紫花苜蓿葉面積和葉解剖結構對鹽脅迫的響應

趙 欣, 盧海峰, 錢 程, 胡雅飛, 劉大林, 王 琳, 李新娥

[1.揚州大學動物科學與技術學院,江蘇揚州 225009;2.揚州大學農業科技發展研究院(國際聯合實驗室),江蘇揚州 225009]

紫花苜蓿 (Medicagosativa) 屬于多年生豆科牧草,是我國調整產業結構、發展畜牧產業的主要牧草之一,也是目前保留種植面積最廣的多年生牧草;其粗蛋白含量高,氨基酸種類齊全,總氨基酸含量較高,富含礦物質、碳水化合物、維生素等營養物質,適口性好,家畜喜食[1-2],有“牧草之王”的美譽[3-4]。此外,紫花苜蓿較強的固氮功能,可以有效改善土壤肥力[5-6],因此還可作綠肥。目前,土壤鹽漬化是影響并限制農業生產的一個重要因素,我國鹽堿地總面積達9 913萬hm2,約占我國國土面積的10%,并且還在逐年增長[2,7-8]。而紫花苜蓿顯現出較強的耐鹽性,揭示紫花苜蓿的耐鹽策略對進一步發展鹽堿土地的飼草種植業具有積極作用。

植物葉片是連接植物和環境的重要器官[9]。環境變化常導致植物葉片基本形態及葉片解剖特征的響應與適應[10]。鹽脅迫會導致植物的葉片擴展速率降低甚至停止生長,葉面積降低,比如烏拉爾甘草(Glycyrrhizauralensis)[11]、空心蓮子草 (Alternantheraphiloxeroides)[12]、深紫糙蘇 (Phlomispurpurea)[13]等。比葉面積是葉單面單位面積與干質量之比,是一個涉及植物生態學的多功能方面的變量[14]。在有利的條件下,植物優化葉面積和比葉面積以獲取光和養分;而在較高的鹽濃度下,植物更傾向于將碳分配給葉質量和根,而不傾向于其表面[15]。

有關葉片解剖特征的研究顯示,葉厚度最易受鹽脅迫影響而產生差異,但研究結果并不一致。有研究指出鹽脅迫會導致葉厚度增加,例如NaCl溶液處理下,空心蓮子草[12]、三色堇(Violatricolor)[16]、木欖 (Bruguieragymnorhiza)[17]的葉片表皮厚度、葉肉厚度以及葉片總厚度都顯著增加[18]。然而,鹽脅迫處理的萵苣 (Lactucasativa) 葉厚度沒有顯著變化[19]。還有研究顯示,紫花苜蓿[8]、辣椒(Capsicumannuum)[20]、草莓(Fragariaananassa)[21]在鹽脅迫下葉厚度顯著降低。還有一部分植物可以通過改善葉片內部結構的策略以適應鹽脅迫的環境。柵欄組織和海綿組織厚度的比值 (柵海比) 是評價植物抗逆性的重要指標之一,葉片的柵海比越高,越有利于提高葉片內的氣體交換和貯存,植物適應逆境的能力就越強[22-24]。例如,三色堇[16]、苦檻藍 (Myoporumbontioides)[25]、木本苜蓿 (Medicagoarborea)[26]的柵海比在鹽脅迫下顯著增高。此外,葉片其他解剖結構指標,如暴露在單位細胞間隙中細胞壁的表面積 (Sm)、細胞壁的厚度、細胞間隙分數 (細胞間隙占葉肉總面積的分數,fias),這些指標均與葉肉導度有緊密的相關性,葉肉導度是胞間CO2到達葉片內羧化位點阻力的倒數。細胞壁越厚,細胞間隙的空間較小時,擴散的阻力就越大,葉肉導度就越小,這些指標在一定程度上影響著光合作用的效率[27-29]。有研究指出,鹽脅迫會降低棉花 (Gossypiumspp.) 葉片的葉肉導度,這可能是葉片葉綠體面積降低、細胞壁厚度增加導致的結果,但是與葉肉導度相關的解剖結構如何變化并不清楚[30]。因此,需要進一步探討鹽脅迫對植物葉片解剖結構的影響。

