107份小麥育種親本重要農藝性狀基因的KASP檢測

宋曉朋, 孔子明

(1.駐馬店市農業科學院, 河南 駐馬店 463000; 2.遂平縣農業農村局, 河南 遂平 463100)

小麥是最重要的糧食作物之一,選育和推廣高產、多抗、高效的小麥品種對保障國家糧食安全具有重要作用。傳統的經驗育種主要對小麥主要目標性狀進行選擇,以達到聚合目標性狀優異等位基因[1],進而選育出符合育種目標的品種,這種育種方式是當前小麥品種選育的主要手段,但這種育種手段易受到育種家的經驗和環境條件的影響,新品種的選育效率較低、育種周期長[2]。近年來,隨著分子生物學技術的發展,小麥分子標記輔助育種越來越受到育種家的重視[3]。功能標記是依據與表型性狀相關的功能基因的等位變異開發的分子標記,是小麥分子標記輔助育種的理想標記[4]。Liu等[5]對小麥農藝性狀、抗逆性等的功能標記進行了總結,為小麥分子標記輔助選擇與常規育種結合提供了途徑。

競爭性等位基因特異性PCR(Kompetitive Allel-Specific PCR,KASP)是一種利用熒光檢測技術對基因組中特定位點進行雙等位基因監測的基因分型技術,已經用于小麥種質資源的鑒定[6]。Rasheed等[7]對70個與小麥性狀相關KASP標記進行了驗證,分子標記檢測效率得到了極大提高,為分子標記輔助育種和種質資源的鑒定提供參考。張維軍等[8]利用粒重基因相關的KASP標記對寧夏灌區小麥種質的粒重進行檢測,篩選出聚合多個基因的優異單位型的種質;權有娟等[9]通過KASP標記對青海和西藏小麥種質的光周期基因進行檢測,發現光周期不敏感型在小麥品種中占主導地位;王志偉等[10]利用株高和粒重相關的KASP標記對云南小麥種質進行篩選,鑒定含有目標基因的優異種質;張穎君等[11]對336份小麥種質材料的抗赤霉病基因進行KASP標記監測,發掘攜帶Fhb1基因的材料,為黃淮冬麥區抗赤霉病育種提供參考。前期課題組保存了一批農藝性狀較好的核心育種材料,但對這些品種攜帶的重要性狀的功能基因還不清楚,為提高育成品系中優異等位基因的比例,本研究利用與小麥重要性狀相關的KASP標記對育種親本進行檢測,明確育種材料中相關功能基因的單倍型的比例,為進一步利用材料和分子標記輔助選擇育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試的107份小麥品種(系)為本課題組收集保存的小麥育種親本,其中陜西育成的品種(系)71份,其他地方(河南、山東、河北、江蘇)育成的品種(系)為36份,參試品種(系)的信息詳見表1。

表1 供試材料名稱及來源

1.2 KASP標記檢測

參試材料于三葉期進行采樣,采用CTAB法提取葉片DNA[12],DNA質量控制通過Nanodrop One檢測完成。相關性狀功能基因包括2個株高相關基因(Rht-B1、Rht-D2),3個光周期基因(Ppd-A1、Ppd-B1和Ppd-D1),4個春化基因(Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1、VRN-B3),3個早熟基因(TaELF3-B1、TaElf3-D1、TaMOT1-D1),1BL/1RS易位系,12個籽粒性狀相關基因(TaCwi-A1、TaCKX-D1、TaGASR7-A1、TaSus1-7A、TaSus1-7B、TaSus2-2A、TaSus2-2B、TaGS-D1、TaGS5-A1、TaGW2-6A、TaGW2-6B、TaTGW6-4A),4個穗發芽抗性相關基因(TaPHS1、TaMFT-A1、Vp-B1、TaSdr-B1),7個抗旱相關基因(CWI-4A、CWI-5D、TaMoc-A1、TaSST-A2、TaSST-D1、Dreb-B1、1-feh-w3),14個抗病蟲基因(Fhb1、Cre8、Rlnn1、Pch1、Sr2、Sr36、Lr9、Lr14a、Lr21、Lr34、Lr47、Lr67、Sbm1、Tsn1)。KASP標記檢測程序參考Rasheed等[7]設計的流程,標記檢測由西北農林科技大學完成。

