miRNA與冠心病生物學效應的文獻計量學及可視化分析

羅艷娜,潘楊鈺,楊力強

冠心病(coronary heart disease,CHD)也被稱為冠狀動脈疾病(coronary artery disease,CAD),是由環境因素、遺傳因素以及表觀遺傳成分相互作用導致的一種多因素疾病。而作為遺傳因子的miRNA是一類參與基因表達的微小非編碼RNA,可以通過與相應的信使RNA(mRNA)結合并改變相應靶蛋白的表達來調控多種細胞和代謝途徑[1],特異性miRNA的異常表達在動脈粥樣硬化形成和冠心病進展中起到關鍵作用。本研究以Web of Science核心合集為數據庫,以 2006—2021年為時間跨度,對miRNA與冠心病關系研究的相關文獻進行可視化分析,進一步識別熱點和趨勢,為今后研究和臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 數據來源

檢索Web of Science核心合集(http://webofknowledge.com),檢索式:TS =(coronary artery disease OR coronary heart disease OR CHD)AND(miRNA OR microRNA OR microrna),文獻類型:論文,索引:SCI-EXPADED,時間跨度:2006年1月—2021年12月,檢索及數據下載日期為2022年1月10日。共檢索出相關文獻1 039篇,均以純文本格式導出檢索結果中的所需信息(包括主題、作者、來源和摘要)和引用。

1.2 分析方法

運用Excel 2019軟件統計分析年度所發表的論文量和被引頻數;運用CiteSpace 5.8.R3軟件、VOSviewer 1.6.17軟件分析,并構建國家、發文期刊、關鍵詞的可視化圖譜。

2 結 果

2.1 年度發文量和被引頻數分析

共收集到1 039篇文獻,按照發表時間和被引頻數進行統計分析(見圖1)。從發文量看,2006年關于miRNA與冠心病的研究開始起步,2009年緩慢增加,表明該研究的關注度越來越高,2009—2015年發文量呈明顯上升趨勢,2016—2019年發文量呈波浪式上升趨勢,其中2019年發文量達到峰值(161篇),2020年和2021年的發文量略有下降,但整體熱度仍存在。從被引頻數看,從2009年開始基本處于持續上升趨勢,其中2021年的被引頻數達到峰值(5 398次)。說明近年來miRNA與冠心病的研究受到廣泛的關注,研究在逐步深入,文獻質量較高,注重研究的創新性。在2006—2021年所發表的文獻中,被引頻數排名居前10位的文獻詳見表1,其中被引頻數最高的3篇文獻分別是“Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease”(被引904次)、“Circulating microRNA:a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans”(被引873次)、“The muscle-specific microRNA miR-1 regulates cardiac arrhythmogenic potential by targeting GJA1 and KCNJ2”(被引873次),均發表在2010年以前,這些研究均證實了在冠心病模型中成功提取并檢測出部分miRNA,并且指出所檢測的miRNA的表達及其生物學作用可能會對冠心病進展造成一定影響,這也為今后miRNA相關研究奠定了基礎。

圖1 年度發文量和被引頻數分布

2.2 發表期刊分析

共有367種期刊發表了關于miRNA與冠心病相關研究的文獻,文獻發表量排名居前10位的期刊分布見表2。發表論文最多的期刊是PLoSOne,共發表文獻51篇,第2名是ScientificReports,發表文獻27篇,第3名是MolecularMedicineReports,發表文獻24篇。運用CiteSpace 5.8.R3軟件構建的期刊可視化突現圖見圖2,圖中Cited Journals代表節點類型,Year代表節點出現年份,Strength代表突顯強度,Begin代表突顯開始年份,End代表節點結束年份,紅條代表突顯時間跨度。2015年以前,發表相關文獻的主要期刊有4種,分別是PhysiolGenomics、MolCellBiol、MolCell、DevCell、GeneDev;2012—2017年發表文獻的期刊種類增多,主要集中在ThrombHaemostasis、Blood、Hypertension、BMCGenomics等。2018—2021年,miRNA得到更為深入的研究,發表文獻的期刊主要集中在BiomedResInt、EurRevMedPharmaco、MolMedRep、AmJTranslRes等,顯示出miRNA相關研究涉及多個學科、多個研究領域。