目前,關于紫花苜蓿葉解剖結構所反映的抗鹽性或耐鹽性響應研究仍然不足,限制了我們對紫花苜蓿耐鹽機制的了解。因此,本研究依托2個耐鹽性不同的紫花苜蓿品種,采用溫室盆栽試驗,通過葉片掃描和石蠟切片技術,測量并計算紫花苜蓿葉面積、比葉面積、葉片橫切解剖結構特征,擬探討以下幾個主要問題：(1)不同耐鹽性品種紫花苜蓿葉面積和比葉面積對鹽脅迫的響應;(2)不同耐鹽性品種紫花苜蓿的葉片橫切解剖特征對鹽脅迫的響應;(3)不同耐鹽性紫花苜蓿品種響應鹽脅迫的主要特征指標。

1 材料與方法

1.1 研究地點及材料

試驗選用2個紫花苜蓿品種,WL363HQ品種秋眠級為5,為抗寒高產多葉品種;WL712品種秋眠級為10,為南方高產優質品種,冬季生長活躍。試驗初篩顯示,WL363HQ耐鹽性較強,而WL712耐鹽性較差。試驗采用盆栽方式 (花盆口徑約17.5 cm,高度約16 cm,底徑約14 cm),于2020年10月在揚州大學智能溫室內(日均最高溫度27 ℃,最低溫度 15 ℃)播種。每盆均勻點播15 粒種子 (種子購買于北京正道種業有限公司),3葉期時進行間苗,留下 10株長勢一致的健康幼苗,每7 d澆500 mL霍格蘭營養液,每個品種各栽12盆。幼苗生長期,設置4個NaCl濃度梯度 (0、50、150、250 mmol/L),3組重復,每隔3 d澆100 mL NaCl溶液和對照蒸餾水。幼苗進行脅迫處理60 d后,于2021年1月中旬進行取樣測量。

1.2 葉片解剖結構特征測定

每盆摘取5張成熟、健康的葉片,置于密封袋保鮮帶回實驗室,使用葉面積測定儀 (YT-YMJ02,山東云唐智能科技有限公司) 掃描葉面積后,稱葉片鮮質量,稱質量后將葉片用信封包好在105 ℃烘箱中殺青0.5 h,隨后72 ℃烘干48 h直至葉片質量不再改變后,稱取葉片干質量,用于計算比葉面積 (葉面積與葉干質量的比值,m2/g)。

另取相同位置的成熟健康葉片固定于FAA固定液中,4 ℃保存。將固定好的葉片用乙醇 (濃度梯度為50%、70%、85%、95%、100%) 脫水,每個梯度脫水30 ～ 60 min。二甲苯透明2次各30 min,浸蠟過夜,再用純蠟置換2～3次,每次1 h左右,采用科迪KD-BMIII包埋機包埋,科迪KD-2260切片機切片,切片厚度為8 μm,番紅-固綠雙重染色,中性樹膠封片后烘干。在Leica DM500-TR型顯微鏡及LIOO成像系統下觀察、拍照。

用Image-J軟件測量葉片的總厚度,上角質層、下角質層厚度,角質層總厚度,上表皮細胞、下表皮細胞厚度,表皮總厚度,柵欄組織、海綿組織、葉肉組織厚度,并分別計算柵欄組織、海綿組織、葉肉組織厚度占葉片總厚度的百分比。測量細胞間隙面積、細胞壁厚度、細胞間隙中細胞壁的總長度、切片橫截面總面積(圖1)。細胞間隙分數的計算方法[27]如下：

Sm的計算方法如下：

式中：fias是細胞間隙百分數;Sias是細胞間隙的面積,μm2;S為所計算切片的橫截面積,μm2;Sm為暴露在單位細胞間隙中的細胞壁的表面積,μm2/μm2;lm為單位細胞間隙中的細胞壁總長度,μm;F是曲率修正因子,根據之前的研究取值為F=1.42[31]。

每個切片選3個視野測量,除細胞壁厚度以外,每個指標重復測量3次;細胞壁厚度隨機選取顯示在細胞間隙中的多個細胞,重復測量5次。

1.3 數據分析

在Excel 2019對數據進行錄入和整理,用統計軟件IBM SPSS Statistics 21對數據進行統計分析,進行單因素方差分析和鄧肯氏多重比較。在分析中,上、下表皮厚度,表皮總厚度,柵欄組織、海綿組織、葉肉組織厚度,葉片總厚度進行了log轉換以符合正態分布。本研究以α=0.05作為差異顯著性判斷標準。

