H9N2 亞型禽流感病毒感染雞紅細胞引起白細胞介素的免疫應答

劉智民 ，任鵬飛 ，韓心語 ，喬夢麗 ，牛 勝 ，王 穎 ，任建樂 ，趙宇軍 ，張 鼎 ，范瑞文 ，畢玉海 ，2，田文霞

（1.山西農業大學 動物醫學學院，山西 太谷 030801；2.中國科學院微生物研究所病原微生物與免疫學重點實驗室/中國科學院 流感監測與預警中心，北京 100101）

H9N2 亞型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）可引起雞的免疫抑制性疾病，給家禽業帶來巨大的經濟損失。AIV 是20 世紀90 年代初首次在我國雞群中發現和分離的一種病毒，在發現后的幾十年中逐漸發展成大部分地區家禽養殖的地方病[1]。H9N2 AIV 屬于低致病性禽流感病毒，但因其變異能力強、流行范圍廣而成為最難防控的禽流感亞型之一。目前，雖然疫苗防控研究已取得一定進展，但沒有從根本上阻斷其流行和傳播。

紅細胞不僅能夠運輸氧氣，還參與機體的免疫調節反應。1981 年，“紅細胞免疫系統”的概念首次由SIEGEL 等[2]提出，他們的研究鑒定了紅細胞的多種免疫功能，并發現紅細胞是通過免疫黏附作用發揮其免疫功能。人紅細胞是紅細胞免疫領域研究的重點，動物中有關核紅細胞免疫功能方面的研究側重于魚類和爬行類，但關于雞紅細胞參與機體免疫反應的研究較少。模式識別受體的識別是機體抵抗病原感染的第一步，也是機體誘導天然免疫反應的關鍵一步。Toll 樣受體（TLRs）是發揮模式識別功能最重要的受體之一，當外界病原入侵機體，TLRs 能立刻識別病原相關配體，激活下游相應細胞因子，啟動天然免疫應答反應[3]。白細胞介素（Interleukin，IL）是一種細胞因子，現已發現39 種[4]，它們在免疫細胞的成熟、活化、調節中發揮重要作用，可參與炎癥反應和免疫反應。最新研究發現，這些ILs 的mRNA 表達量隨著病毒入侵機體而發生變化。JAHEJO 等[5]研究發現，IL-7在感染馬立克氏病毒（Marek’s disease virus，MDV）的雞紅細胞中的表達量與對照組相比顯著上升，而IL-12和IL-13的表達量顯著降低。董建國等[6]研究發現，PK15（豬腎細胞）感染A型塞內卡病毒（SVA）后，IL-6表達水平顯著上升。BOULASSEL 等[7]和胡寬修等[8]研究均發現，感染HIV-1 的患者體內IL-15和IL-16的表達量明顯上升。雞感染禽白血病病毒（ALV-J）后，單核細胞中IL-18mRNA 的表達水平升高[9]。感染流感A 病毒（Influenza a virus，IAV）后期，患者血清和外周血單核細胞（PBMC）中IL-34表達量升高[10]。因此，鑒定H9N2 感染雞后紅細胞中ILs 表達水平的變化有助于更深入研究H9N2 的致病和免疫機理。

目前，關于H9N2 感染雞紅細胞后ILs 的表達水平變化仍未見報道。本研究通過實時熒光定量PCR 鑒定H9N2 感染雞紅細胞后不同白細胞介素（IL-6、IL-7、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-34）的表達水平，旨在為研究雞紅細胞在感染H9N2 后ILs 相關基因參與免疫調節功能以及防治H9N2 提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 毒株 禽流感病毒H9N2 亞型山西毒株A/chicken/Shanxi/1.23 TGRL003-O/2019 由山西農業大學生物制品實驗室保存；SPF 雞胚購自山東濟南賽福實驗動物養殖有限公司；SPF 雞和H9N2 免疫雞血清購自山西太谷隆科爾公司。

