醬香型白酒窖池發酵初始微生物多樣性對發酵代謝多樣性的調控

張晶,程偉,王西,牛姣*,吳群*,徐巖

1(江南大學 生物工程學院,釀造微生物與應用酶學研究室,工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)2(四川郎酒股份有限公司,四川 瀘州,646523)

醬香型白酒是我國獨特的傳統發酵飲料酒[1],其發酵微生物群落對風味特征與產品品質具有重要的作用[2-3]。研究醬香型白酒發酵過程微生物群落特征是解析醬香型白酒發酵機制的重要內容。前期對于其他香型白酒發酵過程的研究發現,在發酵過程中基于微生物群落系統發育多樣性的微生物演替距離會影響代謝多樣性[4],基于α多樣性Shannon指數的微生物演替速率會顯著影響風味物質的代謝[5],進而影響白酒風味的復雜性。因此,探究微生物群落多樣性與風味物質代謝多樣性的關系對釀造品質的提升具有重要作用。

白酒發酵過程理化因子可以驅動微生物群落演替。溫度[6]、酸度[7]以及營養底物[8]是白酒發酵過程中影響微生物群落演替的主要驅動力。溫度可以影響微生物演替速率[9],還原糖的種類差異會驅動白酒發酵過程微生物群落優勢微生物組成[10],淀粉、酸度以及水分共同影響醬香型白酒堆積過程微生物群落組成以及微生物群落多樣性[11]。但是,目前仍然不清楚影響醬香型白酒窖池發酵過程微生物群落多樣性的主要因素,因此,有必要探究醬香型白酒發酵過程理化因子對微生物多樣性的影響。另一方面,發酵過程中理化因子變化也受微生物群落的影響。研究發現,在白酒生產發酵起點添加強化菌劑,能通過增加微生物多樣性,顯著提升發酵過程的酸度[12];LIANG等[13]模擬葡萄酒發酵,發現初始微生物多樣性能夠顯著影響發酵過程的乳酸含量。以上研究表明,初始微生物多樣性也能夠影響發酵過程理化因子的變化。然而,初始微生物多樣性、發酵過程理化因子以及風味物質代謝多樣性之間的相互作用規律并不清晰。

本研究以醬香型白酒2個不同車間同一生產輪次的發酵過程為研究對象,擬探究窖池發酵初始微生物多樣性對發酵過程代謝多樣性的作用規律?；诟咄繑U增子測序技術和代謝物組學技術解析窖池發酵過程微生物群落和代謝多樣性變化,并通過冗余分析判定窖池發酵過程微生物演替關鍵驅動力,使用結構方程模型解析窖池發酵初始微生物多樣性、發酵過程理化因子和代謝多樣性之間的相互作用規律。本研究將為醬香型白酒及其他發酵食品風味的定向調控提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品的采集

本研究針對醬香型白酒生產的3輪次酒發酵酒醅進行研究,取樣時間為2022年3月,取樣地點為四川省某醬香型白酒廠的2個不同產區的生產車間(L1和L4)。窖池發酵樣本取發酵0、5、10、20、30、40 d的樣本。每個時間點樣本有3個生物平行,保存于-80 ℃冰箱用于后續檢測分析。

1.1.2 主要試劑和儀器

L-薄荷醇,北京百靈威科技有限公司;其他試劑均為分析純,國藥(集團)上?；瘜W試劑有限公司。789013-D5977B氣相色譜-質譜聯儀、Agilent 1260液相色譜儀,安捷倫公司;NANODROP 8000核酸濃度檢測儀,賽默飛世爾科技有限公司;Mini-Bead-Beater-8細胞破碎儀,上海玉博生物科技有限公司;真空冷凍干燥儀,艾本德國際貿易有限公司;DS1921G紐扣式溫度記錄儀,上海沃第森電子科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酒醅樣品中風味物質的檢測

于50 mL離心管中稱取5.0 g酒醅,并加入25 mL超純水充分振蕩混勻,4 ℃過夜浸提。浸提后的樣本于4 ℃超聲波處理30 min,在4 ℃、8 000×g條件下離心5 min。取8 mL上清液和20 μL薄荷醇內標(100 μg/mL)加入至含有3.0 g NaCl的20 mL頂空瓶中。酒醅中的風味化合物的含量測定采用頂空固相微萃取技術(headspace solid phase microextraction,HS-SPME)并結合GC-MS,色譜柱為DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm;Agilent),檢測條件參考文獻[14]。

