黃胸薊馬化學感受蛋白基因ThawCSP1克隆與表達分析

李 恒, 張祥琴,2, 田厚軍, 陳藝欣, 林 碩, 魏 輝,2, 陳 勇,2

(1.福建省農業科學院植物保護研究所/福建省作物有害生物監測與治理重點實驗室/農業農村部福州作物有害生物科學觀測實驗站,福建福州 350013;2.福建農林大學閩臺作物有害生物生態防控國家重點實驗室,福建福州 350002)

黃胸薊馬(ThripshawaiiensisMorgan)別稱香蕉花薊馬、夏威夷薊馬,隸屬纓翅目(Thysanoptera)鋸尾亞目(Terebrantia)薊馬科(Thripidae),是一種重要的棲花害蟲[1]。該薊馬起源于環太平洋地區,當前廣泛分布于亞洲熱帶、亞熱帶和北美南部[2],在我國的福建、海南、廣西、臺灣、云南、廣東等多個省均有分布[3]。黃胸薊馬環境適應性較強,寄主范圍廣泛,能危害香蕉、芒果等多種經濟作物[4-8]。該蟲主要取食寄主嫩葉、嫩果并產卵于花蕾和幼果中[9-10],危害后的果皮呈現黑色斑點,影響坐果率和品質[11]。由于黃胸薊馬世代周期短、隱匿性強,危害初期很難被察覺[12-13],當前國內外防治黃胸薊馬最有效的方法是使用化學藥劑。但伴隨著農藥的長期使用,該蟲的抗藥性也逐漸增強,很難達到理想的防治效果[14-17]。

嗅覺系統在昆蟲選擇寄主、捕食、產卵、避敵等生命活動中發揮著重要作用,嗅覺識別過程中需要化學感受蛋白(chemosensory proteins,簡稱CSPs)、氣味結合蛋白(odorant binding proteins,簡稱OBPs)、氣味受體(olfactory receptors,簡稱ORs)、氣味降解酶(odorant degrading enzymes,簡稱ODEs)等嗅覺蛋白的參與[18-21]。CSPs別稱感受器官蛋白,是一類可溶性結合蛋白,主要存在于昆蟲化學感受器官中,承擔篩選、識別、運載氣味化合物或信息素分子,并傳遞給嗅覺受體的角色,在嗅覺識別的第1步生理反應中發揮至關重要的作用[22]。1994年CSPs首次被發現鑒定于黑腹果蠅(DrosophilamelanogasterMeigen)的觸角中,這些可溶性的蛋白分別被命名為A-10和OS-D (olfactory specific-D)[23]。隨著分子生物學技術的迅速發展,許多昆蟲CSPs相繼被克隆鑒定,發現其都具有4個半胱氨酸殘基的典型特征[24]。CSPs廣泛存在于昆蟲的各個組織部位,如MbraCSPA6在甘藍夜蛾的觸角、下顎須及喙中均有表達[25]。昆蟲的CSPs除了識別、運輸化學感受器周圍環境中具有親脂性的配體,也參與調節昆蟲生長發育[26]、免疫作用[27-28]、種群識別[29]等。

本研究在分析黃胸薊馬觸角轉錄組的基礎上,對黃胸薊馬化學感受蛋白基因ThawCSP1進行克隆、鑒定,然后利用MEGA 7.0軟件以鄰接法構建ThawCSP1系統發育樹,最后利用實時熒光定量PCR法明確該基因在黃胸薊馬不同組織和各個發育階段mRNA水平的表達模式,并利用免疫熒光標記和免疫電鏡技術觀察ThawCSP1蛋白在黃胸薊馬觸角的表達情況,研究結果為進一步探討黃胸薊馬ThawCSP1的生理功能提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

黃胸薊馬來源于福建省農業科學院植物保護研究所蔬菜種植大棚,以四季豆飼養在人工氣候箱(MGC-350HP-2,上海一恒科技儀器有限公司)中。飼養條件為光—暗周期14 h—10 h,溫度為 (25±1) ℃,相對濕度為(65±5)%。

