稻田土-水界面降NH3菌株的篩選與鑒定

高帥帥，吳民熙，尹紅梅，喻孟元，杜東霞，劉標，陳薇，王震，許麗娟，吳迎奔，李詠梅，趙信林

（1.湖南省微生物研究院，長沙 410009；2.中國農業科學院麻類研究所，長沙 410205）

施肥可以顯著提高作物產量，據統計，化肥對主要糧食作物產量的貢獻率高達40%～60%[1-2]。氮對作物的生長和產量至關重要，施氮則成為提高糧食產量的關鍵手段[3-4]。我國是世界上最大的水稻生產和消費國，需要持續增加水稻產量來滿足日益增長的對糧食的需求[5]。水稻對氮的需求量較大，且需要分次施氮才會有更好的效果[6]。為保證產量，農民一般選擇直接將尿素撒在稻田上覆水進行追氮。在尿素轉化為銨態氮或進一步轉化為其他形態無機氮后，除部分被作物吸收利用，還有相當部分通過NH3揮發、徑流、淋溶、硝化-反硝化等途徑損失[7]，這不僅造成肥料資源的浪費，還會誘發多種環境污染問題[8-9]。研究表明，NH3揮發是氮素損失的主要形式之一，NH3揮發量占施氮量的9%～40%[4，10]，NH3揮發不僅降低了肥料利用率，還會對水體、大氣帶來不良影響[11]。因此，亟待改善施肥技術或尋找其他途徑減少NH3揮發。

關于稻田NH3揮發的研究很多，多種方法已經被證明可以有效降低NH3揮發。例如：Chen等[12]通過多點多年試驗發現土壤-作物綜合系統管理可以有效降低NH3揮發并提高產量；Li 等[13]通過深度分析發現緩控釋肥、硝化抑制劑、脲酶抑制劑等的使用可顯著降低NH3揮發并提高產量；有研究表明尿素深施[14]、合理晚施[15]等也可以提高氮肥利用率并降低NH3揮發。盡管上述措施在一定程度上減少了NH3揮發損失，提高了氮的利用效率，但其經濟性和勞動力投入都限制了其在水稻種植系統中的廣泛應用。

微生物在自然界的物質循環和能量流動中發揮著不可替代的作用，對農田生態系統中的氮循環具有重要意義[16-17]，但微生物在降低農田氮損失方面的研究報道較少。微生物同化無機氮作用是構成土壤氮素保蓄能力的重要組成，Li 等[18-20]研究發現合理恢復退化生態系統的土壤微生物同化無機氮作用可有效提高土壤氮素保蓄能力，減少氮素損失風險。微生物在減少氮損失方面的應用還體現在堆肥中，如Guo等[21]通過在豬糞和麥秸混合堆肥中添加5%的巨大芽孢桿菌發現NH3和N2O的排放量減少；Tu等[22]發現，將由乳酸桿菌等組成的微生物菌劑與生物炭組合添加到豬糞與鋸末混合的堆肥中，可以有效降低NH3和N2O排放量，增加堆肥中的氮素存儲量。然而，目前有關利用相關微生物降低稻田氮損失的報道還不多見。

土-水界面是稻田土壤和上覆水中氮“交流”的必經之所，特殊的環境條件使其與上覆水體和耕層土壤相比，在理化、氮磷化學計量、微生物種類方面存在特殊性，土-水界面氮素遷移轉化極大地影響著稻田氮素走向[23-24]。NH3揮發是稻田氮損失的主要途徑，稻田土-水界面降NH3工作的開展有利于降低肥料損失，而生物降NH3[25]具有經濟、高效的特點。本研究擬利用湖南省益陽市典型稻田的土-水界面樣本篩選土壤中降NH3效果較好的菌株，并對其致病性和生化特征等進行鑒定，以期利用該菌株有效降低稻田NH3揮發和提高氮肥利用率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品

水稻插秧后，在湖南省益陽市某典型稻田（28.373 4°N，112.339 1°E）土-水界面采集土水混合樣本帶回實驗室用于分離降NH3菌株。

1.1.2 培養基

氨選擇性培養基[26-27]：蔗糖50.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO40.5 g，FeSO40.1 g，ZnSO40.5 g，NaCl 2.0 g，1 000 mL H2O，氨水10 mL，自然pH。

