稻田土壤中可溶性有機碳組成特征與甲基砷產生的關聯性仍未明確，該工作對于探索稻田砷甲基化過程的可能影響因素及服務于今后水稻直穗病的發生預警均具有重要意義。

三維熒光光譜（3DEEM）技術在有機質成分表征方面的應用發展迅速，熒光區域積分（FRI）法是常用的解譜方法，可對復雜體系中的熒光組分進行識別，并通過積分獲得其相對濃度[21]。本實驗選取砷污染水稻土壤為研究對象，通過室內培養模擬開展相關工作，一是分析稻田孔隙水培養前后有機砷含量及總有機碳（TOC）變化，二是利用三維熒光光譜技術表征培養后溶液中有機碳分子熒光組分特征，并嘗試探索其與甲基態砷的相關性。

1 材料與方法

1.1 供試材料及其理化性質

供試土壤采自浙江省紹興市上虞地區（29°59′N，120°47′ E）砷污染水稻土壤，母質類型為粗松咸砂土。土壤樣品經自然風干后混合均勻，去除植物殘根和石礫，用瑪瑙研缽研磨后過2 mm 和0.25 mm 尼龍篩備用。供試土壤總砷含量為96.7 mg·kg-1，全鐵含量為19.7 g·kg-1，全錳含量為435.0 mg·kg-1，總氮含量為2.2 g·kg-1，有機質含量為33.6 g·kg-1，陽離子交換量為43.2 cmol·kg-1，pH值為5.8。

水稻秸稈和豬糞取自中國農業科學院岳陽農業環境科學觀測實驗站，實驗前水稻秸稈切碎研磨成粉末，豬糞自然風干研磨后過20 目（0.850 mm）篩備用。秸稈和豬糞在施用前均利用γ 射線物理滅菌，避免帶入生物污染。

1.2 實驗設計

為模擬稻田土壤不同類型和不同添加量的有機物料還田營造的復雜有機碳環境，實驗設計了2 種有機物料處理和3 種投入量水平。為研究培養過程中土壤溶液甲基砷含量變化與有機碳熒光組分特征變化之間的可能關聯，減少土壤膠體本身對溶液中有機碳分子的可能補給與固定的影響，實驗以土壤浸提液培養的方式開展。實驗過程如下：將滅菌后的秸稈粉末和豬糞粉末與30 g供試土壤充分混合，秸稈施用量分別為0.375、0.750 g 和1.500 g（分別標記為RS、2RS和3RS），豬糞施用量分別為0.470、0.940 g 和1.880 g（分別標記為PM、2PM 和3PM），有機物料施用量按TOC 添加量分別為土壤質量的0.5%、1.0%和1.5%計算得到，以不添加任何有機物料的供試土壤作為對照（CK），各處理設置3 個重復。將各處理土壤放進100 mL 離心管，在30 ℃的黑暗環境中進行恒溫淹水培養，保持土面以上2 cm 的靜水層，每日通過稱質量補充水分，保持水分不變。土壤培養7 d 以后，以4 000 r·min-1離心20 min，靜置后提取25 mL 上清液，轉移到血清培養瓶中，在液面以上充氮氣5 min，趕走上層空氣，營造相對厭氧環境，并于30 ℃恒溫靜置培養。培養4 h 和5 d 時分別收集溶液樣品，用于砷形態、TOC含量測定，考慮工作量原因，將培養5 d后的各添加量水平的3 個重復樣品混合均勻后用于三維熒光光譜分析。

1.3 樣品分析與測定

砷形態分析：溶液樣品過0.22 μm 濾膜后，取1 mL 待測液添加200 μL H2O2（30%）氧化樣品15 min，使用高效液相電感耦合等離子體質譜儀（HPLCICP-MS，Agilent 7900，美國）測定各砷形態的濃度。為提高砷形態分析質量，測樣時每間隔10 個樣品檢測一次As（Ⅲ）單標溶液（GBW08666，中國計量科學研究院），本實驗中各批次單標溶液回收率達97%。

TOC 測定：溶液樣品過0.22 μm 濾膜后，采用同步TOC/N 分析儀（Multi C/N 2100 S，Jena Analytik Jena，Jena，德國）測定樣品中的TOC。