此外,本研究對所有測量指標進行主成分分析(PCA)。主成分分析可以把多個互相關聯的指標通過降維轉換為較少的指標來綜合反映其變化的信息,這些綜合指標即為原來多個指標的主要成分,每個主成分的貢獻率反映了從原始單一指標中提取的信息量。貢獻率越大表明主成分中包含的原始信息越多[32]。很多研究應用主成分分析法將大量的性狀特征轉化為少量的綜合特征,在產量、品質以及耐逆性狀的篩選方面發揮了重要的作用[33]。

2 結果與分析

2.1 NaCl濃度對不同品種紫花苜蓿葉面積、比葉面積和葉厚度的影響

表1顯示,WL363HQ品種的葉面積在對照組(0 mmol/L NaCl)最大,平均(2.5±0.3) cm2,隨著NaCl濃度的升高,分別顯著降低了12%、32%、36% (P<0.05);比葉面積無顯著變化。而WL712品種的葉面積在鹽脅迫后沒有顯著變化,比葉面積隨NaCl濃度升高而升高 (P=0.073),最高在NaCl濃度為250 mmol/L時提高了21%。2個品種的葉片總厚度在對照組分別為(118.5±6.6)、(127.6±7.1) μm,在NaCl濃度為150 mmol/L時均顯著提高 (P≤0.086),WL363HQ品種的葉片總厚度增加了32.2 μm,WL712品種增加了23.9 μm。從圖1也可觀察到在NaCl濃度為150 mmol/L時,2種紫花苜蓿的葉片總厚度最大。

表1 不同鹽濃度對兩種紫花苜蓿葉面積、比葉面積和葉厚度的影響

2.2 NaCl濃度對不同品種紫花苜蓿角質層和表皮厚度的影響

紫花苜蓿葉片為典型的異面葉,其解剖結構主要分為上下角質層、上下表皮細胞和葉肉組織,細胞間隙為葉肉組織中的間隙部分(圖1)。由表2可知,各處理下WL363HQ、WL712的上角質層厚度分別介于4.2～5.1、3.2～5.0 μm,下角質層厚度分別介于4.9～5.5、3.1～5.9 μm,上表皮厚度分別介于12.9～14.2、11.7～15.6 μm,下表皮厚度分別介于12.4～13.7、12.0～15.3 μm。NaCl濃度升高對WL363HQ的上下角質層厚度沒有產生顯著影響,對表皮厚度的影響也不顯著,但總體都是減小的趨勢。然而,WL712品種的下角質層、總角質層的厚度都隨著NaCl濃度的升高而顯著降低 (P<0.05),下角質層、角質層總厚度在NaCl 濃度為250 mmol/L時分別顯著降低了47%、39%;上角質層沒有顯著的變化,但也呈現下降的趨勢;對其表皮而言,除上表皮厚度在NaCl濃度為150 mmol/L時顯著上升了33%外 (P<0.05),下表皮和總表皮厚度均無顯著變化。

表2 不同NaCl濃度對兩種紫花苜蓿葉片角質層和表皮厚度的影響

2.3 NaCl濃度對不同品種紫花苜蓿葉肉組織厚度和葉肉導度相關指標的影響

葉肉組織由柵欄組織和海綿組織構成。由表3可知,WL363HQ品種的柵欄組織厚度在對照處理中的厚度為(43.5±2.8) μm,NaCl濃度為150、250 mmol/L 時分別顯著增加了35%、46%(P<0.05),葉肉組織厚度也從對照組的(86.3±5.6) μm顯著增加了31%、25% (P<0.05),而海綿組織厚度無顯著變化,由此造成了柵欄組織厚度百分比、柵海比、葉肉組織厚度百分比均顯著增加(P<0.05),而海綿組織厚度百分比則顯著下降 (P<0.05)。然而,對于WL712品種而言,除了柵欄組織厚度在NaCl濃度為250 mmol/L時比對照組顯著降低了16% (P<0.05),海綿組織、葉肉組織厚度無顯著變化,3個百分比指標以及柵海比也均無顯著性差異。