1.3 數據處理

試驗材料基因分型結果的統計用Excel軟件和Origin2018軟件完成,聚類圖采用類平均法(UPGMA)進行繪制并在iTOL網站進行優化處理。

2 結果分析

2.1 適應性相關基因的檢測

在株高相關基因檢測中,主要對主效株高基因Rht-B1和Rht-D1進行KASP標記檢測,供試材料中攜帶2個矮稈基因的優勢單倍型分別有58份和76份,其中Rht-B1矮稈單倍型在陜西育成材料中比例較低,Rht-D1矮稈單倍型在陜西育成材料中比例較高;光周期和春化基因與小麥的適應性密切相關,在光周期基因的KASP標記檢測中,光周期不敏感單倍型Ppd-A1a、Ppd-B1a在供試材料中的比例分別為83.18%和94.39%(圖1),在陜西和其他地方育成的材料中比例較為接近,而供試材料全部含有Ppd-D1優異等位基因;春化基因Vrn-A1和Vrn-B1晚開花的單倍型在供試材料中占比都達到了90%以上,Vrn-D1晚開花單倍型在陜西和其他地方育成的材料中比例分別為76.06%和63.89%(表2),Vrn-D1是主要的春化基因;早熟基因中,同時攜帶3個早開花基因單倍型在供試材料中只有航麥247和輪選987;小麥品種中攜帶1BL/1RS易位系可以提高品種的適應性,供試材料有44份含有1BL/1RS易位系,占41.12%,陜西育成的材料中攜帶1BL/1RS的比例較低。

圖1 供試材料部分KASP標記等位基因占比

圖2 107份小麥種質基于KASP標記的聚類分析結果

表2 不同地方育成種質部分農藝性狀相關基因的KASP標記檢測

2.2 籽粒性狀相關基因的檢測

籽粒大小和千粒重是小麥籽粒產量的重要影響因素,本研究利用12個與籽粒大小和千粒重相關的基因對供試材料進行檢測,在供試材料中沒有檢測到千粒重高的單倍型TaCKX-D1a,而供試材料含有TaSus1-7A、TaGW2-6B和TaTGW6-4A高千粒重單倍型的比例都較高;TaSus1-7B、TaSus2-2A、TaSus2-2B、TaGS-D1、TaGW2-6A在陜西和其他地方育成的材料中高千粒重單倍型的比例相差不大,TaCwi-A1優異單倍型的比例在陜西和其他地方育成的材料中占比分別為40.85%和69.44%(表2),差別較大;籽粒大優異單倍型TaGASR7-A1-H1c在陜西育成的材料中占比較低,而其他地方的材料都攜帶了這個基因的優異單倍型,TaGS5-A1b優異單倍型在陜西和其他地方育成材料中的比例分別為92.96%和69.44%(表2),相差較大。

2.3 抗穗發芽相關基因的檢測

TaPHS1是白粒小麥中的抗穗發芽基因,供試材料攜帶該基因穗發芽抗性單倍型的比例為82.24%,在陜西和其他地方育成的品系中抗性比例差別不大。TaMFT-A1、Vp-B1和TaSdr-B1也是小麥穗發芽抗性基因,這些基因的優異單倍型在陜西和其他地方育成材料中的比例都不高,聚合這些優異等位基因對小麥抗穗發芽品種選育具有重要意義。

2.4 抗旱基因的檢測

供試材料大多都攜帶抗旱基因CWI-5D和TaSST-A2優異單倍型,CWI-4A和TaMoc-A1在干旱情況下能使品種維持較高的穗粒數,CWI-4A優異單倍型比例在供試材料中較高,而TaMoc-A1優異單倍型的比例較低,這2個基因優異單倍型在陜西育成材料中的比例較低;TaSST-D1和1-feh-w3優異單倍型在其他地方育成材料的比例較高,分別為80.56%和47.22%(表2),而陜西育成的材料含有Dreb-B1的比例較高,占29.58%。