三維熒光光譜測定：溶液樣品過0.45 μm 濾膜后，使用穩態熒光光譜儀（FLS1000，英國愛丁堡公司）掃描三維熒光光譜。以去離子水為空白，激發波長（Ex）范圍為200～450 nm，增量為5 nm，發射波長（Em）范圍為250～600 nm，掃描信號積分時間為3 s，光源為150 W 氙弧燈。采用熒光區域積分法[21]對溶液中的成分進行半定量分析，5 個積分區域分別為芳香蛋白類Ⅰ（APⅠ，Ex 為220～250 nm，Em 為280～330 nm）、芳香蛋白類Ⅱ（APⅡ，Ex 為220～250 nm，Em 為330～380 nm）、富里酸類物質（FA，Ex 為220～250 nm，Em 為380～550 nm）、可溶性微生物副產物（SMP，Ex為250～340 nm，Em 為280～380 nm）和腐植酸類物質（HA，Ex 為250～280 nm，Em 為280～550 nm）。其他熒光光譜的特征參數計算方法見表1。

表1 特征參數計算方法Table 1 Description of commonly used characteristic parameters of fluorescence spectra

1.4 數據處理

采用Excel 2016 和SPSS 23.0 軟件對數據進行統計分析，Origin 2021 進行繪圖和PCA 分析，將原始三維熒光光譜數據進行轉化矯正并扣除空白后用Matlab 2016a軟件對數據進行熒光區域積分分析。

2 結果與分析

2.1 土壤溶液甲基砷含量變化

土壤溶液厭氧培養4 h 和5 d 時相比較（圖1A），2RS、PM 和3PM 處理總砷（無機砷和甲基砷）濃度無顯著差異（P＞0.05），而CK、RS、3RS 及2PM 處理培養5 d 后總砷濃度相比4 h 時分別顯著增加20.8%、26.2%、23.3%和5.4%。添加有機物料處理的土壤溶液中具有相對更高的甲基砷濃度，但不同類型有機物料處理后土壤溶液砷甲基化過程的激發作用不同，添加秸稈粉末后土壤溶液的甲基砷濃度增幅明顯高于添加豬糞處理。CK 處理培養5 d 后溶液中甲基砷濃度比培養4 h 時僅增加了7.1μg·L-1；秸稈處理下，培養5 d 后RS、2RS、3RS 處理甲基砷濃度分別增加了13.7、9.6 μg·L-1和13.3 μg·L-1，增幅分別為40.3%、24.2%和24.0%；豬糞處理3 種添加量水平下溶液甲基砷增加量要明顯低于秸稈處理，培養5 d 后PM、2PM、3PM 處理甲基砷濃度分別增加了4.3、2.0μg·L-1和1.3μg·L-1，增幅分別為15.5%、6.9%和3.8%。

圖1 不同有機物料處理及不同添加量水平下土壤溶液中各砷形態濃度Figure 1 Concentrations of arsenic in soil solution with addition of different types and does of organic materials

進一步分析各甲基態砷濃度變化發現，DMAs 濃度在各處理的甲基砷形態中比例最高，其在各處理培養前后占比達到64.4%～78.4%（圖1B）。各處理土壤溶液厭氧培養4 h 和5 d 時比較：CK 處理DMAs 濃度僅增加了5.0 μg·L-1，增幅為44.0%；秸稈處理下，培養5 d 后PM、2RS、3RS 處理DMAs 濃度分別增加了11.2、7.4 μg·L-1和13.2 μg·L-1，增幅分別為43.4%、26.6% 和37.0%；豬糞處理下PM、2RM、3RM 處理DMAs 濃度分別增加了2.3、3.2 μg·L-1和3.2 μg·L-1，增幅分別為11.9%、16.0%和12.6%。

2.2 土壤溶液TOC濃度及其與甲基砷的相關性

添加有機物料顯著提高土壤溶液中TOC 濃度（圖2A）。培養開始時（4 h），CK處理土壤溶液TOC濃度為244.3 mg·L-1，而秸稈或豬糞處理TOC 濃度均高于CK處理，且隨著有機物料添加量增加而明顯提高。RS、2RS、3RS 處理土壤溶液中TOC 濃度分別為306.2、386.1 mg·L-1和538.0 mg·L-1，PM、2PM、3PM 處理土壤溶液中TOC 濃度分別為339.2、443.8 mg·L-1和588.5 mg·L-1，秸稈處理土壤溶液中TOC 濃度明顯高于豬糞處理。培養5 d 后，各處理溶液中TOC 濃度明顯降低，其中秸稈處理土壤溶液中TOC 消耗量明顯高于豬糞處理。進一步分析發現，各處理TOC 消耗量（ΔTOC）與甲基砷增加量（Δ 甲基砷）呈顯著正相關（P＜0.05，圖2B）。