表3 不同NaCl濃度對兩種紫花苜蓿葉肉組織厚度和葉肉導度相關解剖指標的影響

Sm、fias、細胞壁厚度都是影響葉肉導度的重要因素之一。鹽脅迫處理以后,WL363HQ品種的Sm、fias變化均不顯著,總體上在NaCl濃度為50、150 mmol/L時較高于對照和最高濃度;細胞壁厚度在對照處理時最大,為(0.9±0.1) μm,在NaCl濃度為150、250 mmol/L時顯著降低,分別降低了22%、33% (P<0.05)。WL712品種的Sm隨濃度升高逐漸降低,在NaCl濃度為250 mmol/L 時較對照降低了26%(P<0.05);細胞間隙分數在NaCl濃度為 50 mmol/L 時較對照顯著提高了48%,在 150 mmol/L 時較對照提高了12%,但在高濃度 250 mmol/L 時與對照無顯著性差異(P≥0.05);WL712的細胞壁厚度在各濃度鹽脅迫處理下的變化均不顯著。

2.4 紫花苜蓿葉解剖指標的主成分分析 (PCA)

將2個品種的所有測量特征指標分別進行主成分分析 (圖2),各指標與前4個PCA主軸的特征值、貢獻率、累計貢獻率如表4所示。品種WL363HQ的前4個主成分軸的累計貢獻率達到81.21%, 即能解釋所測定指標的81.21%的變異。

表4 2個紫花苜蓿品種葉解剖指標的前4個主成分的特征向量、特征值、貢獻率及累計貢獻率

第1主成分軸的貢獻率最大,達到了30.00%,主要與葉肉厚度 (MT)、葉厚度 (LT) 、柵欄組織厚度 (PT) 具有較強的相關性,相關系數分別為0.40、0.37、0.40;第2主成分軸的貢獻率為22.86%,主要由上表皮厚度 (UET)、表皮厚度 (TET) 和柵欄組織厚度百分比 (MT%) 決定,相關系數分別為0.33、0.39、0.35。

WL712品種的前4個主成分軸的累計貢獻率達到79.44%。第1主成分的貢獻率達到28.00%,主要由葉肉組織 (MT)、角質層厚度 (TCT)、葉厚度 (LT) 決定,相關系數分別為0.38、0.33、0.33;第2主成分的貢獻率為22.25%,主要由上表皮厚度 (UET)、下表皮厚度 (LET)、表皮總厚度 (TET) 決定,相關系數分別為0.35、0.40、0.44。

3 討論

3.1 紫花苜蓿葉面積、比葉面積和葉厚度對鹽脅迫的響應

植物葉面積的大小決定著植物光合輻射的有效面積[34],與干物質產量具有密切的關系。WL363HQ的葉面積隨NaCl濃度的升高而降低,這與之前的很多研究[11-12]一致。長期鹽脅迫下植物的能量消耗可能大于能量產生,因此需要減少對葉片擴張的能量投入。較小的葉面積使得植物體的蒸騰面積進一步降低,失水速率減小,故抵御鹽脅迫及防止灼燒的能力也不斷增強,這是一種避鹽機制,這種機制可以限制鹽離子在植物地上部分的積累,并將蒸騰作用造成的水分損失降至最低[18]。與WL363HQ不同的是,WL712的葉面積沒有產生較大的變化,但比葉面積在受到鹽脅迫后顯著增加了,在NaCl濃度為250 mmol/L時增加最明顯。比葉面積增加這種反應有利于更大的全植物碳增益,從而有助于這個品種在鹽堿易發地區獲得更好的農藝性能[35]。

2個品種的葉厚度在鹽脅迫后都顯著地增加了,并在NaCl濃度為150 mmol/L時最明顯,濃度持續升高、葉厚度下降。葉厚度與葉片的儲水能力有關[36]。厚葉通常具有較高的葉綠素,且葉厚度也是與植物產量緊密相關的特征[37]。在高鹽濃度下,更高的葉厚度有助于稀釋細胞液中的鹽濃度,調節滲透平衡[19],并且可以平衡葉面積減小對干物質產量帶來的消極影響。

3.2 紫花苜蓿角質層和表皮厚度對鹽脅迫的響應

葉片表皮是位于葉片表面的一層細胞,角質層是位于葉片表皮外的一層疏水膜,和表皮細胞共同為葉片器官提供支撐和保護[38]。上表皮是葉片的向光面[39],葉片上表皮厚度對葉片表面光的反射和折射具有密切聯系,較低的厚度更利于光的透射[40],但較高的表皮厚度對葉片起到了一個很好的支撐作用。角質層厚度可以賦予葉片機械強度,較厚的角質層更耐撕裂,撕裂力與角質層厚度成正比[41]。本研究結果顯示,WL363HQ品種的角質層、表皮特征均沒有顯著的變化;而WL712品種紫花苜蓿的角質層厚度在高鹽脅迫中顯著減低,這種變化不利于植物對水分的保護以及維持葉片的正常形態,其上表皮厚度在NaCl濃度為150 mmol/L時增加,說明其葉片的光合有效輻射受到的影響較大,最終可能導致葉片擴張延緩,生物量減少等結果。

