基于16 孔5 通道的PCR 儀光路系統研制

蘇州雅睿生物技術股份有限公司 徐樂

Q-PCR（實時熒光定量PCR 技術）實現了在體外進行DNA 片段的擴增與定量的結合。本文提出一種基于光纖的熒光光路檢測系統，可以實現16 孔5 通道的熒光數據采集，簡單介紹了CCD 結構的光路檢測方式與PD 結構的光路檢測方式，后采用價格更便宜的PD 結構，設計熒光激發驅動光源電路、PD 電路、光路板，基于STM32H743VIT6 處理芯片可控制光源的亮滅，控制電機旋轉一周采集PD 光路信號。光路系統對16 孔樣品進行光路實驗，數據結果表明：PCR 儀光路系統可以檢測16 孔，5 通道的熒光數據，空孔熒光波動小于5%，CT 不大于1，CV 不大于1.5%，能滿足PCR 光學需求，達到較好的應用效果。

PCR 儀器是一種生物儀器（基因擴增），可以在體外借助多種酶對特定的DNA 片段進行快速的擴增。Q-PCR（實時熒光定量PCR 技術）[1,2]是在PCR 儀器所用的耗材中增加熒光物質，在PCR 工作過程里DNA在不斷地擴增，熒光信號也隨之增強，通過檢測熒光信號，參考標準曲線就可以對DNA 進行定量、定性的分析。

PCR 擴增分為4 個時期，分別為基線期（基線期DNA 進行指數擴增，DNA 數量小及熒光信號較弱）、指數擴增期（指數擴增期DNA 進行指數擴增，DNA 數量及熒光信號進行指數增強）、線性增長（DNA 沒有進行指數擴增）以及平臺期（DNA 數量穩定）。在指數增長期，熒光擴增產物DNA 分子總數量y=x（1+e）n，x為原始模板DNA 分子數量，公式中的指數n表示PCR 反應的循環數，e表示PCR 擴增的效率（0 ≤e≤1）。由于基線期與指數擴增期具有指數擴增關系，可以進行精確的定量檢測，通過PCR 儀器檢測樣品熒光信號，將閾值線定到指數擴增期，可以實現對DNA 起始模板量的定量檢測分析。

1 光學系統原理

實時熒光定量PCR 儀熒光檢測系統由激發光系統、檢測光系統組成。

CCD 結構的光學系統，采用鹵素燈作為激發光源，激發光系統還包括濾光片、光纖。檢測光系統是由CCD相機、濾光片、光纖、多元鏡組成。鹵素燈經過濾光片傳到前端光纖，到反應孔，經過光纖孔板上的熒光試劑，再經過后端光纖、濾光片和鏡頭，最后CCD 相機采集熒光信號（需要調節CCD 定位、設置曝光時間等操作）。檢測熒光波長范圍由380nm ～780nm，FAM 激發波長470nm±10nm，檢測波長520nm±10nm；VIC 激發波長525nm±10nm，檢測波長570nm±10nm；ROX 激發波長570nm±10nm，檢測波長620nm±10nm；CY5 激發波長630nm±10nm，檢測波長670nm±10nm；CY5.5激發波長680nm±10nm，檢測波長710nm±10nm。

如圖1 所示是PD 結構的光學系統[3]，由激發光系統與檢測光系統組成。激發光系統由LED 燈、濾光片、光纖組成，檢測光系統由PD、濾光片、光纖、多元鏡組成。選擇激發波長范圍380nm ～780nm 的LED 燈經過濾光片傳到前端光纖，到反應孔，經過光纖孔板上的熒光試劑，再經過后端光纖、濾光片和鏡頭，最后PD 將熒光光學信號轉化為模擬信號送入至光路板進行數據轉化。

圖1 16 孔5 通道PD 架構光學系統Fig.1 16-hole 5-channel PD architecture optical system

如圖2 所示是采用PD 類型的光學系統的轉盤圖。PD 類型的光學系統旋轉分為固定盤與轉盤。圓盤為旋轉盤，內圈為LED 燈通道，外圈為PD 檢測通道；上面與步進電機固定的盤為固定盤，外圈16 孔用于檢測（與旋轉盤外圈相對應），插入光纖通過旋轉轉盤方式有序掃描光路信號，內圈16 孔插入光纖用于激發（與旋轉盤內圈相對應），發射與檢測光路孔的配對數及為所能檢測的樣本孔數，LED 與PD 的配對數及為所能檢測樣本的通道數，后期可以通過改動旋轉盤里LED 與PD 配對數可以擴展通道、變化固定盤孔的個數可以擴展樣本孔數。

圖2 PD 架構旋轉圖Fig.2 PD architecture rotation diagram

轉盤帶有原點復位功能，轉盤旋轉一圈就是測試一輪光路信號，采用步進電機驅動的方式，16 細分及步進電機走3200 步轉盤旋轉一圈。將采集到的20 步光學數據通過排序，濾波取最大的四個數做平均得出光強，定位圓盤復位點需注意傳感器的觸發區域為連續區域，整個區域約25 步(一圈3200 步)，在圓盤設計時，盡量避免孔對準位置在復位區域。