圖2 土壤溶液TOC濃度變化及其與甲基砷變化量的相關性Figure 2 Concentration of TOC in soil solution and the correlation between the consumed TOC（ΔTOC）and methylated As（ΔMethylated As）

2.3 土壤溶液TOC熒光光譜特征

為解析各處理土壤溶液中可溶性碳分子的組分性質差異，本文進一步基于熒光指數（FI）、自生源指數（BIX）和腐殖化指數（HIX）開展分析。已有研究表明：FI＞1.9，主要為微生物活動所產生的內源可溶性有機質（DOM），自生源特征明顯；FI＜1.4，主要為以陸源輸入的外源性DOM，自身生產力和微生物活動等貢獻相對較低[21，25]。如圖3A所示，所有處理的土壤溶液在厭氧培養5 d后FI值均在1.4～1.9之間，說明溶解性有機碳的來源既包括陸源輸入又包括自生源。CK處理的FI值為1.60，秸稈處理3 個添加量水平下的FI值分別為1.64（RS）、1.75（2RS）和1.72（3RS），說明添加秸稈處理的土壤溶液中自生源有機碳的成分較多，且2RS 處理的FI 值最高，表明其微生物的生命活動最為活躍。而豬糞處理3 個添加量水平下的FI 值分別為1.58（PM）、1.52（2PM）和1.55（3PM），均低于CK處理，說明在豬糞處理的土壤溶液有機碳中微生物活動的貢獻相對較低，且隨著豬糞添加量的增加，自生源成分反而減少。此外，BIX 指數越高，自生源特征越明顯，蛋白組分的貢獻越大，生物可利用性越高[26]。本研究中，CK 處理的BIX 指數為0.43（圖3B），秸稈處理3 個添加量水平下的BIX 值分別為0.45（RS）、0.54（2RS）和0.45（3RS），豬糞處理3 個添加量水平下的BIX 值分別為0.40（PM）、0.37（2PM）和0.35（3PM），表明在本實驗條件下，秸稈分解產生的生物可利用成分多于豬糞。HIX 指數用來指示有機碳的腐殖化程度，指數越高，腐殖化程度越高，生物可利用性越低[27]。CK 處理土壤溶液厭氧培養5 d 后HIX 值為17.89（圖3C），秸稈處理3 個添加量水平下土壤溶液HIX 值分別為15.03（RS）、9.54（2RS）和13.10（3RS），均明顯低于CK 處理。比較來看，2RS 處理中土壤溶液的腐殖化程度最低，表明添加適量秸稈會降低土壤溶液中有機碳的腐殖化程度，有利于微生物分解利用。而添加豬糞則會明顯提高土壤溶液中有機碳的腐殖化水平，其不同添加量水平下的HIX 值分別為26.83（PM）、28.68（2PM）和28.31（3PM）。

圖3 土壤溶液TOC熒光特征指數Figure 3 Characteristic parameters of fluorescence spectra of TOC in soil solution

2.4 土壤溶液TOC 三維熒光組分及其與甲基砷的相關性

通過熒光區域積分計算分析了培養5 d后不同處理及添加量的土壤溶液三維熒光組分積分標準體積（圖4A），發現各處理土壤溶液TOC 的主要熒光組分為HA、SMP和FA，而APⅠ和APⅡ兩類有機物占比較小。秸稈處理的土壤溶液中可檢測到的熒光組分總強度均明顯高于CK 和豬糞處理，且隨秸稈添加量增加，熒光組分總強度增大；豬糞處理的土壤溶液中熒光組分總強度與CK 處理相比差異較小，其中2PM 處理的熒光組分總強度低于CK處理。各處理中含量最高的TOC 組分為HA，占比達82.2%～89.5%，且豬糞處理的HA 占比明顯高于秸稈處理。各處理中SMP、FA、AP Ⅰ和AP Ⅱ占比分別為9.3%～15.1%、2.1%～2.8%、0～0.1%和0.1%～0.2%。秸稈處理3種添加量下的SMP、APⅠ和APⅡ組分熒光積分分別為1.2×106～1.8×106、4.0×103～6.9×103AU-nm2和1.5×104～2.3×104AU-nm2，均分別高于豬糞處理的5.7×105～8.4×105、1.5×103～2.9×103AU-nm2和4.6×103～8.3×103AU-nm2。