1.1.2 試劑 RNAiso plus 2000、熒光定量PCR 試劑盒(AK6003）、反轉錄試劑盒（AK3020）、淋巴細胞分離液均購自大連Takara 寶生物工程公司。DMEM 培養基購自美國HyClone 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 H9N2 體外感染雞紅細胞 翅靜脈采集SPF 雞新鮮血液，參考NIU 等[11]的方法分離紅細胞（大約5.0×109個）用于后續試驗。試驗組根據紅細胞與H9N2 共孵育的時間分為4 組：0 h 組、2 h組、6 h 組和10 h 組，每組4 個重復。每個離心管中先加入50 μL 紅細胞，然后加入100 μL 的H9N2 AIV 尿囊液（病毒滴度7×㏒2）和900 μL 的細胞維持液DMEM。在對照組的4 個離心管中直接加入50 μL 紅細胞和1 000 μL 的細胞維持液DMEM。將4 組紅細胞與H9N2 混合后在37 ℃培養箱分別孵育0、2、6、10 h 后，2 000 r/min 離心20 min，重新分離紅細胞，然后用PBS 洗滌3 次，用于后續試驗。1.2.2 H9N2感染雛雞 選擇1日齡SPF雛雞48羽，隨機分為攻毒組和對照組（每組各24 羽）。預飼期7 d，預飼期結束后，試驗組滴鼻接種H9N2 亞型禽流感尿囊液（病毒滴度7×㏒2）0.2 mL/只，對照組滴鼻接種相同體積的PBS 緩沖液。攻毒后第3、7、14 天從2 組中各隨機選取5 只進行心臟采血（2 mL/只），抗凝處理后用于后續試驗。

1.2.3 紅細胞的分離 心臟采集4 mL 新鮮血液保存于抗凝管中，采用淋巴細胞分離液分離紅細胞。按淋巴細胞分離液∶血液∶無菌PBS 比例為2∶1∶1使用，首先將抗凝血與等體積無菌PBS 混勻，隨后緩慢傾斜加入到等體積的淋巴細胞分離液中，避免發生混合，2 000 r/min 離心20 min，棄去最上層的血清和中間層的淋巴細胞，分離得到紅細胞，再用無菌PBS 洗滌紅細胞，2 000 r/min 離心12 min，重復3 次。

1.2.4 RNA 提取與cDNA 合成 按照1.2.3 方法從血液樣品中分離得到紅細胞，收集25 μL 紅細胞，采用Trizol 法提取總RNA?？俁NA 的濃度和純度通過1.5%瓊脂凝膠電泳和核酸測定儀檢測。評估核糖核酸質量的標準是凝膠中可以看到28 S和18 S 條帶且RNA 的A260/A280值為1.9～2.1。根據反轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）的操作步驟，將總RNA 反轉錄為cDNA，保存至-20 ℃，用于后續的熒光定量PCR 檢測cDNA。

1.2.5 熒光定量PCR 根據NCBI 數據庫中8 種白細胞介素的CDS 序列信息，使用Primer 5.0 軟件設計引物，引物序列如表1 所示。熒光定量PCR 采用10.0 μL 反應體系，其中SYBR?Premix Ex Taq?II（2×）5.0 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.1 μL，上下游引物各0.25 μL（100 μmol/L），cDNA 模板1.0 μL，ddH2O 3.4 μL。反應條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，共42 個循環，每個樣品設置4 個重復。

表1 定量PCR 引物信息Tab.1 Primers of real-time qPCR

1.3 數據分析

以18S rRNA 作為標準內參基因，使用2-ΔΔct方法計算目的基因在不同時間段試驗組的表達差異。使用GraphPad Prism 5.0 進行上述基因表達量數據的統計分析，結果以平均值±標準誤表示，P＜0.05代表具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 體外感染H9N2 AIV 后雞紅細胞中ILs 相關基因的mRNA 表達變化