1.2.2 酒醅樣品基因組DNA提取

稱取7.0 g酒醅樣品于50 mL無菌離心管中,后加入15 mL已滅菌且冷卻后的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphote buffer saline,PBS),并加入3顆已滅菌且冷卻后的玻璃珠,300×g渦旋振蕩5 min, 4 ℃離心5 min,收集上清液。重復使用PBS提取3次,收集全部的上清液。全部上清液于9 000×g,4 ℃離心3 min,棄上清液,收集細胞沉淀,并用5 mL PBS洗滌細胞沉淀3次,最后使用1 mL PBS重懸,參照文獻[15]中的酚-氯仿法進行宏基因組的提取,真空冷凍干燥箱中干燥處理1 h后加入40 μL無菌ddH2O溶解DNA,用核酸濃度測定儀測定基因組的DNA濃度和A260/A280值(1.8～2.0),作為高通量測序及qPCR定量的模板。

1.2.3 高通量擴增子測序及原始序列處理

高通量擴增子測序:對于細菌,對其16S rRNA基因的V3～V4區域進行擴增,引物為338F和806R[16]。對于真菌,對其ITS2區域進行擴增,引物為ITS2和ITS3[17]。PCR產物的純化參考文獻[10]。純化后的產物使用核酸濃度測定儀進行定量,后與同一樣本中的PCR產物等分子質量混合,并根據Low Sample Protocol進行文庫制備,最終在Illumina MiSeq測序平臺上測序。

序列處理:通過QIIME[18]對MiSeq生成的原始序列進行處理。去除質量得分<20或長度<200 bp的序列,去除與PCR引物不完全匹配或具有未分配標簽的序列[18]。使用UCHIME[19]去除嵌合體。通過DADA2將修整后的序列以100%的相似性聚類為擴增子序列變體(amplicon sequence variants,ASV)[20]。

1.2.4 酒醅理化因子檢測

使用紐扣溫度計對取樣深度的樣品進行實時溫度測定。稱取10.0 g樣品,置于105 ℃烘箱中2 h至恒重,根據烘干前后物料的質量差計算樣品的水分含量。采用滴定法檢測樣品中酸度和游離氨態氮含量[21]。取1.2.1節中上清液1 mL過0.22 μm有機濾膜進行過濾。通過高效液相色譜法和示差檢測器(Schambeck SFD GmbH)測定濾液中的葡萄糖、乳酸、乙酸和乙醇含量,色譜柱為AminexHPX-87H(300 mm×7.8 mm,Bio-Rad)[22]。

1.2.5 風味物質代謝多樣性計算

參考文獻[23-24]的方法。代謝多樣性是表征風味物質代謝的重要指標,各車間發酵過程不同風味物質含量歸一化后的平均值即為代謝多樣性。

1.2.6 統計學分析方法

主成分分析:為揭示不同車間窖池發酵過程中代謝物質變化存在差異,通過Origin 2013對發酵過程代謝物質進行主成分分析。

冗余分析:為探究窖池發酵過程理化因子對微生物結構的影響,使用R語言(version 3.2.4)中的Vegan包進行冗余分析,并同時進行蒙特卡洛檢驗。

結構方程模型:為探究窖池發酵初始微生物多樣性對代謝多樣性的影響,使用AMOS(version 20.2)進行分析,標準化的路徑系數用于分析結構路徑的影響關系。

2 結果與分析

2.1 不同產區生產車間窖池發酵過程代謝多樣性的變化規律

醬香型白酒發酵過程風味物質的代謝對白酒風味特征以及產品品質具有重要的作用[25],本研究采用HS-SPME-GC-MS對不同車間發酵終點代謝產物進行分析,共檢測到41種揮發性化合物,如圖1-a所示,包括4種醛類、2種酮類、13種酯類、9種醇類、11種酸類和2種其他物質。通過主成分分析比較2個車間代謝物質的變化規律,結果如圖1-b所示,發現2個車間代謝物組成從窖池發酵初始已具有差異;同時,2個車間窖池發酵樣本中風味物質的組成以及變化規律均存在差異。通過歸一化的方法計算車間窖池發酵過程的代謝產物多樣性,如圖1-c所示,窖池發酵起點車間L4的代謝多樣性顯著高于車間L1(P<0.01),且在整個發酵過程中,車間L4的代謝多樣性均顯著高于車間L1(P<0.05)。

