桔皮素固體脂質納米粒制備及其體內藥動學研究

楊麗萍，李偉宏

（河南應用技術職業學院，河南 鄭州 450042）

桔皮素屬于天然多甲氧基黃酮類化合物，在柑橘屬植物果皮及枳實、青皮、陳皮等中藥中均可提取得到［1-2］，具有抗炎、抗腫瘤、降血糖、保護神經、保護皮膚、護肝、改善記憶等活性［1，3］，并且毒性極?。?］，可應用于臨床，但該成分飽和溶解度僅為（15.12±0.18） μg/mL，導致其溶出度極低； 油水分配系數logP值為3.5［5］，表明其脂溶性良好。文獻［6］ 報道，桔皮素容易受胃腸道pH值影響而發生降解，并且該成分也是P-糖蛋白底物［7］，口服絕對生物利用度僅為6.02%［8］。目前，桔皮素制劑有自微乳［7］、淀粉納米粒［9］等類型。

固體脂質納米?？商岣咚幬锶芙舛?、溶出度，增加被包載藥物體內吸收［10-12］。辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol） 是一種非離子型表面活性劑，可通過減少體內代謝、抑制P-糖蛋白外排等作用來提高藥物生物利用度［13-14］。本實驗制備桔皮素固體脂質納米粒，并考察該制劑體內藥動學，以期為相關制劑開發提供參考。

1 材料

JC-TP3/B 型電子分析天平（青島精誠儀器儀表有限公司）； Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； DJ-1A 型實驗室數顯恒溫磁力攪拌器（佛山輕子精密測控技術有限公司）；Master-sizer 型粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）； TMX-22R 型高速離心機（美國Beckman 公司）； PS-30 型超聲儀（深圳市得康科技有限公司）； MDS-2008DS 型溶出試驗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）； TK-201 型X 射線粉末衍射儀（北京泰坤工業設備有限公司）； DSC-3 型差示掃描量熱儀（梅特勒托利多科技有限公司）； YTST-24 型水浴氮吹儀（南京曉曉儀器設備有限公司）。

桔皮素原料藥（批號20200222，純度97.6%，成都格利普生物科技有限公司）； 桔皮素對照品（批號K177866，西安開來生物工程有限公司）。單硬脂酸甘油酯（批號201025，北京鳳禮精求醫藥股份有限公司）； 辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol，批號20210158，上海嘉法獅貿易有限公司）； 泊洛沙姆188 （批號20191025，上海運宏化工制劑輔料技術有限公司）。

SD 大鼠，雌雄兼具，體質量200 ～240 g，購自河南省動物實驗中心，實驗動物生產許可證號SCXK （豫） 2020-0001。

2 方法與結果

2.1 桔皮素含量測定 采用HPLC 法。

2.1.1 色譜條件 Agilent SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相甲醇-水（70 ∶30）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長375 nm；進樣量10 μL。

2.1.2 線性關系考察 精密稱取桔皮素對照品26.80 mg，置于100 mL 量瓶中，甲醇超聲溶解，靜置至室溫后甲醇稀釋定容，得到268 μg/mL 貯備液，密封保存，流動相依次稀釋至13.4、6.7、1.34、0.67、0.335、0.067 μg/mL，在 “2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積（Y） 對其質量濃度 （X） 進行回歸，得方程為Y＝20.155 7X+0.163 8 （r＝0.999 8），在0.067～13.4 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.1.3 供試品溶液制備 精密吸取固體脂質納米?；鞈乙? mL，轉移至50 mL 量瓶中，加30 mL甲醇超聲（功率250 W） 處理3 min，甲醇稀釋定容并搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取5 mL 續濾液，流動相稀釋至2 倍，即得。

2.1.4 方法學考察 取同一份供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得桔皮素含量RSD 為1.04%，表明儀器精密度良好。取同一份固體脂質納米粒，按“2.1.3” 項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得桔皮素含量RSD 為1.77%，表明該方法重復性良好。取“2.1.3” 項下供試品溶液適量，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得桔皮素含量RSD 為0.89%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。取9 份固體脂質納米?；鞈乙?，每份0.5 mL，轉移至50 mL 量瓶中，分為低、中、高3 組，每組3 份，分別加入“2.1.2” 項下貯備液0.8、1.2、1.6 mL，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得桔皮素平均加樣回收率分別為99.48%、100.94%、101.42%，RSD 分別為0.62%、0.34%、0.58%。