熒光定量PCR 結果如圖1 所示，H9N2 體外感染雞紅細胞后，與對照組相比，IL-6的表達水平在感染后期（6、10 h）顯著上升（P＜0.05）；IL-7在0、6 h 顯著上升（P＜0.05），在2 h 顯著下降（P＜0.05）；IL-12的表達量在0、6 h 都顯著升高（P＜0.05），0 h 的表達量高于6 h；IL-13的表達水平在感染病毒后0、6 h 顯著下降（P＜0.05）；IL-15在感染早期（0 h）顯著上調（P＜0.05），而在感染的中間點（2、6 h）顯著下調（P＜0.05）；IL-16僅在感染后2 h 顯著下調（P＜0.05），在其余感染時間點無顯著變化；IL-18在感染第2、6 h 顯著上調（P＜0.05），并且在6 h 上調程度更高；IL-34在感染后的0、2、6、10 h 表達水平有輕微的波動，變化規律不明顯。

圖1 體外H9N2 AIV 感染雞紅細胞后各IL 相關基因mRNA 表達變化Fig.1 mRNA expression change of the IL-related genes in chicken erythrocytes infected by H9N2 AIV in vitro

2.2 體內攻毒后雞紅細胞中IL 相關基因的mRNA表達變化

熒光定量PCR 結果如圖2 所示，體內感染H9N2 AIV 后，與對照組相比，IL-6的表達水平在攻毒3 d 顯著下降（P＜0.05），在體內攻毒7 d 顯著上升（P＜0.05）；IL-7在攻毒后的3、7、14 d 都顯著上升（P＜0.05），并在14 d 時達最高；IL-12、IL-13、IL-15、IL-16的表達量在攻毒后的7、14 d 顯著升高（P＜0.05），并且在攻毒14 d 的表達量高于7 d 表達量；IL-18的表達水平在體內攻毒3 d 沒有顯著變化，7 d 時顯著上升（P＜0.05），而在14 d 時顯著下降（P＜0.05）；IL-34在體內攻毒3 d 時顯著下降（P＜0.05），7、14 d 顯著上升（P＜0.05）。

圖2 體內攻毒后雞紅細胞中各IL 相關基因mRNA 表達變化Fig.2 The mRNA expression change of the IL-related genes in chicken erythrocytes infected by H9N2 AIV in vivo

3 結論與討論

近年來，雞紅細胞的免疫調節功能受到越來越多的關注。TLR 已被確定為脊椎動物先天免疫識別的關鍵受體之一[12-13]，近期研究發現，雞紅細胞可表達多種TLRs[14]。IL 可以通過TLR 與其配體的相互作用來誘導ILs 的表達，如IL-1β、IL-6和IL-8[15]。本研究結果顯示，雞紅細胞中8 個免疫相關基因IL-6、IL-7、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18和IL-34均表達，這些基因可能通過表達水平的變化參與紅細胞的免疫調節作用。

IL-6是一種多種功能細胞因子，既是一種促炎細胞因子，又是一種抗炎的肌氨酸，在雞的免疫反應中起著重要的調節作用[16]。IL-6被證明具有很強的生物佐劑活性，可增強機體免疫功能[17]。本研究結果顯示，IL-6的mRNA 表達水平在體內攻毒后3 d 顯著下降，可能是由于病毒增殖速度快，在體內拷貝數較高，抑制了IL-6的表達，導致其在3 d表達量降低。IL-6的mRNA 表達水平在感染后期（體外孵育后6、10 h 和攻毒后的7 d）表達量顯著上調。有報道稱，IL-6能夠有效改善感染流感病毒引起的肺損傷[18]，據此推測IL-6的mRNA 表達水平在感染后期升高，一方面改善了病毒感染對機體的損傷；另一方面增強了機體的免疫功能，對機體免疫穩態維持起調節作用。

IL-7主要由淋巴組織、胸腺和骨髓的基質細胞產生，不僅在T 細胞分化中起作用，也在B 細胞的分化、增殖、成熟和維持過程中發揮重要作用[19-20]。IL-7是一種促炎細胞因子，其在細胞內的表達和活化可刺激炎性細胞產生大量致炎因子，致炎因子可調控炎癥過程各組分之間的相互作用，維持機體免疫平衡。有研究表明，IL-7重組蛋白具有較強的免疫增強活性[21]。本研究結果顯示，IL-7的表達水平在體外感染H9N2 AIV 后0、6 h 以及體內攻毒后的3、7 d 顯著上升，這與HIV 感染者體內IL-7水平升高結果一致[22]，推測紅細胞在該時間段可能通過上調IL-7的表達量來提高B 細胞和T 細胞免疫功能，控制由病毒感染引起的炎癥過程，但其具體的免疫機制還有待進一步證實。