表2 文獻發文量排名居前10位的期刊分布

圖2 期刊可視化突現圖

2.3 國家與機構共現分析

共有57個國家參與了相關研究,在Web of Science核心合集數據庫中論文總量排名居前10位的國家和機構詳見表3、表4。目前,我國是發表文獻最多的國家,共發表了593篇文獻,第2名是美國,共發表160篇文獻,第3名是德國,共發表78篇文獻。運用CiteSpace 5.8.R3軟件構建國家可視化共現圖(見圖3),圖中圓圈面積標志著國家的文獻量,圓圈內部顏色標志著論文平均發表年份。國家之間的連線距離代表著國家之間合作的密切度,其中連線距離越短,合作越密切。在miRNA與冠心病的研究領域中,我國所發表的文獻數量明顯多于其他國家,與美國的合作最為密切。共有1 435家機構發表該研究領域的文獻,排名居前10位的機構共發表了280篇論文,依次分別是南京醫科大學(37篇)、中山大學(33篇)、哈爾濱醫科大學(31篇)、上海交通大學(30篇)、首都醫科大學(29篇)、中南大學(27篇)、哈佛大學(27篇)、中國醫學科學院北京協和醫學院(22篇)、復旦大學(22篇)、美國加州大學(22篇);其中,有8所機構是來自我國重點高校。運用VOSviewer 1.6.17構建機構可視化密度圖(見圖4),圖中黃色的深度和面積表示該機構所發表的論文被引次數,黃色越深,面積越大,則被引頻數越大;其中,南京醫科大學、哈爾濱醫科大學、上海交通大學、首都醫科大學黃色面積大于其他機構,表明這4所機構在該研究領域中具有較高的影響力。

表3 發表論文總量排名居前10位的國家分布

表4 發表論文總量排名居前10位的機構分布

圖3 發表論文總量的國家可視化共現圖

圖4 發表論文總量的機構可視化密度圖

2.4 作者分析

從作者合作可視化圖譜可以了解到有影響力研究團隊的相應信息。在該領域中,共有7 051位作者發表了相關論文,其中論文發表量排名居前5位的作者依次是Zhang Y(29篇)、Wang Y(24篇)、Zhang J(24篇)、Li L(20篇),均來自我國。運用VOSviewer 1.6.17構建作者合作可視化共現圖譜(見圖5),以北京大學人民醫院的Li S F、Chen H、Song J X為中心研究團體,團體內合作密切、構架穩定;此外,以Zhang J為樞紐,溝通多個研究團隊,在該研究領域中發揮著重要作用。

圖5 作者合作可視化共現圖

2.5 關鍵詞分析

關鍵詞能夠反映出該研究領域的熱點,而關鍵詞的突顯可以提示研究前沿。排名居前20位的高頻關鍵詞詳見表5,排名居前5位的關鍵詞依次是expression(表達,339次)、coronary artery disease(冠狀動脈疾病,221次)、microRNA(微小核糖核酸167次)、biomarker(生物標志物,147次)、circulating microRNA(142次),這些關鍵詞的中心性均為0。借助CiteSpace 5.8.R3軟件構建關鍵詞相關可視化圖譜;根據關鍵詞時間線圖(見圖6),可以得到5個主要的聚類:endothelial cells(內皮細胞)、circulating microRNA(循環微小核糖核酸)、coronary atherosclerosis(冠狀動脈疾病)、target gene(靶基因)、extracellular vesicles(細胞外囊泡),其中,在circulating microRNA聚類中,關鍵詞的時間跨度在2009—2018年,部分關鍵詞圓圈面積較大、圈內顏色較豐富,如:acute myocardial infarction、biomarker、mechanism、cell、risk、network等,表明此聚類中關鍵詞總頻數最多,相關論文數量較多,研究熱度高,但在2019年以后此聚類再無出現新的關鍵詞。coronary atherosclerosis聚類、extracellular vesicles聚類從出現至今不停出現新關鍵詞,但是關鍵詞圓圈面積小,圈內顏色以紅色為主,表明這兩個聚類中的關鍵詞頻數少,未有明顯的研究熱度。通過關鍵詞突現圖(見圖7),可以更加直觀地看到2018—2021年該領域的研究主流體現在apoptosis(凋亡)、protect(保護)、growth(增殖)、migration(遷移)、long noncoding RNA(lncRNA)、inhibition(抑制)、oxidative stress(氧化應激)、congenital heart disease(先天性心臟病)、circular RNA(circRNA)。