1.2 ThawCSP1開放閱讀框的克隆與鑒定

在分析黃胸薊馬轉錄組數據的基礎上,通過生物信息學分析,獲得ThawCSP1開放閱讀框(open reading frame,ORF)序列。采用Trizol(Ambion)法提取黃胸薊馬總RNA,然后利用反轉錄試劑盒(北京全式金生物科技有限公司)將RNA反轉錄成cDNA。根據黃胸薊馬ThawCSP1基因開放閱讀框序列,利用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物(表1),以反轉錄成的cDNA為模板擴增目的片段。PCR反應體系：cDNA模板1 μL,2×PCR buffer 12.5 μL,dNTPs(2.0 mmol/L)5 μL,正反向引物各 1 μL,KOD FX 0.5 μL,ddH2O 4 μL。反應條件：94 ℃ 預變性 2 min;98 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,68 ℃延伸30 s,反應30個循環;最后72 ℃延伸 10 min(Toyobo code：KFX-101)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得的PCR產物,利用凝膠回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]回收純化檢測正確的目的條帶,再將純化的PCR產物連接pEASY-T1載體并轉化至感受態細胞DH5α中,挑選陽性克隆菌落送福州鉑尚生物技術(上海)有限公司測序。

表1 本試驗所用引物

1.3 ThawCSP1序列特性及系統進化分析

使用DNAMAN軟件將黃胸薊馬ThawCSP1基因核苷酸序列翻譯成氨基酸序列;采用Expasy在線工具(http://web.Expasy.org/protparam)預測該蛋白質的等電點、分子量等信息,使用SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測ThawCSP1的信號肽,使用Conserved domains預測ThawCSP1序列的保守結構域。

利用NCBI(national center for biotechnology information)的Blastp工具對ThawCSP1氨基酸序列進行同源相似性比對,選取除ThawCSP1外,來自纓翅目、蜚蠊目、直翅目、半翅目、鞘翅目29個昆蟲的化學感受蛋白,利用MEGA 7.0軟件對序列進行多重比對,選用鄰接法(neighbor joining)構建ThawCSP1系統發育樹。

1.4 ThawCSP1表達譜分析

選取300頭初羽化1 d的黃胸薊馬成蟲,用CO2將其麻醉并置于PBS緩沖液中,分別收集解剖鏡下取出的頭、胸、腹、足、觸角組織,RT-qPCR分析ThawCSP1在不同組織中的表達譜;同時挑選1齡若蟲、2齡若蟲、蛹和羽化1、5、10、15 d的黃胸薊馬成蟲各100頭,分析ThawCSP1在各個發育階段mRNA水平的相對表達量。樣品總RNA的提取采用Trizol法,然后利用反轉錄試劑盒(北京全式金生物科技有限公司)將RNA反轉錄成cDNA,保存于-80 ℃冰箱備用。

使用Primer Premier 5.0軟件設計黃胸薊馬ThawCSP1基因和ThawActin基因(OQ715282)的 RT-qPCR 引物(表1)。RT-qPCR反應體系：cDNA模板1 μL,正反向引物各0.5 μL,SYBR預混液(TakaRa Code：RR820)10 μL,ddH2O 8 μL。反應采用標準兩步法：95 ℃ 預變性30 s;95 ℃變性 5 s,62 ℃退火 15 s,40個循環。

使用2-ΔΔCT法計算黃胸薊馬各個發育階段和不同組織中ThawCSP1的相對表達量。各個發育階段ThawCSP1的相對表達量以羽化10 d黃胸薊馬的ThawCSP1表達量為標準參量,不同組織ThawCSP1的相對表達量以該基因在黃胸薊馬腹部中的表達量為標準參量。

1.5 免疫熒光觀察ThawCSP1在黃胸薊馬觸角中的表達

為從蛋白水平定性分析ThawCSP1在黃胸薊馬觸角中的表達情況,首先在室溫條件下,將黃胸薊馬成蟲放入4%多聚甲醛中固定2 h,然后用 0.01 mol/L PBS漂洗2次,每次5 min;2% Triton X-100 滲透24 h,0.01 mol/L PBS漂洗2次,每次 5 min;轉入脫色液[100%乙醇 ∶30% H2O2=2 ∶1(體積比)]脫色2 h,0.01 mol/L PBS漂洗2次,每次 5 min;加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)偶聯的ThawCSP1抗體(筆者所在實驗室制備的多克隆抗體),37 ℃條件下避光放置2 h;0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min;甘油封片后,共聚焦顯微鏡(Leica SP8)下觀察結果。