IL-12是由Th1 細胞及樹突細胞分泌的一種促炎性細胞因子，可以調節輔助T 細胞的分化，誘導NK 細胞和Th1 細胞分泌γ-干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）。IFN-γ 屬于II 型干擾素，在免疫調節和抗病毒方面發揮重要作用。雞IL-12的結構和功能與哺乳動物IL-12相似[23]，并且重組IL-12可作為生物佐劑在雞脾細胞中誘導高水平的IFN-γ表達。本研究結果顯示，隨著感染的時間增加，病毒的載量和活性逐漸降低，IL-12的表達量也隨之降低，這與李潔萍等[24]的試驗結果一致，其結果顯示，慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染患者血清蛋白IL-12水平和HBV DNA 載量呈現正相關。但值得注意的是，體內IL-12的mRNA 表達量的變化趨勢與體外表達量變化趨勢相反，說明體內外免疫機制不同，具體機制還有待進一步證實。

IL-13是一種抗炎細胞因子，屬于B 細胞因子家族，主要在機體體液免疫反應中發揮作用，可通過參與機體免疫反應、造血和刺激急性期反應促進宿主防御機制[25]，并可顯著降低細胞毒性單核細胞功能和抑制單核細胞分泌促炎性遞質進而控制炎癥反應。李杰等[26]研究健脾益氣方對人類免疫缺陷患者（Human immunodeficiency virus，HIV）體內病毒載量與IL-13相關性時，發現IL-13水平在治療前后存在明顯差異，治療后體內病毒載量降低且IL-13水平顯著升高。有文獻報道，IL-13表達量的升高影響了病毒DNA 合成，顯著降低HIV 病毒的感染性，對病毒活性有抑制作用[27]。本試驗結果顯示，隨著攻毒時間的推移，IL-13的表達水平在檢測的3 個時間點（3、7、14 d）逐漸上升，與前2 個研究結果完全一致。

IL-15在NK 細胞發育、成熟、增殖、活化以及向炎癥部位的遷移具有調節能力，對NK 細胞免疫應答有重要作用，因此，能夠響應感染并抑制病毒復制。哺乳動物體內的IL-15 在B 細胞的增殖和分化、CD4+T 細胞的發育、自然殺傷細胞的增殖中都具有重要作用，在炎癥反應中IL-15通過多種途徑發揮促炎癥作用。LIM 等[28]研究表明，雞IL-15在增強體液免疫應答過程中發揮作用。BOULASSEL等[7]研究發現，感染HIV-1 患者血液中的IL-15的水平高于健康者，但在抗病毒治療后IL-15的水平又恢復了正常。此外，一些研究者還發現，感染人類免疫缺陷病毒1 亞型（Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）的患者患血液病毒癥的概率與IL-15的水平密切相關，尤其是IL-15表達水平升高或者不穩定的患者[29]。IL-15的mRNA 表達量在感染后0 h 顯著升高，之后表達量下降，這與前面2 個的研究結果一致，說明IL-15在抵抗禽流感H9N2 早期感染中發揮重要作用，IL-15也可以作為體外早期感染禽流感H9N2 AIV 的一個特征因子。體內IL-15的表達量在攻毒后的7、14 d 顯著升高，沈桂堂等[30]研究發現，重型肝炎患者的IL-15水平在一定程度上反映了肝臟炎癥嚴重程度，據此推測感染禽流感H9N2 AIV 后引發了機體的炎癥反應，但仍需進一步證實。