圖4 5種有機組分熒光區域積分及不同處理土壤溶液有機組分主成分分析Figure 4 Five organic carbon components identified by fluorescence regional integration（FRI）method and the principal component analysis of organic carbon components among different treatments

為進一步分析土壤溶液中TOC 不同熒光組分對處理的響應程度，采用主成分分析法將各處理間TOC組分差異性進行可視化（圖4B）。第1、2 主成分方差貢獻率分別為86.0%、12.6%，對實驗變量的總解釋度達到98.6%。秸稈和豬糞處理后土壤溶液TOC 在組分上存在明顯差異，且在相同處理不同添加量下亦存在一定差異，但這種差異小于有機物料類別之間的差異。進一步將土壤溶液中熒光光譜特征參數、熒光組分區域積分結果和土壤溶液中甲基砷濃度進行相關性分析，發現FI 指數、APⅡ、FA、HA 區域積分與甲基砷濃度顯著正相關（P＜0.05），而HIX 指數與甲基砷含量為負相關關系（圖5）。

圖5 熒光光譜特征參數及熒光組分區域積分結果和土壤溶液中甲基砷的相關性分析Figure 5 Correlation analysis of spectral characteristic parameters，organic carbon components and the methylated As in soil solution

3 討論

本研究選擇秸稈和豬糞作為植物源和動物源有機物料，將其施入稻田土壤淹水培養后，提取其土壤溶液開展培養實驗，結果發現2RS、PM、3PM 處理培養4 h和5 d時的溶液總砷濃度無顯著差異，但在CK、RS、3RS 及2PM 處理中有顯著增加。這可能是由于土壤溶液中混有的少量土壤顆粒溶解釋放砷所致，因土壤膠體固定的砷形態主要以無機砷為主[15]，故該現象并不影響對土壤溶液中砷甲基化的研究。研究發現在淹水土壤中施入兩種有機物料后土壤溶液中甲基砷與TOC 濃度均顯著提高，兩者均表現出隨物料添加量增加而增加的趨勢，且厭氧培養前后的TOC消耗量與甲基砷增加量顯著正相關。該結果表明溶解性有機碳作為厭氧環境下砷甲基化微生物的有效碳源，很可能與甲基砷的產生存在關聯。該結果與Yan等[18]報道的結果一致，即添加有機物料源DOM 可以顯著提高稻田土壤中砷的甲基化效率，其主要是通過增加砷甲基化底物濃度及arsM功能微生物豐度的方式實現。Afroz 等[28]亦發現稻田土壤中施用豬糞可以顯著提高土壤孔隙水中甲基態砷濃度，同時增加水稻地上部對甲基砷的吸收。本研究兩種有機物料比較來看，厭氧培養后秸稈處理土壤溶液中消耗的TOC明顯高于豬糞處理，這可能與不同來源有機物料發酵產生的可溶性有機碳分子的微生物利用度存在差異有關。羅雪婷等[29]研究發現，秸稈分解后的有機碳的主要類型為多糖類、蛋白質類、芳香類和氨基酸類；田翔等[19]的研究表明牛糞等動物源有機質芳香性和腐殖化程度明顯高于秸稈源有機質。一般認為，芳香性和腐殖化程度高的有機碳分子相對較難被微生物利用，相反低腐殖化程度的有機碳分子更易被微生物同化[23]。研究還發現，厭氧培養末期，和豬糞處理相比，秸稈處理土壤溶液中有機碳自生源特征明顯，蛋白類等生物可利用性組分含量多，腐殖化程度低。通過參考前人研究進行推測，該結果可能是本實驗中秸稈處理通過提供相對更高的低腐殖化程度的有機碳分子，促進了微生物的同化作用，從而產生了相對更高的自生源有機碳組分，該過程中很可能激發了砷甲基化功能微生物的活性，從而產生了相對更高的甲基態砷[30]，該推測還需開展進一步驗證。