表5 排名居前20位的高頻關鍵詞分布

3 討 論

結合文獻及可視化圖譜進行綜合分析,該領域的主要研究內容集中于miRNA效應及生物標志、基因表達與疾病風險,目前及今后的研究熱點體現在凋亡、保護、增殖、遷移、lncRNA、抑制、氧化應激、先天性心臟病、circRNA方面,其中lncRNA-circRNA-miRNA的多重基因網絡是一個涉及范圍廣泛的新興熱點。單個miRNA可以通過調控多個mRNA來干預細胞周期、衰老及凋亡,影響細胞穩態、血管生成和機體免疫功能,從而參與疾病的發生發展;同時,miRNA的表達也受到多重基因網絡的調控。以miRNA生物學作用對冠心病的影響相關闡述如下。

3.1 miRNA調控內皮細胞以及影響血管生成

適當的有氧鍛煉可以減低冠心病的發病率和致死率,其機制可能是與內皮功能、脂質、炎癥、血栓形成有關。調節miR-20a可以影響峰值運動能力和心肺功能[2],Wang 等[3]運用ApoE/LDLR雙基因敲除小鼠建立運動相關冠心病模型,實驗證實miRNA-20a的過表達能降低血漿內皮素-1(ET-1)、血栓素A2(TXA2)、同源性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)的表達水平,增加內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、前列腺素2(PGI2)和血管內皮生長因子(VEGF)的轉錄和翻譯水平,miRNA-20a特異性結合PTEN的3′UTR,通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路介導內皮細胞的存活和增殖。在Tang 等[4]研究中發現冠心病病人的外周血內皮祖細胞中的miRNA-206是通過標靶PI3K調節內皮細胞活性,miRNA-206表達顯著升高,而PI3K表達降低;在小鼠缺血性后肢模型中,在敲除冠心病內皮細胞中的miRNA-206能激活PI3K、AKT和eNOS,促進血管生成,對動脈粥樣硬化有拮抗作用。miRNA-217通過調控標靶沉默信息調節因子1(SirT1)的表達來降低轉錄因子Fox01和eNOS在血管生成和細胞老化,加快冠心病進展[5-9]。值得一提的是,在血糖正常情況下,內皮微粒通過miRNA-126遞送至受體細胞可以促進血管內皮的修復,對保持內皮完整性和預防冠心病的發展具有重要意義[10]。

3.2 miRNA調節氧化應激

在缺氧缺血狀態下,miRNA參與心肌細胞的氧化應激反應,并在調節氧化應激方面具有重要作用。心肌細胞中的miRNA-210是體內最重要的與缺氧相關的miRNA,具有調節線粒體代謝、抑制活性氧(ROS)生成和抑制促凋亡基因的作用,進一步研究證實,miRNA-210過度表達可以減少因缺氧而產生的ROS,抑制氧化應激狀態的細胞凋亡和損傷[11-13]。有研究證實,在缺氧誘導下,miRNA-136的擴增能防止血管內皮細胞凋亡[14];Lin等[15]實驗表明miRNA-136-3p的過表達可以上調超氧化物歧化酶(SOD)水平、下調丙二醛(MDA)水平,降低血漿肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白I(cTnI)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)以及腫瘤壞死因子-α(TNF-α),從而起到降低冠心病大鼠氧化應激和炎癥反應,改善病理性損傷,增強心臟功能的作用。

3.3 miRNA抑制血管慢性炎癥

血管慢性炎癥是導致動脈粥樣硬化的重要原因。Zhu 等[16]實驗證實,在冠心病病人體內miRNA-155明顯高表達,miRNA-155的負反饋調節可減少炎性因子產生,并參與炎癥反應和絲裂原活化蛋白激酶通路的轉錄后調節,減緩動脈粥樣硬化的進程。而動脈粥樣硬化的早期標志是泡沫細胞,它是巨噬細胞攝取氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)后所形成的。Tian 等[17]利用生物信息學確定了3個多功能轉錄因子的結合位點,并驗證了這些轉錄因子的復合物可以抑制miRNA-155表達,降低巨噬細胞中的脂質,減慢巨噬細胞衍生成泡沫細胞的速度,減少動脈斑塊形成。miRNA-202-3p被證實對原發性高血壓病有重要作用[18],在一項病例對照試驗中,發現冠心病病人的miRNA-202-3p表達顯著升高,與血小板分布寬度和平均血小板體積呈負相關,進一步功能分析表明,ox-LDL可誘導miRNA-202-3p表達,并且miRNA-202-3p可以反饋抑制ox-LDL誘導泡沫細胞形成,起到拮抗冠心病的作用[19]。內皮細胞中的miRNA-126高表達具有調節炎癥反應的功能[20-22],Wu等[23]研究證實在冠心病病人外周血單核細胞中miRNA-126表達相對降低,與炎性因子和細胞間黏附分子1呈負相關,與白細胞介素10呈正相關;有研究者提出miRNA-126是通過下調促炎因子、上調抗炎因子以達到控制炎癥反應的目的[24-26]。