2.2 固體脂質納米粒制備 采用熔融-高壓均質法。稱取桔皮素原料藥30 mg，置于圓底燒瓶中，加入處方量固態脂質，65 ℃水浴攪拌（800 r/min）至熔融狀態； 配制一定質量濃度的Labrasol、泊洛沙姆188 溶液各50 mL，攪拌至相同溫度，作為水相，將水相加到熔融液中，攪拌10 min 后高壓均質，置于-20 ℃冰箱中冷卻8 min，取出，0.45 μm微孔濾膜過濾，補加蒸餾水至50 mL，搖勻，即得。

2.3 包封率、載藥量、粒徑、Zeta 電位測定 精密吸取固體脂質納米?；鞈乙? mL，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，測定桔皮素總量m總；另精密吸取1 mL，置于超濾管中（截留分子量10 kDa），12 000 r/min 離心20 min，取續濾液，測定游離桔皮素量m游離，計算包封率、載藥量，公式分別為包封率＝ ［（m總-m游離） /m總］ ×100%、載藥量＝ ［（m總-m游離） /m］ ×100%，其中m為藥物、載體總量。再取固體脂質納米?；鞈乙哼m量，蒸餾水稀釋至40 倍，搖勻，取適量至比色皿中，測定粒徑、Zeta 電位，平行3 次。

2.4 處方優化 采用單因素試驗。

2.4.1 固態脂質種類 參考文獻［15-16］ 報道，取單硬脂酸甘油酯、雙硬脂酸甘油酯、硬脂酸各1 g，加熱至高于熔融點10 ℃，加入2 mg 桔皮素原料藥，攪拌溶解，測定溶解量，結果見表1。由此可知，單硬脂酸甘油酯對桔皮素的溶解量最大，故選擇其作為固態脂質，并確定加熱溫度為65 ℃。

表1 固態脂質種類對桔皮素溶解量的影響（n＝3）Tab.1 Effects of solid lipid kind on the dissolution amount of tangeretin （n＝3）

2.4.2 脂藥比 固定桔皮素用量30 mg，Labrasol用量0.16%，泊洛沙姆188 用量1.2%，固液脂質比5 ∶1，均質壓力80 MPa，均質次數8 次，考察脂藥比對包封率、載藥量的影響，結果見圖1。由此可知，隨著脂質用量增加包封率先升高后趨穩，而載藥量先升高后降低，當脂藥比大于15 ∶1 后包封率基本不再增加，但載藥量逐漸降低，最終確定為15 ∶1。

圖1 脂藥比對包封率、載藥量的影響（n＝3）Fig.1 Effects of lipid-drug ratio on encapsulation efficiency and drug loading （n＝3）

2.4.3 泊洛沙姆188 用量 固定桔皮素用量30 mg，脂藥比15 ∶1，Labrasol 用量0.16%，均質壓力80 MPa，均質次數8 次，考察泊洛沙姆188用量對包封率、載藥量的影響，結果見圖2。由此可知，隨著泊洛沙姆188 用量增加包封率、載藥量先升高后降低，前者用量為1.0%、1.2%時后兩者接近，為了降低成本，最終確定為1.0%。

圖2 泊洛沙姆188 用量對包封率、載藥量的影響（n＝3）Fig.2 Effects of poloxamer 188 consumption on encapsulation efficiency and drug loading （n＝3）

2.4.4 Labrasol 用量 固定桔皮素用量30 mg，脂藥比15 ∶1，泊洛沙姆188 用量1.0%，均質壓力80 MPa，均質次數8 次，考察Labrasol 用量對包封率、載藥量的影響，結果見圖3。由此可知，Labrasol 用量大于0.16% 時包封率、載藥量降低，這可能與其增溶作用有關，最終確定為0.16%。

圖3 Labrasol 用量對包封率、載藥量的影響（n＝3）Fig.3 Effects of Labrasol consumption on encapsulation efficiency and drug loading （n＝3）

2.4.5 均質壓力 固定桔皮素用量30 mg，脂藥比15 ∶1，Labrasol 用量0.16%，泊洛沙姆188 用量1.0%，均質次數8 次，考察均質壓力對包封率、載藥量的影響，結果見圖4。由此可知，均質壓力小于80 MPa 時對包封率、載藥量的影響較小，而大于90 MPa 時兩者降低，表明壓力過大時會對固體脂質納米粒產生破壞作用，由于適度壓力有利于形成較小粒徑［13］，最終確定為80 MPa。

圖4 均質壓力對包封率、載藥量的影響（n＝3）Fig.4 Effects of homogeneous pressure on encapsulation efficiency and drug loading （n＝3）