本研究利用三維熒光技術表征了不同處理土壤溶液中有機碳分子的熒光組分，發現熒光區域積分結果與熒光特征指數規律有很好的印證關系。各處理中相對含量最高的熒光組分均為HA，且豬糞處理的HA占比高于秸稈處理，這與HIX指數的結果一致，豬糞分解產生的有機碳腐殖化程度高于秸稈分解產生的有機碳。SMP主要是微生物代謝活動產生的物質，對自生源有機碳貢獻較大[21]，其在本實驗秸稈處理中占比明顯高于豬糞處理，這亦與BIX 指數結果一致。比較來看，豬糞處理土壤溶液中HA 和FA 兩種有機物在總熒光物質中占比高于秸稈處理，而秸稈處理土壤溶液中APⅠ、APⅡ和SMP 3 種有機組分的相對濃度高于豬糞處理。這可能是因為豬糞是機體系統消化分解的產物，易分解的蛋白類組分已經被消耗，能提供的生物可利用性有機碳含量相對較低[31]。本研究中，2PM處理的熒光組分總強度低于CK處理，這可能是因為腐殖化程度增加，結構復雜且穩定的大分子有機物趨于生成，并被土壤顆粒吸附沉淀，從而導致沒有被熒光檢測到，這也可以在一定程度上解釋豬糞添加量越高，自生源成分相對越少的現象。豬糞添加量越高，土壤溶液中有機碳腐殖化程度越高，越不利于微生物分解利用，所以產生的微生物副產物等自生源成分越低[27]。

添加秸稈和豬糞對砷甲基化過程的促進作用存在差異，這可能是由于有機物料分解后產生的溶解性有機碳組成和性質存在差異。這也在汞甲基化過程中被證實，Graham等[32]認為來自陸地生態系統的有機物對汞甲基化的促進作用高于來自水生生態系統的有機物。Lei等[20，33]研究發現，APⅠ、APⅡ和SMP這類芳香性和腐殖化程度低的小分子不穩定碳可作為微生物甲基化的激發劑，促進環境中更多甲基汞的生成。本研究中亦發現秸稈處理的SMP、APⅠ和APⅡ組分均明顯高于豬糞處理，這3 類物質很可能是激發砷甲基化效率的有效物質成分。研究還發現FI 指數及APⅡ、FA、HA 區域積分均與甲基砷濃度顯著正相關，而HIX指數與甲基砷濃度為負相關關系。該結果在一定程度上說明，有機碳腐殖化程度高的環境中，甲基砷含量低，這可能因為腐殖化程度高的有機碳分子比較穩定，特別是在厭氧培養環境下不易被微生物代謝利用[27]。此外，不同組分的有機碳分子還可能通過差異性促進培養環境中砷的解吸與釋放，改變砷甲基化底物濃度的方式影響砷甲基化進程[34]。例如豬糞分解產生的有機碳腐殖化程度較高，HA和FA相對含量較高，富含的羥基、羧基等官能團易與無機砷形成絡合物，一定程度上可能會降低砷甲基化作用的底物濃度[35]。本研究并未發現SMP、APⅠ與甲基砷濃度呈顯著正相關，且APⅠ和APⅡ組分相對濃度均較低，這很可能與本文只檢測了培養5 d后的結果有關，其間這些組分被微生物同化利用。此外，本研究還嘗試探索了不同熒光組分物質比值（各組分占總熒光組分的百分比）與砷甲基化的可能關聯，發現兩者間并沒有顯著相關，綜合上述結果，熒光組分APⅡ、FA 和HA 很可能是影響砷甲基化的主要因素。另外，本研究工作還存在一定的局限性，本文僅對不同有機碳熒光組分與甲基砷濃度的關系進行了初步探索，今后還需開展驗證試驗以期明確影響砷甲基化的具體熒光物質組分，對于不同有機碳分子組分介導砷甲基化變化的相關微生物過程與機制也將進一步探索。

4 結論

（1）秸稈與豬糞處理及不同添加量水平顯著影響土壤溶液中甲基砷的生成及總有機碳（TOC）濃度水平，厭氧培養前后TOC 消耗量與甲基砷增加量顯著正相關。

（2）秸稈與豬糞處理后土壤溶液中有機碳組成和性質存在明顯差異，秸稈源有機碳的腐殖化程度低，生物可利用性相對更高，可溶性微生物副產物（SMP）、芳香蛋白類Ⅰ（APⅠ）和芳香蛋白類Ⅱ（APⅡ）物質占比更高。

（3）熒光指數及APⅡ、FA、HA 區域積分均與甲基砷濃度呈顯著正相關，而腐殖化指數與甲基砷濃度呈負相關關系。