營養肉湯（NB）培養基：蛋白胨10.0 g，牛肉粉3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.4。

分離培養基：牛肉膏蛋白胨培養基、馬鈴薯葡萄糖培養基、高氏一號培養基。

富氨培養基：葡萄糖5.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.25 g，FeSO40.01 g，（NH4）2SO40.47 g，NaCl 1.0 g，1 000 mL H2O，pH 7.0。培養基滅菌后用無菌水稀釋4倍使用，經測定銨態氮濃度為25 mg·L-1。

富硝培養基：葡萄糖5.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.25 g，FeSO40.01 g，KNO30.72 g，NaCl 1.0 g，1 000 mL H2O，pH 7.0。培養基滅菌后用無菌水稀釋3 倍使用，經測定硝態氮濃度為34 mg·L-1。

尿素酚紅培養基：尿素20 g，酚紅1 g，蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.4。

低氨選擇性培養基：100 mL 無氨選擇性培養基中加入2 mL 500 mg·L-1的氨水。

1.2 試驗方法

1.2.1 降NH3菌株的富集、分離純化

稱取土壤10 g 置于裝有90 mL 無菌水的三角瓶中，室溫環境下于180 r·min-1搖床處理30 min，隨后靜置20 min，吸取10 mL 稀釋液接種至裝有100 mL氨選擇性培養基的三角燒瓶中，置于30 ℃、180 r·min-1搖床上恒溫培養5 d 后，觀察菌液變化，若菌液渾濁則表明菌株具有降解NH3能力，如此反復連續富集7代。

分別在牛肉膏蛋白胨培養基、馬鈴薯葡萄糖培養基、高氏一號培養基中，利用梯度稀釋平板涂布法分離純化菌液中的單菌落，篩選其中長勢良好的菌落，再采用劃線法多次分離純化，直至獲得完全純的單菌落，將分離出的單菌落接種至試管斜面，4 ℃低溫保存待用。

1.2.2 降NH3菌株的復篩及NH3降低率的測定[26-27]

將分離得到的單菌株接種至10 mL 營養肉湯培養基中，35 ℃、180 r·min-1培養24 h后，分別吸取細菌培養液置于無菌離心管中，8 000 r·min-1離心2 min后棄上清液，加無菌水重新懸浮，重復以上操作3 次，去除菌株生長過程中產生的氨，最后用無菌水重懸，制得無氨種子液。

取上述種子液2 mL 于裝有100 mL 低氨選擇性培養基的250 mL 密封瓶中，再向瓶中放入裝有10 mL 0.005 mol·L-1硫酸吸收液的20 mL 試管，35 ℃、180 r·min-1搖床培養。對照組不加種子液，加2 mL無菌水。于培養的第1、2、3、4 天取樣，采用納氏試劑法測定NH3的釋放量。

式中：R為NH3釋放量的降低率，%；C0為對照組硫酸吸收液中銨的濃度，mg·L-1；C為加菌液處理硫酸吸收液中銨的濃度，mg·L-1。

1.3 菌種鑒定

將菌株接種在平板上35 ℃培養，待長出菌落后，觀察菌落形態特征，并結合《微生物學實驗》進行生理生化特征的鑒定[28]。

利用細菌DNA 提取試劑盒提取菌株的DNA，然后利用通用引物27F 和1492R 進行PCR 擴增[26]，擴增反應條件：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，該過程進行30 個循環；72 ℃保持10 min。整個過程結束后，儀器設置為4 ℃終止保存。

PCR產物檢測合格后，切割目的條帶進行純化回收，用回收后的產物進行Sanger 測序。Sanger 測序結果用軟件ContigExpress 進行拼接，并去除兩端不準的部分。批量對拼接序列進行blastn（最新版本v2.13）比對核酸數據庫。其中，核酸數據庫選擇最新版本的nt庫，通過與nt庫進行blastn比對，即可得到同源序列的Accession Number號及物種鑒定和注釋。將測得的序列結果在NCBI 進行BLAST 比對，利用Mega7 軟件中的NJ法構建系統發育樹，確定菌株的種屬類別。

1.4 菌株對不同氮源的利用能力測定[27]