1.6 免疫電鏡觀察ThawCSP1在黃胸薊馬觸角的表達

取黃胸薊馬成蟲觸角組織放入2%多聚甲醛和2%戊二醛溶液中固定2 h,用0.1 mol/L PBS(pH值7.2)漂洗樣品4次,每次10 min;隨后于4 ℃進行乙醇梯度脫水,濃度分別為30%、50%,每個梯度各處理30 min,接著于-20 ℃低溫脫水,乙醇濃度分別為50%、70%、90%,每個梯度脫水1 h;在-20 ℃下,分別用含有30%、70%、100% LR GLOD包埋劑的乙醇溶液進行滲透,每個濃度處理2 h,最后用0.1% BENZIL催化的LR GOLD包埋劑繼續滲透 6 h;隨后于-20 ℃條件下紫外聚合96 h,超薄切片機切片并收集在鎳網上;以實驗室制備的黃胸薊馬ThawCSP1多克隆抗體為一抗,二抗為膠體金(12 nm)偶聯羊抗鼠IgG,標記后用透射電子顯微鏡(HitachiH-7700,日本)觀察、拍照。從蛋白水平定性分析ThawCSP1在黃胸薊馬觸角的表達情況。

2 結果與分析

2.1 黃胸薊馬ThawCSP1的克隆鑒定與分析

通過分析黃胸薊馬觸角轉錄組數據,利用Primer Premier 5.0設計黃胸薊馬ThawCSP1-ORF引物,以黃胸薊馬總RNA反轉錄獲得的cDNA為模板,擴增的PCR產物大小在400 bp與500 bp之間(圖1)。測序結果顯示,擴增的序列為405 bp(GenBank登錄號：OQ730210)(圖2)。利用DNAMAN軟件分析可知,ThawCSP1-ORF基因編碼134個氨基酸,預測蛋白分子量為15.181 ku,N末端的1～19位氨基酸為信號肽區域,等電點為8.50,含有4個保守的半胱氨酸,符合CSP蛋白的典型特征C1-X6-8-C2-X16-21-C3-X2-C4(圖2)。

將黃胸薊馬ThawCSP1氨基酸序列與其他12種昆蟲29個CSPs通過MEGA 7.0鄰接法,以步長值1 000構建系統發育樹。由圖3可知, 該系統發育樹可分為兩大支,第1支有27個CSPs,分布在10個物種中,第2支有3個CSPs,分布在3個物種中,其中ThawCSP1聚在第1支上,與纓翅目西花薊馬CSP(AEP27186.1)、花薊馬CSP1和牛角花齒薊馬CSP1親緣關系最近,氨基酸序列相似性分別為79.55%、80.30%和76.52%。

2.2 黃胸薊馬ThawCSP1基因表達譜分析

以黃胸薊馬羽化10 d成蟲的ThawCSP1表達量為標準參量,比較ThawCSP1基因在各個發育階段的相對表達量,結果顯示ThawCSP1在成蟲1、5、10 d的相對表達量最高,其次是1齡若蟲、2齡若蟲和成蟲15 d,其相對表達量為標準參量的0.55～0.59倍;蛹期ThawCSP1基因表達量最低,僅為標準參量的0.11倍(圖4-A)。

以黃胸薊馬腹部ThawCSP1表達量為標準參量,比較ThawCSP1基因在黃胸薊馬不同組織部位的相對表達量,結果顯示ThawCSP1基因在黃胸薊馬觸角和足部的相對表達量最高,是腹部表達量的222.33倍和181.60倍;頭部的相對表達量為腹部的79.03倍;腹部的相對表達量最低(圖4-B)。