2 光學電路設計

2.1 PD 型光學檢測系統原理

如圖3 所示為PD 型熒光檢測系統圖，中位機發送采光指令給光路板，光路板開始開燈、控制電機、轉換處理PD 信號，電機回到原點關燈、停止電機運動、停止處理PD 信號、發送數據。

圖3 PD 型熒光檢測系統圖Fig.3 PD fluorescence detection system diagram

2.2 光路板電路設計

光路板采用STM32H743VIT6 主控芯片，包括SWD燒錄接口、25MHz 有源晶振、復位電路、EEPROM 采用AT24C128 用于存儲數據的功能、運用16 位ADC1，可以采集6 個PD 信號、可控制6 路LED 燈的亮與滅、控制步進電機的PWM 占空比與使能信號、接收原點復位信號、與中位機進行通信功能。

光路板LED 恒流驅動電路，通過PS2801 光耦芯片將單片機數字信號與LED 燈使能信號隔離，弱信號控制LED 燈的亮與滅，單片機信號沒有或者信號為高時LED燈不使能，單片機信號為低電平時LED 燈使能點亮。

PD 電路板輸出的模擬信號經過ADA4522 運算放大器放大,每路放大比例需根據實際光路進行調整，由于單片機參考電壓不能超過4V，運放供電電壓大于4V，對運放輸出進行了分壓，使單片機最大接收電壓不超過3V，滿足各芯片對電壓的需求。

2.3 PD 板設計

選用濱松品牌規格為S6931，濱松生產的PD 批次間較好，還具有響應速度快、靈敏度高、噪聲低的優點。光譜響應范圍為320nm ～1000nm，暗電流只有20pA，上升時間0.5us。

輸出電流IOUT=IDARK+IPD，IDARK為PD 感光電流，IPD為暗電流（噪聲）。光電二極管有兩種工作模式，分別為光伏、光電導，在光伏模式工作時，二極管無偏置，暗電流可以達到最??；光電導模式工作時，需要施加一個外部反向電壓，可以提高響應速度。本文基于對光電二極管的應用速度、暗電流的考慮，選擇光電二極管在光伏模式下工作。

3 光學下位機軟件設計

光路板單片機上電初始化（開啟時鐘、ADC1 外設6通道使能，DMA1 將AD 采集數據存儲到指定內存、電機復位等），判斷是否接收到采光指令，沒有收到繼續等待，如果收到正確信息啟動電機運動、開始采集處理熒光數據、電機運動一圈回到原點或者采光過程中復位超時、電機超3200 步，關閉電機、原點標志復位、處理好光路和狀態數據發送給中位機。

4 光路實驗

對PD 結構的光學系統進行光路實驗，驗證光學系統能否工作。進行5 色實驗時，光學系統需要借助溫度控制模塊、中位機（帶液晶屏的平板），分別測試5 個通道FAM、VIC、ROX、CY5、CY5.5 的16 孔 位 數 據，如表1 所示。

表1 光學實驗數據分析表Tab.1 Analysis table of optical experiment data

測試4 個通道FAM、VIC、ROX、CY5 的A1、A4、B5、B8 孔位數據、測試第五通道CY5.5 的A5、A8、B1、B4 孔位數據。FAM 通道（測試A1、A4、B5、B8 孔位）：3103-6706，擴增效率：2.16；VIC 通道（測試A1、A4、B5、B8 孔位數據：3738-8288，擴增效率：2.22；ROX通道（測試A1、A4、B5、B8 孔位）：1997-9976，擴增效率：5.00；CY5 通道（測試A1、A4、B5、B8 孔位）：2543-8402，擴增效率：3.30；CY5.5 通道（測試A5、A8、B1、B4 孔位）：7821-31534，擴增效率：4.03。

通過表1 的數據，所計算的CT 值小于1，CV 值小于1.5%，光路系統滿足PCR 儀器的光路要求。

5 結論

本文闡述了Q-PCR 儀擴增原理，后簡單介紹了CCD結構的光路檢測方式與PD 結構的光路檢測方式，PD 結構由于價格便宜容易操作，提出了基于PD 結構的光路檢測系統，采用轉盤掃描方式，設計熒光激發驅動光源電路、PD 電路、光路板，可以實現16 孔5 通道的熒光數據采集（可以通過改動轉盤升級6 通道）。運用設計的光路系統對16 孔樣品進行光路實驗，數據結果表明：所設計的光路系統采集熒光信號平穩，可以檢測16 孔，5通道的熒光數據，空孔熒光波動小于5%，4 個孔位光路數據，CT 值小于1，CV 值小于1.5%，可以滿足實時熒光定量PCR 儀的光學需求[4]。

引用

[1] 鐘珂珂.光纖型定量PCR儀熒光檢測系統研究[D].杭州.浙江大學,2013.

[2] 毛賀.光纖型定量PCR儀熒光檢測光學系統性能研究[J].機電工程技術,2016,45(11):54-56.

[3] 王偉平.96孔實時熒光定量PCR檢測系統的開發[D].杭州.浙江工業大學,2011.

[4] 梁子英,劉芳.實時熒光定量PCR技術及其應用研究進展[J].現代農業科技,2020(6):1-3+8.