2.5 抗病蟲基因的檢測

Fhb1是小麥赤霉病抗性的主效基因,在供試材料中沒有攜帶赤霉病抗性基因。小麥稈銹病抗性基因Sr2和Sr36在陜西育成的材料都沒有檢測到,Sr36抗性基因在其他地方育成的材料只有3份,比例偏低?？谷~銹病基因Lr21、Lr34、Lr47、Lr67在供試材料中均沒有檢測到抗性等位基因,只有4份含有Lr9抗性基因,而Lr14a抗葉銹病基因在陜西育成的材料中的比例較低,僅為15.49%。Sbm1是抗土傳黃花葉病的基因,僅有5份材料攜帶抗性基因,陜西育成材料中攜帶抗褐斑病基因Tsn1的比例較高,達到85.92%?？购坦孺吣揖€蟲病基因Cre8在供試材料中的比例較低,僅有6份材料攜帶抗性基因,Rlnn1是小麥抗根腐線蟲病基因,在陜西育成材料中的比例較高,占26.76%。

2.6 基于KASP標記聚類分析

為了深入了解供試材料之間的親緣關系,采用功能基因的KASP標記對107份小麥種質進行聚類,航麥247、輪選987和淮麥22聚為一類,中優9507單獨聚為一類,一些種質基于功能基因KASP的遺傳關系較近,如秦鑫216與小偃22、武農36與武農3號等,不同地方選育出的種質在聚類的不同分支中均有出現,材料之間出現了較強的融合,沒有明顯的分離現象。

3 討 論

小麥1BL/1RS易位系與小麥抗病、抗逆等密切相關,攜帶該1BL/1RS易位系能夠提高小麥品種的產量和增強對環境的適應能力,但是對小麥品質性狀有不利的影響,會使面團粘性增大,烘烤品質變劣[13]。本研究供試材料中1BL/1RS易位系的比例占41.12%,陜西育成的材料中比例相對較低,占38.03%,這與本地區小麥品種選育重視品質育種有關。株高對小麥產量影響較大,在小麥品種后代選擇中是重要指標,應用矮稈基因降低株高和提高籽粒產量是小麥高產育種的主要育種策略之一[14],本研究中2個主效矮稈基因Rht-B1和Rht-D1優勢單倍型在陜西和其他地方育成的材料中占比差別較大,對育成材料影響較大。Vrn-D1是主要的春化基因,在供試材料中多態性較高。小麥產量性狀可利用的功能標記較少,目前主要研究集中于小麥籽粒性狀功能標記的開發,本研究中小麥籽粒性狀的KASP標記都為微效基因控制,基因效應較小,聚合多個有利基因位點能夠增加粒重。同樣,抗穗發芽也都是微效基因,本研究中陜西育成的材料中有8份材料聚合了4個微效穗發芽抗性基因,可以作為抗穗發芽的重要親本來源。在抗旱基因檢測中,大部分材料沒有攜帶多個抗旱基因,師欒02-1和金禾9123聚合了多個抗旱基因,這與河北地區重視抗旱育種有關[15]。小麥抗病基因可以利用的功能標記較少,本研究在多份種質中檢測到Lr14a基因,該基因位于小麥7BL染色體上,可以作為抗葉銹的種質,但葛潤靜等[16]研究發現,該基因已經喪失對葉銹病的抗性。本研究利用功能標記對育種親本進行優異等位基因的檢測,通過分子標記輔助選擇聚合優異性狀基因,為品種選育提供依據。

隨著小麥高通量測序技術的不斷發展,許多性狀的功能基因得到克隆,功能基因的KASP標記數量逐步增多,但是在小麥分子育種中應用還面臨著許多挑戰[17]。本研究利用功能基因的KASP標記對試驗種質檢測中發現部分功能基因標記的多態性較低,不能有效區分材料,這可能與試驗選用的種質有關?；蚓酆鲜切←湻肿佑N的主要策略,本研究中抗病和產量性狀基因較少,隨著小麥基因定位的不斷深入,更多的KASP標記加入到分子標記輔助育種體系中。篩選出育種價值較高的功能基因標記是小麥分子標記輔助選擇育種的主要程序,使用功能基因KASP標記對育種親本進行檢測,明確育種材料中重要性狀的優異等位基因分布,通過不同的育種手段將多個有利等位基因聚合,為后續實現常規育種與分子標記輔助育種結合提供重要參考。