2.4.6 均質次數 固定桔皮素用量30 mg，脂藥比15 ∶1，Labrasol 用量0.16%，泊洛沙姆188 用量1.0%，均質壓力80 MPa，考察均質次數對包封率、載藥量的影響，結果見圖5。由此可知，均質8 次時包封率、載藥量降低，為減少過度均質對固體脂質納米粒的影響，最終確定為6 次。

圖5 均質次數對包封率、載藥量的影響（n＝3）Fig.5 Effects of homogeneous fequency on encapsulation efficiency and drug loading （n＝3）

2.5 驗證試驗 根據“2.4” 項下結果，確定最優處方為桔皮素用量30 mg，脂藥比15 ∶ 1，Labrasol 用量0.16%，泊洛沙姆188 用量1.0%，均質壓力80 MPa，均質次數6 次。按上述優化處方平行制備3 批樣品，按“2.3” 項下方法測得平均包封率為（90.16±1.67）%，載藥量為（5.66±0.24）%，粒徑為 （189.76±8.92） nm （圖6），Zeta 電位為- （36.08±1.72） mV （圖7）。

圖6 桔皮素固體脂質納米粒粒徑分布Fig.6 Particle size distribution of tangeretin solid lipid nanoparticles

圖7 桔皮素固體脂質納米粒Zeta 電位Fig.7 Zeta potential of tangeretin solid lipid nanoparticles

2.6 形態觀察 吸取“2.3” 項下固體脂質納米?；鞈乙?（測定粒徑用） 適量，滴到銅網上，1.0%鎢酸鈉溶液染色，置于30 ℃真空干燥箱中25 min，取出，在透射電鏡下觀察形態，發現該制劑呈橢圓形或球形，見圖8。

圖8 桔皮素固體脂質納米粒透射電鏡圖Fig.8 Transmission electron microscopy image of tangeretin solid lipid nanoparticles

2.7 凍干粉制備 取固體脂質納米?；鞈乙?0 mL，加入4% 乳糖，振蕩溶解，由西林瓶底部緩慢加入混懸液 （液面高度約為1.0 cm），在-40 ℃下預凍2 d，立即置于冷凍干燥機中（冷阱溫度-35 ℃，真空度0.1 MPa），冷凍干燥2 d，即得，測得其質量分數為0.98%。蒸餾水復溶凍干粉，測得其平均包封率為（81.52±1.28）%，粒徑為（214.16±10.56） nm，Zeta 電位為（-33.25±1.89） mV。

2.8 溶解度測定 取過量桔皮素、物理混合物（藥物與輔料比例同固體脂質納米粒凍干粉）、桔皮素固體脂質納米粒凍干粉適量，置于三角瓶中，加入模擬胃液（含胃蛋白酶），此時底部有藥物沉淀，置于37 ℃恒溫振蕩器中振蕩2 d，取上層混懸液，12 500 r/min 離心25 min，取上清液，測定溶解度，同法測定在模擬腸液中的溶解度，結果見表2。由此可知，物理混合物、固體脂質納米粒凍干粉均可提高原料藥溶解度，但后者程度明顯大于前者。

表2 桔皮素溶解度測定結果（μg/mL，n＝3）Tab.2 Results of solubility determination of tangeretin（μg/mL，n＝3）

2.9 體外釋藥研究 取桔皮素及其固體脂質納米粒凍干粉適量（桔皮素含量均為10 mg），加入模擬胃液5 mL （含胃蛋白酶），置于透析袋中（截留分子量10 kDa），兩端扎緊，設定轉速為75 r/min，介質溫度為 （37±1）℃，釋放介質為1 000 mL 模擬胃液（含胃蛋白酶），于0、15、30、45、60、75、90、120 min 各取樣5 mL，并補加5 mL模擬胃液，0.45 μm 微孔濾膜過濾，測定累積釋放度，同法測定在模擬腸液（含胰蛋白酶） 中的累積釋放度，取樣點調整為0、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12 h，結果見圖9 ～10。由此可知，原料藥在模擬胃液（120 min 內）、模擬腸液（12 h內） 中的累積釋放度分別為12.43%、25.17%，而固體脂質納米粒分別提高至39.79%、74.56%。

圖9 模擬胃液中桔皮素體外釋藥曲線（n＝6）Fig.9 In vitro drug release curves for tangeretin in simulated gastric juice （n＝6）

圖10 模擬腸液中桔皮素體外釋藥曲線（n＝6）Fig.10 In vitro drug release curves for tangeretin in simulated intestinal juice （n＝6）