將無氨種子液，以2%的接種量，分別接種于富氨和富硝培養基中，35 ℃、180 r·min-1搖床培養，分別在第1、2、3、4 天取樣，8 000 r·min-1離心2 min 后測定上清液中的銨態氮和硝態氮濃度。銨態氮采用納氏試劑法進行測定，硝態氮參照《水和廢水檢測分析方法》[29]中的紫外分光光度法進行測定。

1.5 菌株產脲酶情況

產脲酶的細菌分解尿素后產生的氨使pH 上升，培養基呈堿性，以酚紅為酸堿指示劑，顏色由黃色變為紅色。因此，檢驗目標菌株是否產生脲酶采用尿素酚紅培養基[30]。

同時開展土柱培養試驗，設置添加目標菌株和不添加（對照）處理，在培養的第1、3、5 天取土-水界面泥土作為樣品，利用脲酶試劑盒測定界面處脲酶活性。

1.6 數據分析

采用Excel 2016進行試驗數據的處理，運用SPSS 22.0進行方差分析，利用Origin 2019b繪圖，采用Duncan法在0.05的顯著水平上進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 降NH3菌株的篩選

土壤樣品經氨選擇性培養基富集、分離純化后，共獲得3 株長勢較好的降NH3菌株，分別命名為菌Ⅰ、菌Ⅱ、菌Ⅲ，3 株菌均為細菌。利用低氨的選擇性培養基對3 株菌株進行復篩，測定其NH3降低率，結果如圖1 所示。在試驗持續期間，菌Ⅰ和菌Ⅲ對NH3的降低率隨著培養時間的延長而降低，菌Ⅱ在培養的前3 d 的NH3降低率比較平穩，第4 天出現上升。在培養的第1、2、3、4 天中，NH3降低率均是菌Ⅱ＞菌Ⅰ＞菌Ⅲ，菌Ⅱ的最高NH3降低率出現在第1 天，為88.60%，顯著高于其他2個菌株。

圖1 不同菌株的NH3降低率Figure 1 NH3 reduction rates of different bacterial strains

2.2 菌種鑒定

選擇NH3降低率最高的菌Ⅱ進行菌種鑒定，將其在牛肉膏蛋白胨培養基上培養，其菌落形態和顯微觀察特征及革蘭氏染色結果見圖2。菌Ⅱ的菌落呈圓形，邊緣不整齊，顏色呈微黃色，不透明；革蘭氏染色結果為陰性，菌體呈桿狀。

圖2 菌Ⅱ的形態特征及革蘭氏染色情況Figure 2 Morphological characteristics and Gram staining of bacterium Ⅱ

擴增菌Ⅱ的16S rDNA 基因序列，得到一個1 419 bp 的PCR 產物，NCBI BLAST 比對結果顯示菌Ⅱ與污水溶桿菌Lysobacter defluvii相似性最高（99.72%以上）。16S rDNA 基因序列系統發育樹顯示（圖3），菌Ⅱ與污水溶桿菌Lysobacter defluvii聚為一支。結合形態學分析、革蘭氏染色結果以及16S rDNA基因序列分析，菌Ⅱ被鑒定為污水溶桿菌。

圖3 菌Ⅱ的系統發育樹Figure 3 Phylogenetic tree of bacterium Ⅱ

2.3 菌株對不同氮源的利用能力

菌Ⅱ降NH3效果見圖4a，加菌處理4 d內銨態氮濃度從25.00 mg·L-1降到9.85 mg·L-1，銨態氮降低率達到60.60%，其中第4 天降低率最高。在降低銨態氮的同時，培養基中的硝態氮濃度從0增加到1.08 mg·L-1。

圖4 菌Ⅱ對不同氮源的利用能力Figure 4 Utilization ability of different nitrogen of bacterium Ⅱ

菌Ⅱ降硝能力測定結果見圖4b，加菌處理4 d 內硝態氮濃度從34.00 mg·L-1降到3.85 mg·L-1，硝態氮降低率達到88.68%，其中第3天降低率最高。在降低硝態氮的同時，培養基中的銨態氮濃度從0 增加到4.37 mg·L-1，隨后降低至0。