IL-16作為一種免疫調節細胞因子，主要發揮促炎癥的作用。有研究表明，IL-16在CD4+Th1 細胞的募集和激活中起重要作用，它通過刺激炎性細胞因子的分泌和促進T 淋巴細胞的活化參與炎癥性疾病[31]。IL-16能夠促進CD4+淋巴細胞、單核巨噬細胞及嗜酸性粒細胞的應答反應。IL-16促進這些免疫細胞產生應答的主要原因是它們都能表達CD4。CD4 是IL-16的主要受體，二者結合后，可以產生一系列免疫反應，比如通過抑制HIV-1 的啟動子抑制病毒復制。一些研究結果顯示，白細胞介素IL-16的表達量在攻毒后逐漸上升，這與丙型肝炎病毒（Hepatitis virus C，HCV）患者經抗病毒治療后IL-16表達上調相似。說明在感染初始階段，IL-16的表達量較低，免疫功能被抑制，但是隨著攻毒時間的延長，機體自身的免疫力提高，病毒載量也相應降低，以致IL-16的表達量升高。胡寬修[8]研究也發現，在感染HIV-1 的患者中，治療組的患者IL-16的表達水平高于對照組患者，且差異具有顯著性。

IL-18在CD4+和CD8+T 細胞反應的發展和自然殺傷細胞的誘導中發揮重要功能，同樣具有促炎癥作用。IL-18在機體的先天免疫和獲得性免疫方面都起到重要作用[32]。袁朋等[33]在昆蟲細胞中利用桿狀病毒表達載體表達了雞白介素18（cIL-18），研究發現，cIL-18蛋白可在MDCK 細胞中抑制H9N2 AIV 的復制。本研究結果顯示，IL-18的表達量在感染后2、6 h 和攻毒后7 d 都顯著上調，說明IL-18可能起到了免疫作用，抑制了H9N2 AIV的復制，維持了機體的免疫平衡。在研究IL-18與乙肝病毒形肝炎（Hepatitis B virus，HBV）感染的相關性時，有研究發現，HBV 與IL-18表達密切相關[34]，其可作為HBV 診斷和療效檢測的新指標，提示IL-18也可以作為感染H9N2 AIV 的一個指標。

IL-34的功能尚不完全清楚。在哺乳動物中，IL-34的功能包括促進趨化因子以及炎癥細胞等的生成和釋放、刺激巨噬細胞和單核細胞的增殖與分化，從而發揮促炎作用。IL-34與巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF 或CSF-1）共用一個受體CSF-1R，當配體與受體結合后可調節單核細胞和巨噬細胞的生物學功能，所以，研究集中于IL-34在一些炎癥性疾病中的作用。慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染患者肝臟纖維化階段血清中IL-34的表達量明顯升高，此外，HCV 感染和炎癥因子可促進體外培養的肝臟細胞表達IL-34。本研究結果顯示，IL-34的表達量在體外感染H9N2 AIV 的0、2、6、10 h沒有發生差異變化，一定程度上說明IL-34在體外發揮的作用較小。攻毒后IL-34的表達量在7 d 和14 d 顯著上升，推測機體感染H9N2 亞型禽流感病毒后引發了強烈的炎癥反應，導致機體產生了大量的炎性因子。YU 等[35]也報道了同樣的結果，發現在感染流感A 病毒（IAV）后期，患者血清和外周血單核細胞中（PBMC）中IL-34表達量升高。IL-34的表達量在攻毒的7 d 較14 d 相對表達量更高，可能是由于隨著感染時間的增加，機體自身的免疫力增強，而鳥類本身可能在感染后期獲得一些針對特定病原體或感染的免疫力，導致14 d 的攻毒水平和炎癥因子水平較7 d 低。

本研究結果顯示，無論是雞紅細胞在培養條件下感染H9N2 AIV，還是易感雛雞體內攻毒H9N2 AIV，雞紅細胞中IL-6、IL-7、IL-12、IL13、IL-15、IL-16、IL-18和IL-34共8 種白細胞介素呈現了轉錄水平上的變化。表明雞感染H9N2 亞型禽流感病毒后紅細胞可能發生了相應的免疫應答反應，起到抵抗病毒感染、調節機體免疫穩定的作用。