a-不同車間窖池發酵過程代謝產物組成;b-不同車間窖池發酵過程代謝物變化規律;c-不同車間窖池發酵過程代謝多樣性變化圖1 不同車間窖池發酵過程代謝多樣性變化Fig.1 The changes of metabolic diversity in liquor fermentation from different workshops注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.2 不同產區生產車間窖池發酵過程微生物群落結構

微生物群落結構會影響風味物質的代謝[9, 26]。為了探究窖池發酵過程代謝多樣性差異的原因,對車間L1和L4的窖池發酵過程發酵微生物群落結構進行分析。通過Illumina MiSeq測序揭示窖池發酵過程中微生物群落的組成。在質量控制去掉低質量序列后,對于細菌,每個樣品平均有51 935條高質量序列;對于真菌,每個樣品平均有82 672條高質量序列。每個樣品的覆蓋率均在99%以上,表明測序深度足夠和數據質量足夠可靠。

將平均相對豐度>1%的屬定義為優勢微生物屬,平均相對豐度>10%的屬定義為絕對優勢微生物屬[27]。窖池發酵過程微生物群落結構的變化規律如圖2所示。對于細菌群落,共獲得2個優勢微生物屬,分別為Bacillus(平均相對豐度3.95%)和Kroppenstedtia(平均相對豐度3.49%),1個絕對優勢微生物屬,為Acetilactobacillus(平均相對豐度87.64%),其中,Bacillus豐度和Kroppenstedtia豐度在2個車間存在顯著差異(P<0.05),在整個窖池發酵過程中,車間L4的細菌群落多樣性均高于車間L1。對于真菌群落,共獲得1個優勢微生物屬,為Byssochlamys(平均相對豐度4.35%),2個絕對優勢微生物屬,分別為Pichia(平均相對豐度61.31%)和Saccharomyces(平均相對豐度30.31%),其中,Pichia豐度和Saccharomyces豐度在2個車間存在顯著差異(P<0.05),在整個窖池發酵過程中,車間L4的真菌群落多樣性均高于車間L1。

2.3 窖池發酵過程理化因子和微生物的關聯分析

微生物群落演替易受到理化因子的影響[28],溫度、水分、酸度、游離氨態氮、葡萄糖、乳酸、乙酸、乙醇是醬香型白酒發酵過程中的重要理化因子,分析結果如圖3所示。窖池發酵溫度呈現先上升后下降的趨勢,2個車間的窖池發酵溫度均在第5天達到最高值,且車間L1溫度高于車間L4溫度。整個窖池發酵過程車間L1水分含量高于車間L4水分含量,車間L1水分含量在44.94%～47.25%,車間L4水分含量在43.18%～45.12%。對于酸度、乳酸和乙酸,整個窖池發酵過程車間L1均高于車間L4,說明車間L1發酵酒醅中微生物群落的產酸能力要高于車間L4。

a-溫度;b-水分;c-酸度;d-游離氨態氮;e-葡萄糖;f-乳酸;g-乙酸;h-乙醇圖3 不同車間窖池發酵過程理化因子動態變化Fig.3 The dynamic changes of physical and chemical factors in liquor fermentation from two workshops

為了探究不同產區生產車間窖池發酵過程理化因子對微生物群落的影響,進行蒙特卡洛置換檢驗,結果如圖4和表1所示。在車間L1窖池發酵過程中,理化因子共解釋了微生物群落演替的53.74%,其中水分(r2=0.40,P=0.029)、酸度(r2=0.43,P=0.011)、葡萄糖(r2=0.44,P=0.026)、乙酸(r2=0.53,P=0.003)和乙醇(r2=0.37,P=0.047)與微生物群落演替顯著相關。在車間L4窖池發酵過程中,理化因子共解釋了微生物群落演替的77.06%,其中溫度(r2=0.51,P=0.003)、水分(r2=0.42,P=0.019)、酸度(r2=0.63,P=0.002)、葡萄糖(r2=0.66,P=0.001)、乳酸(r2=0.55,P=0.002)和乙醇(r2=0.48,P=0.007)與微生物群落演替顯著相關。因此,在窖池發酵過程中,酸度、葡萄糖、乙醇被確定為微生物演替的重要驅動力。其中,酸度[29]和糖類[8]可以影響微生物的多樣性,乙醇可以影響發酵過程優勢微生物Pichia和Lactobacillus豐度[9]。