2.10 晶型分析 取桔皮素、空白輔料、物理混合物（原料藥與輔料比例同固體脂質納米粒）、桔皮素固體脂質納米粒凍干粉適量，置于樣品槽中，以氧化鋁 （Al2O3） 為參比物，設定升溫速度為10 ℃/min，升溫范圍為30 ～300 ℃，結果見圖11。由此可知，原料藥在152.1 ℃處出現較大的熔點峰； 物理混合物中該熔點峰提前至138.3 ℃，可能是由于單硬脂酸甘油酯等輔料熔點較低，隨著儀器逐漸升溫可能溶解原料藥，從而對熔點產生影響［17］； 固體脂質納米粒圖譜中僅發現空白輔料，未出現原料藥熔點峰，表明它以無定形狀態存在。

圖11 各樣品差示掃描量熱圖Fig.11 Differential scanning calorimetry patterns for various samples

2.11 穩定性研究 取桔皮素、空白脂質、物理混合物（藥物與脂質比例同固體脂質納米粒）、熔融脂質（含桔皮素）、桔皮素固體脂質納米粒凍干粉適量，放置0、3、6 個月（溫度25 ℃，相對濕度65%） 后進行X 射線粉末衍射分析，結果見圖12。由此可知，原料藥在6.9、9.4、12.1、14.6、18.8、24.0、27.8、29.5°等處出現特征晶型峰；物理混合物圖譜中仍可見上述特征晶型峰； 熔融脂質（含桔皮素） 中未見上述特征晶型峰，表明原料藥轉變為無定形物質； 固體脂質納米粒凍干粉在6 個月后仍未見上述特征晶型峰，表明凍干過程未改變原料藥無定形狀態，穩定性良好。

圖12 各樣品X 射線粉末衍射圖Fig.12 X-ray powder diffraction patterns for various samples

2.12 固體脂質納米粒（不含Labrasol） 制備 不加Labrasol，按“2.5” 項下最優處方制備，即得，再按 “2.3” 項下方法測得其平均包封率為（92.12±0.96）%，載藥量為（5.74±0.22）%，粒徑為（263.75±9.11） nm，Zeta 電位為- （33.80±1.14） mV，并按“2.7” 項下方法制成凍干粉。

2.13 體內藥動學研究

2.13.1 分組、給藥與采血 取桔皮素、物理混合物、桔皮素固體脂質納米粒（不含Labrasol） 凍干粉、Labrasol+桔皮素固體脂質納米粒凍干粉、桔皮素固體脂質納米粒 （含Labrasol） 凍干粉適量，0.5%CMC-Na 溶液制成藥液（桔皮素質量濃度均為6 mg/mL）。取30 只大鼠，拋幣法隨機分為5組，按50 mg/kg 劑量灌胃給藥，于0.5、1、2、3、4、5、6、8、12 h 尾靜脈取血各約250 μL，滴入含肝素的離心管中，混勻，3 000 r/min 離心3 min，取上層血漿冷凍保存。

2.13.2 血漿樣品處理 參考文獻［7］ 報道，取反式-1，2-二苯乙烯對照品適量，甲醇制成質量濃度為1 800 ng/mL 的內標溶液。取血漿樣品100 μL、內標溶液50 μL、乙腈0.5 mL，置于離心管中，渦旋1 min，5 000 r/min 離心10 min，收集上清液，45 ℃水浴中氮氣緩慢吹干，100 μL 乙腈復溶。

2.13.3 線性關系考察 取2 μg/mL 對照品溶液適量，甲醇依次稀釋至1 000、500、250、100、50 ng/mL，分別取100 μL 至空白離心管中，按“2.13.2” 項下方法處理，加入空白血漿100 μL，渦旋復溶，作為血漿對照品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），對照品、內標峰面積比值為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程為Y＝0.001 7X+0.249 7 （r＝0.996 5），在50 ～2 000 ng/mL 范圍內線性關系良好。

2.13.4 方法學考察 取低 （50 ng/mL）、中（1 000 ng/mL）、高（2 000 ng/mL） 質量濃度血漿對照品溶液適量，同一天內在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得桔皮素、內標峰面積比值RSD 分別為9.56%、5.78%、8.16%，表明該方法日內精密度良好； 同法連續測定6 d，每天1 次，測得兩者峰面積比值RSD 分別為6.28%、4.32%、5.07% （n＝6），表明該方法日間精密度良好。取血漿樣品適量，室溫下于0、2、4、8、12、24 h在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得桔皮素、內標峰面積比值RSD 為7.08%，表明樣品在24 h 內穩定性良好?？瞻籽獫{配制低（50 ng/mL）、中（1 000 ng/mL）、高（2 000 ng/mL） 質量濃度血漿樣品，加入內標溶液，按“2.13.2” 項下方法處理，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得桔皮素平均加樣回收率分別為 92.77%、96.04%、95.18%，RSD 分別為4.17%、5.06%、4.89% （n＝3）。