2.4 產脲酶性能和溶血性能

將菌Ⅱ接種于尿素酚紅培養基，培養48 h 后“十字”菌株周圍未出現紅圈（圖5a），說明菌Ⅱ周圍的尿素沒有被分解，即該菌不產生脲酶。泥柱土-水界面樣品的脲酶活性測定結果見圖5b，接種菌Ⅱ后脲酶的活性與對照相比在第1 天無顯著差異，但在第3 天和第5天顯著降低。

圖5 菌Ⅱ產脲酶情況Figure 5 Urease production status of bacterium Ⅱ

溶血性是體外對相關菌株安全性測定過程中需要分析的關鍵指標之一。將菌Ⅱ接種于血平板，30 ℃培養48 h，進行溶血性實驗，結果見圖6，可以看出菌Ⅱ在血平板上生長良好，菌落附近沒有出現溶血圈，說明菌Ⅱ不具有溶血性。

3 討論

NH3揮發是稻田氮損失的重要途徑，目前關于稻田NH3揮發的研究主要集中在施肥方式[15，31]、肥料用量[32]、氮肥種類[33-34]、土壤改良劑[35]等，但利用微生物降低稻田NH3揮發的報道較少，所以篩選土-水界面處的降NH3菌株十分必要。本研究通過采集湖南省典型稻田土-水界面樣品，進一步篩選出的菌Ⅱ降NH3效果較好，NH3降低率最高可達88.60%，具有一定降低稻田NH3揮發的潛力。高通量測序所得菌株基因序列與NCBI 基因序列數據庫進行對比分析，證明所篩選菌株為溶桿菌屬，進一步通過菌落形態、顏色以及革蘭氏染色結果發現所篩選菌株與Yassin等[36]報道的Lysobacter defluvii十分相似，所以判斷所得菌株為污水溶桿菌。但是，目前有關污水溶桿菌的研究較少，關于污水溶桿菌的降NH3或氮轉化功能方面的研究更為缺乏。同時，由于本試驗是在室內開展的培養試驗，該菌株在實際田間的降NH3效果還需要進一步驗證。

與尹紅梅等[27]的實驗結果相比，菌Ⅱ的硝態氮利用能力和氨氮利用能力較弱，一方面這可能是因為本研究接種率為2%，低于尹紅梅實驗中的5%，另一方面可能是由于該菌株大量繁殖吸收了部分的氮。富氨培養基中銨態氮下降，但是硝態氮沒有顯著增加，由于本試驗是在非厭氧條件下進行，好養的溶桿菌不易使反硝化發生，因此，富氨培養基中銨態氮降低的一個原因很可能是所培養菌株將其利用并轉化為生物量氮，試驗開展期間，隨著菌的生長，供試培養基逐漸變渾濁，這也在一定程度上反映了菌株確實有一定的增殖，另一方面，由于是非厭氧條件，部分氨氮也可能通過NH3揮發損失。由于硝態氮相對穩定，同時試驗在有氧條件下進行，所以富硝培養基中減少的硝態氮極有可能是被菌株增殖利用了。

脲酶是尿素分解過程中的關鍵酶[37]，尿素酚紅培養基研究表明菌Ⅱ幾乎不產生脲酶[30]，同時在土-水界面添加該菌株可能還有抑制脲酶產生的作用，這說明菌Ⅱ不會通過產生脲酶加速尿素產NH3的過程，滿足稻田土-水界面降NH3的基本要求。溶血性是體外對相關菌株安全性測定過程中需要分析的關鍵指標之一，本研究發現菌Ⅱ無溶血性[38-39]，初步斷定菌Ⅱ的致病性可能較低，但是還需要開展進一步試驗來鑒定其是否為致病菌株，從而決定該菌是否可應用于生產實踐。

4 結論

（1）通過對稻田土-水界面降NH3菌株的篩選，獲得了一株在室內試驗條件下具有較好降NH3效果的菌株——菌Ⅱ，經鑒定該菌株為污水溶桿菌。

（2）菌Ⅱ幾乎不產脲酶，且不具有溶血性，具有降低稻田NH3揮發的潛力。

（3）菌Ⅱ可能對氨氮和硝態氮具有較好的吸收和利用能力，其在稻田降低氮肥損失方面的效果需要進一步在田間驗證。