3.3 紫花苜蓿葉肉組織及葉肉導度對鹽脅迫的響應

葉肉柵欄組織越厚,意味著最大單位體積內葉綠體數量越多,葉片可進行光合作用的位點更多;葉肉海綿組織越厚,海綿組織的比率越小,表示葉肉組織越緊密,細胞間隙所占的比率越小,從而減少蒸騰作用的水分散失和保證更高的水分利用效率[42]。因此柵海比越高越有助于縮短CO2到達葉綠體的距離[18],使葉片的光合效率得到顯著的提升[43]。試驗結果表明,WL363HQ品種的柵欄組織厚度和相對比例隨NaCl濃度增加而顯著增加,而海綿組織厚度百分比降低,柵海比升高,這些變化反映出其對高鹽濃度的適應,是一種保護光合作用過程的適應性反應,該結果與在高濃度鹽脅迫下具有更高柵海比的三色堇一致[16]。然而,WL712品種的柵欄組織厚度在NaCl濃度為150 mmol/L時達到最大,但NaCl濃度達到250 mmol/L時柵欄組織厚度降低,這表明WL712品種對高鹽脅迫的適應性不如WL363HQ品種。

葉肉導度是CO2在葉肉細胞內傳輸阻力的倒數,其大小主要取決于葉片的結構[44],是影響葉片光合速率的關鍵性狀[29]。研究結果顯示,WL363HQ品種的細胞壁厚度隨NaCl濃度升高而減小,而更薄的細胞壁表明葉肉細胞具有更大的CO2導度,有助于提高葉片的光合速率。而WL712品種的Sm隨NaCl濃度的升高而降低,fias、Sm與通常葉肉導度呈正相關關系[45-46],因此其葉肉導度也可能隨之下降。這個結果也證明,相較于WL363HQ品種,WL712品種受到鹽脅迫的負面影響可能更嚴重,不適宜在高鹽濃度的環境下長期生存[44]。

3.4 2個紫花苜蓿品種響應鹽脅迫的主要特征指標

主成分分析結果顯示,WL363HQ品種的柵欄組織厚度、葉肉厚度、葉總厚度是葉片在鹽脅迫中響應的主導特征,主要反映了葉片能量分配的特征,這是影響紫花苜蓿產量的重要性狀,說明提高WL363HQ品種的耐鹽性主要是提高葉片的葉肉厚度、柵欄組織和葉厚度。以前的研究也顯示,在鹽脅迫條件下,植物提高葉厚度和柵欄組織厚度有利于提高其生物量和存活率,葉片可以通過改變厚度來調節單位面積的生物量[47]。

WL712品種的第1主成分中,葉肉組織厚度、柵欄組織厚度、角質層厚度的絕對值較大;第2主成分中,上下表皮、表皮總厚度的絕對值較大。因此,角質層厚度、表皮厚度是WL712品種響應鹽脅迫的主要特征,角質層厚度的變化與葉片的機械強度、水分屏障有關,這些特性與植物在逆境中的生存緊密相關[38,41]。在高鹽濃度下WL712品種的角質層厚度減小和表皮厚度增加是影響其生長發育的主要原因。

4 結論

綜上所述,耐鹽性較強的品種WL363HQ葉片的主要耐鹽策略包括減小葉面積、提高葉片柵欄組織厚度,從而增大光合器官的投入、減少海綿組織的相對厚度以縮短CO2的擴散距離,通過減少細胞壁厚度提高葉肉導度,從而最終提高光合效率以適應鹽脅迫環境。然而,耐鹽性較差的品種WL712雖然表現出了比葉面積和葉厚度增大的特征以積極響應鹽脅迫,但其葉片在高鹽濃度時角質層厚度降低,葉厚度、柵欄組織厚度降低,這些變化均不利于對鹽脅迫環境的適應,最終不利于其在高鹽濃度下生長發育。研究結果揭示了2種不同耐鹽性紫花苜蓿品種在鹽脅迫環境下的主要葉片策略。