2.3 黃胸薊馬ThawCSP1蛋白在觸角的表達

利用免疫熒光標記技術觀察ThawCSP1在黃胸薊馬觸角中的表達,由圖5-A可知,在觸角鞭節 Ⅰ～Ⅲ節均能觀察到較強的熒光信號,表明ThawCSP1蛋白在黃胸薊馬觸角中高表達。進一步通過免疫電鏡技術觀察ThawCSP1在觸角感器的表達,由圖 5-B 可知,在黃胸薊馬觸角錐形感器上分布大量的膠體金顆粒(白色箭頭),表明ThawCSP1蛋白在黃胸薊馬觸角錐形感器上大量表達。

3 討論與結論

昆蟲嗅覺相關蛋白基因廣泛分布于昆蟲的不同組織和各個發育階段中,分析基因在昆蟲不同發育階段和各個組織的表達模式是預測基因功能的一個重要手段[20]。CSPs目前僅在節肢類動物(arthropods)和多足類動物(myriapods)中有報道,一般100～120個氨基酸,蛋白可溶且未被報道有翻譯后修飾,在4個保守的半胱氨酸之間形成2個二硫鍵(C1-X6-8-C2-X16-21-C3-X2-C4)[30]。目前節肢動物CSPs的研究較多,廣泛分布于昆蟲體內各個組織,除了嗅覺器官外,在頭、胸、腹部、足、睪丸、卵巢等非嗅覺組織中也有表達[18,30]。RT-qPCR 結果表明,ThawCSP1在黃胸薊馬觸角和足部表達量最高,在頭部也有較多表達(圖4-B)。由于觸角和足是昆蟲最為重要的化學感受器官,在昆蟲尋找寄主、產卵場所、配偶等多種生命活動過程中發揮作用[30],據此筆者所在課題組推測ThawCSP1可能參與了黃胸薊馬對寄主植物的識別、定位以及感受化學機械刺激等生命活動。此外,ThawCSP1在黃胸薊馬的若蟲期和成蟲期相對表達量較高,在蛹期表達量最低(圖4-A)。由于黃胸薊馬在蛹期無取食等生命活動,因此ThawCSP1基因在蛹期低表達進一步證明ThawCSP1參與了黃胸薊馬多種生命活動,具體功能還需要進一步驗證。

比較分析近緣物種間的CSPs有助于了解昆蟲對不同生態位的適應及其進化關系[30]。據報道,花薊馬、西花薊馬和牛角花齒薊馬分別有6、8、9個CSP基因[31-32],由于花薊馬和西花薊馬部分CSP基因序列數據暫未釋放,因此本研究選擇3個西花薊馬CSP、2個花薊馬CSP、9個牛角花齒薊馬CSP以及其他15個昆蟲CSP蛋白序列開展系統發育分析。ThawCSP1與西花薊馬CSP(AEP27186.1)、花薊馬CSP1和牛角花齒薊馬CSP1蛋白序列同源性在76%以上(圖3),推測這4個CSP基因可能具有類似的構象與功能。此外,ThawCSP1與其他11個薊馬CSPs的親緣關系相對較遠,暗示薊馬CSPs蛋白功能的多樣性。

觸角作為昆蟲主要的嗅覺器官,分布有大量的感受器,在昆蟲識別過程中起著重要的作用[33]。免疫熒光技術是根據抗原抗體反應的原理,先將已知的抗原或抗體標記上熒光基團,再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測細胞或組織內相應的抗原(或抗體),能直觀地了解相應的蛋白在細胞或組織中的表達情況[34]。本研究利用實驗室制備的黃胸薊馬ThawCSP1蛋白多克隆抗體,成功觀察到ThawCSP1蛋白在黃胸薊馬成蟲觸角的表達情況(圖5-A)。此外,膠體金免疫電鏡技術是將膠體金標記在抗原和抗體結合的各部位,在電鏡下根據黑色圓點狀金顆粒的分布情況,從而精確定位抗原(目的蛋白)[35]。免疫電鏡結果顯示ThawCSP1在黃胸薊馬成蟲期的觸角錐形感器中大量表達(圖 5-B),這為進一步研究ThawCSP1蛋白的功能提供了試驗依據。

綜上所述,本研究首次克隆鑒定了黃胸薊馬的ThawCSP1基因,并研究了該基因在黃胸薊馬生長發育過程中的時空表達,為進一步研究黃胸薊馬的CSPs功能提供數據參考,并為制定薊馬類害蟲防治策略提供理論依據。