2.13.5 結果分析 血藥濃度-時間曲線見圖13，再采用DAS 2.0 軟件計算主要藥動學參數，結果見表3。由此可知，與原料藥比較，物理混合物Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.05），可能與Labrasol、泊洛沙姆188 等輔料促吸收作用有關；固體脂質納米粒（不含Labrasol）、Labrasol+固體脂質納米粒、固體脂質納米粒（含Labrasol）tmax、t1/2延長（P＜0.05），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.05，P＜0.01），其中AUC0～t、AUC0～∞以固體脂質納米粒（含Labrasol） 更明顯（P＜0.05），相對生物利用度分別增加至3.13、3.41、4.10 倍，表明在固體脂質納米粒中引入Labrasol 是必要的。

圖13 桔皮素血藥濃度-時間曲線（n＝6）Fig.13 Plasma concentration-time curves for tangeretin （n＝6）

表3 桔皮素主要藥動學參數（±s，n＝6）Tab.3 Main pharmacokinetic parameters for tangeretin （±s，n＝6）

表3 桔皮素主要藥動學參數（±s，n＝6）Tab.3 Main pharmacokinetic parameters for tangeretin （±s，n＝6）

注： 與桔皮素比較，*P＜0.05，**P＜0.01； 與桔皮素固體脂質納米粒（不含Labrasol） 比較，＃P＜0.05； 與Labrasol+桔皮素固體脂質納米粒比較，△P＜0.05。

參數單位桔皮素物理混合物桔皮素固體脂質納米粒（不含Labrasol）Labrasol+桔皮素固體脂質納米粒固體脂質納米粒（含Labrasol）tmaxh2.07±0.352.21±0.452.97±0.68*3.12±0.71*3.09±0.62*t1/2h3.72±0.603.88±0.724.94±0.76*5.04±0.91*5.32±0.89*Cmaxng·mL-1569.74±87.12762.71±107.83* 1 307.45±284.77*1 449.80±302.56**1 653.30±323.18**AUC0～tng·mL-1·h 1 898.43±361.77 2 680.06±436.91* 5 943.61±860.13**6 467.14±965.81**7 788.14±1 024.97**?！鰽UC0～∞ng·mL-1·h 1 978.24±378.81 2 744.62±487.73* 6 134.29±903.74**6 628.31±999.03**7 926.58±1 106.48**?！?/p>

3 討論

本實驗對冷卻后含桔皮素的脂質熔融液進行X射線粉末衍射分析，發現藥物以無定形狀態存在，即并未析出。溶解度實驗結果顯示，物理混合物在一定程度上提高了桔皮素在模擬胃腸液中的溶解度，可能與Labrasol、泊洛沙姆188 等輔料增溶作用有關； 固體脂質納米粒凍干粉溶解度提高程度大于物理混合物，可能與原料藥粒徑大幅減小、轉變為無定形狀態等因素有關［11，18］。體內藥動學研究結果表明，桔皮素固體脂質納米粒tmax延長，可能是由于原料藥在酸性條件下容易發生降解［6］，固體脂質納米粒保護作用、Labrasol 抑制藥物降解作用使其入血量增加； 固體脂質納米粒相對生物利用度升高，可能是由于原料藥溶解度、溶出度改善，有利于其吸收［18-20］。

前期報道，Labrasol 輔料可抑制藥物降解作用、促吸收作用，有利于增加后者吸收［21］； 無定形藥物比結晶型藥物更易吸收［19］。本實驗發現，Labrasol+桔皮素固體脂質納米粒生物利用度提高程度低于桔皮素固體脂質納米粒（含Labrasol），可能是由于Labrasol 是一種表面活性劑，引入固體脂質納米粒后可使后者粒徑更小，更有利于其口服吸收，同時它可更有效地附著在固體脂質納米粒表面，從而抑制原料藥降解［22］，增加其口服吸收量。今后，將對桔皮素固體脂質納米粒（含Labrasol）藥效學、毒理學等方面進行評價，以期進一步開發利用該制劑。