3.4 miRNA作為預測冠心病嚴重程度的標志物

目前,Gensini評分是用來評估冠狀動脈造影測定血管病變嚴重程度的一種方法,以此為基準,有部分特異性RNA被認為可以成為預測冠心病冠狀動脈狹窄嚴重程度的潛在標志。miRNA-126能調控炎癥反應,且與Gensini評分呈負相關,故有研究者提出miRNA-126可用來預測冠心病風險和評估病情嚴重程度[23]。miRNA-223能調節多個脂代謝相關基因和控制高密度脂蛋白的攝取,在冠心病病人中miRNA-223表達較高,且與Gensini評分呈正相關,在預測冠心病嚴重程度方面存在一定的臨床價值[27]。miRNA-208a是心臟特異性miRNA之一,可以通過調節肌球蛋白來影響心臟的發育[28]。研究證實miRNA-208a在冠心病AMI病人的心臟中表達水平較高,具有高靈敏度和強特異性,并且與Gensini評分呈正相關關系,故miRNA-208a被提議作為AMI的診斷標志物和冠狀動脈狹窄程度的預測因子[29-30]。有研究者利用經皮冠狀動脈支架介入術(PCI)誘導斑塊破裂的實驗結果確定了miRNA-155-5p、miRNA-483-5p、miRNA-451a在冠心病受試者中表達較高,并與斑塊破裂存在著顯著的關聯性,故提出這3個miRNA有望成為早期識別斑塊破裂的生物標志[31]。miRNA-221/222可以抑制血管內皮細胞的增殖、遷移和分化,并誘導內皮功能障礙,還可以促進血管內皮細胞增殖、遷移和去分化,影響冠狀動脈硬化的進展。另外,miRNA-221/222在急性冠狀動脈綜合征病人體內表達升高,且與Gensini評分呈正相關,提出miRNA-221/222在臨床上對急性冠狀動脈綜合征且冠狀動脈狹窄≥50%的病人具有診斷意義[32]。

3.5 多重基因網絡參與冠心病的發生發展

不同類型的RNA具有不同的表達水平及生物學作用,通過相互作用來參與多種生理功能,運用生物信息學技術可以預測其基因靶點、信號通路,進一步證實RNA的表達及功能與冠心病的發生發展有重要性。lncRNA是大于200個非編碼核苷酸的單鏈分子,是作為分子信號、誘導或者增強劑來調節基因的表達和功能[33]。lncRNA影響血管內皮細胞的增殖和遷移,調節血管內皮細胞的細胞周期和凋亡,以干預血管重塑,在冠心病和血管內皮細胞病變過程占有重要地位[29,34-35]。運用生物信息學分析和加權基因共表達網絡分析冠心病病人的RNA,構建了9個lncRNA-miRNA-mRNA網絡,檢測了53個共表達的基因模塊,冠狀動脈血管內皮細胞增殖和遷移模型中,由5個lncRNA被下調,1個lncRNA被上調,6個共同表達的mRNA被上調,因此提出lncRNA可能成為調節血管內皮細胞增殖和遷移的靶點[36]。Liao 等[37]運用RNA的轉錄組測序以及基因相互作用構建lncRNA-miRNA-mRNA網絡,在網絡中有6個miRNA與左室射血分數(LVEF)、總膽固醇、高半胱氨酸關系密切,指出其中2個lncRNA、miRNA-449和mRNA(NR4A1)是關鍵基因并得到基因相互作用的證實,故提出lncRNA、miRNA-449、NR4A1可在臨床上作為冠心病標志物。Zhu 等[38]發現在冠心病病人lncRNA MALAT1可直接靶向調控miRNA-15b-5p以促進細胞凋亡并抑制細胞自噬,影響冠心病進展。心肌缺血/再灌注(I/R)損傷實驗證實lncRNA TTTY15可以通過靶向miRNA-374a-5p抑制細胞自噬和心肌I/R損傷[39]。