表1 不同車間窖池發酵過程理化因子與微生物之間的蒙特卡洛置換檢驗結果Table 1 Mantel test of physical and chemical factors and microbiota in liquor fermentation from two workshops

a-車間L1;b-車間L4圖4 不同車間窖池發酵過程理化因子與微生物冗余分析Fig.4 Redundancy analysis of microbiota and physical and chemical factors in liquor fermentation from two workshops

2.4 窖池發酵初始微生物多樣性對發酵過程代謝多樣性的調控

為探究不同產區生產車間窖池發酵初始微生物多樣性對發酵過程代謝多樣性的共同影響,采用結構方程模型進行分析,該模型基于不同變量的連續回歸,可以評估不同變量之間的復雜網絡[30-31],結果如圖5所示。窖池發酵初始微生物多樣性顯著影響窖池發酵過程理化因子(路徑系數=-0.96,P<0.05),窖池發酵過程理化因子顯著影響窖池發酵過程微生物多樣性(路徑系數=-0.99,P<0.001),窖池發酵過程微生物多樣性顯著影響窖池發酵過程代謝多樣性(路徑系數=1,P<0.001)。WANG等[6]和ZHANG等[9]研究了理化因子對微生物多樣性的影響,HU等[32]和LIU等[33]研究了微生物多樣性對風味代謝的影響,本研究初次探究了初始微生物多樣性對理化因子的影響。

發酵過程酸度受到初始細菌多樣性的影響(路徑系數=-0.68,P<0.05),葡萄糖受到初始細菌多樣性(路徑系數=-0.61,P<0.05)和初始真菌多樣性(路徑系數=-0.77,P<0.05)的影響,乙醇受到初始真菌多樣性的影響(路徑系數=-0.65,P<0.05)。酸度在12.35～25.58 mmol/100 g顯著影響發酵過程細菌多樣性和真菌多樣性,路徑系數分別為-0.78和-0.54;葡萄糖在0.84～8.80 g/kg范圍內顯著影響發酵過程細菌多樣性,路徑系數為-0.72,乙醇在3.34～15.14 g/kg顯著影響發酵過程真菌多樣性,路徑系數為-0.69;發酵過程細菌多樣性和真菌多樣性均顯著影響代謝多樣性,路徑系數分別為0.62和0.53。之前研究中JI等[4]揭示了基于微生物多樣性的演替距離會顯著影響代謝多樣性,TAN等[5]揭示了微生物多樣性是影響微生物代謝的重要因素,WANG等[8]揭示了微生物多樣性和代謝多樣性呈線性正相關。說明窖池發酵過程初始細菌、真菌多樣性可以通過影響窖池發酵過程理化因子,進而影響窖池發酵過程細菌、真菌多樣性,最終調控發酵過程的代謝多樣性。

3 結論

本研究對不同產區生產車間窖池發酵過程進行分析,揭示了初始微生物多樣性對代謝多樣性的調控作用。結果顯示2個車間窖池發酵過程代謝多樣性存在顯著差異。并通過組學技術分析了窖池發酵過程微生物多樣性的差異,通過冗余分析確定了發酵過程微生物群落的關鍵驅動力為酸度、葡萄糖和乙醇。最后,本研究使用結構方程模型揭示了初始真菌多樣性對酸度和葡萄糖的顯著影響,初始細菌真菌多樣性對葡萄糖和乙醇的顯著影響;酸度顯著影響發酵過程細菌、真菌多樣性,葡萄糖顯著影響細菌多樣性,乙醇顯著影響真菌多樣性;細菌多樣性和真菌多樣性顯著影響代謝多樣性。綜上所述,窖池發酵初始微生物多樣性可以調控代謝多樣性,這為白酒及其他發酵食品的穩定生產提供了理論指導。