circRNA是一種存在于哺乳動物細胞中的非編碼RNA,在外泌體含量豐富且穩定,通過miRNA海綿、剪接或轉錄因子來影響機體衰老、胰島素分泌和組織發育。根據FEILIN團隊的隊列研究和基因本體(GO)富集分析,發現有110個circRNA、18個miRNA參與了冠心病的上調和下調,指出冠心病的潛在機制可能與circRNA-miRNA的共同表達、多途徑、多細胞的分子生物學過程有關[40]。Ji 等[41]預測出miRNA的靶向相互作用并構建差異表達基因circRNA-miRNA-mRNA的三重網絡,共鑒定出26 065個冠心病相關的基因,大部分基因都參與細胞周期、有絲分裂和細胞代謝過程,其中的10個基因與脂類代謝和蛋白質修飾相關,還指出circRNA可能通過miRNA海綿調節來影響冠狀動脈疾病相關基因的表達。Pan等[42]運用數據庫構建了一個由has-miR-130a-3p介導的circRNA-miRNA-ceRNA網絡,證實了有9種circRNA通過抑制冠心病病人的has-miR-130a-3p來促進瞬時受體電位陽離子通道家族M成員3(TRPM3)的表達,提出has-miR-130a-3p具有預防和治療冠心病的潛在能力。如上所述,miRNA的表達受到多重基因網絡的影響,為冠心病的診療方案提供了新思路。

3.6 藥物干預miRNA表達對冠心病的影響

miRNA-1是一種促進凋亡的心臟特異性miRNA,過度表達會降低細胞活力并誘導凋亡[43]。在冠心病AMI發生后miRNA-1含量迅速升高,其升高趨勢與肌酸激酶同工酶相似,其表達水平與心肌梗死面積呈正相關,有望成為診斷AMI的敏感指標[44]。而卡維地洛是一種非選擇性β-腎上腺素能受體拮抗劑,能通過抑制心肌細胞中miRNA-1的表達,增加直接靶點熱休克蛋白60的部分表達,減少心肌細胞凋亡,以達到保護心肌的作用。有報道稱他汀類藥物能調節冠心病相關細胞中miRNA表達發揮其生物學作用[45],Li 等[46]運用生物信息學分析得出他汀類藥物可能通過抑制血管生成、動脈粥樣硬化相關細胞增殖、單核細胞遷移、血小板黏附以及miRNA介導的凝血級聯反應,以增加動脈斑塊的穩定。也有研究表明他汀類聯合血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ARB)治療可以降低冠心病病人的miRNA-146a/b表達和Toll樣受體4(TLRA),有助于拮抗動脈粥樣硬化[47]。丹紅注射液是丹參和紅花的標準提取物,在臨床上長期被用于缺血性心臟病和缺血性腦病。一項miRNA PCR列陣結果顯示,丹紅注射液通過防止炎癥轉錄因子的核轉位,并逆轉與炎癥和細胞凋亡相關的miRNA,減輕心肌梗死相關炎癥,有效減少心肌梗死面積,改善心功能[48]。

4 小 結

本研究將miRNA在冠心病領域中的相關研究以可視化知識圖譜的形式進行相對直觀的展示,結果顯示miRNA是冠心病病理生理的關鍵介質,miRNA有望成為冠心病新型標志和潛在治療靶點。但是,miRNA作為遺傳因子,容易受到其他因素的影響,如環境因素,研究涉及多學科、跨領域,因此,miRNA的具體作用機制有待進一步探討。目前出現的miRNA拮抗劑或者模擬物處于動物或者細胞實驗的研究階段,尚未有在臨床上應用miRNA拮抗劑或者模擬物的相關研究,結合目前研究趨勢,今后的相關研究可考慮以“實驗室+臨床”的研究模式開展。此外,本研究僅對2006—2021年在Web of Science核心合集中的相關文獻進行分析,并未分析國內相關數據庫的文獻,內容存在著一定的局限性,可能會遺漏國內的重要研究,后續可結合國內外數據庫進一步擴大檢索范圍,為更深入地探討該研究領域的熱點、前沿,為科研提供新思路,也為今后的冠心病診療提供有價值的實施方案。