秦巴山區羊肚菌穩產菌株的選育

霍文嚴 喬 婷 賀雪蓮 戴 璐 劉 愚 祁 鵬 張黎光 路鵬鵬 江 鑫 李峻志

（陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043）

羊肚菌，隸屬于子囊菌門，盤菌亞門，又名草笠竹，羊肚菜，因其菌蓋表面凹凸不平，形似羊肚而得名[1-2]。羊肚菌的味道鮮美，香味獨特，營養豐富，保健功效齊全，是一種享譽世界的高檔食材，素有“食用菌皇后”之美名。我國自2012年實現羊肚菌商業化栽培以來，其人工栽培面積不斷擴大，據不完全統計，2021—2022 年生產周期，全國羊肚菌栽培面積近20 000 hm2。

羊肚菌同有些食用菌品種一樣，種性經常會出現“退化”現象，表現為菌絲生長變慢，分支減少，活力衰退，產量降低甚至絕產等，最終造成不可估量的經濟損失[3-8]。

近年來，陜西省秦巴山區的食用菌產業規模不斷擴大，特別是羊肚菌栽培規模已近4 000 hm2；但在發展羊肚菌生產的過程中，當地也遇到諸如菌種質量不穩定、種性易退化等問題。因此，選育獲得適應當地氣候環境特點且不易退化的穩產羊肚菌菌株成為促進當地食用菌產業健康有序發展的關鍵。在廣泛收集羊肚菌菌株的基礎上，通過連續傳代培養過程中的菌株穩定性與生產穩定性的相關性研究，選育獲得能夠適應秦巴山區當地氣候環境的穩產羊肚菌菌株，為實現秦巴山區羊肚菌高效穩定的商業化栽培奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

（1）供試菌株

供試菌株均由陜西省微生物研究所真菌研究中心從各地區采集并經分離、純化獲得，具體編號、采集地及子實體形態見表1。

表1 供試羊肚菌菌株基本情況

（2）培養基及外源營養袋配方

PDA 培養基：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH 自然。栽培種培養基：小麥粒50%，雜木屑30%，麩皮9%，生石灰1%，自然土10%。料含水量≥60%，裝入聚乙烯袋（15 cm×22 cm）中，121 ℃高壓滅菌3 h。外源營養袋：小麥粒52%，玉米芯40%，生石灰1%，石膏1%，磷酸二氫鉀0.15%，自然土6%。料含水量≥55%，裝入聚乙烯袋（15 cm×22 cm），121 ℃高壓滅菌3 h。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離、純化、鑒定及系統發育學分析

1.2.1.1 菌株的分離、純化

采用組織分離法分離、純化菌株。將采集新鮮羊肚菌子實體清洗干凈后，于超凈工作臺中用75%的酒精消毒表面，隨后切取菌柄與菌蓋連接處的組織塊（指甲蓋狀）接種于PDA培養基上，于23 ℃培養2～3 d。待長出新的菌絲后，鏟取菌落邊緣的菌絲塊接種至空白PDA 培養基上，23 ℃培養2～3 d，同樣鏟取菌落的菌絲塊接種至空白PDA 上培養。如此反復以上操作，直至獲得無雜菌污染的純菌株，于-80 ℃冰箱中保藏備用。

1.2.1.2 分離菌株鑒定

將純化的羊肚菌菌株接種至PDA 培養基，于23 ℃培養至菌絲長滿平板后，刮取部分菌絲用于提取DNA。使用真菌基因組DNA提取試劑盒（上海生工生物科技有限公司）提取基因組DNA。用通用引物ITS5（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）擴增ITS 序列，引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。50 μL 反應體系：2×Rapid Taq Master Mix 25 μL，DNA 模板2 μL，上下游引物各 2 μL，ddH2O 19 μL。反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 70 s，30個循環；72 ℃ 5 min。PCR 產物直接交由北京擎科生物科技股份有限公司測序。所得序列在NCBI 數據庫中比對分析，并結合形態學進化分離純化菌株種屬的鑒定。

1.2.1.3 系統發育樹構建

從NCBI 網站下載六妹羊肚菌M.sextelata及梯棱羊肚菌M.importuna的ITS 序列（GeneBank 號分別為KX809733、MG121861）。用MEGA 7.0 對所獲得的ITS 序列進行組裝、校對、編輯以及多序列比對。以Morchella rufobrunnea（JX292973）作為外類群，用MEGA7 軟件中的最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構建系統發育樹[9]。

1.2.2 菌株穩定性檢測

采用連續傳代培養的方法檢測羊肚菌菌株的遺傳穩定性及其是否容易發生退化。以16株分離、純化的羊肚菌菌株作為出發菌株，用無菌的打孔器制備直徑為5 mm 的接種塊，接種于PDA 固體培養基平板（直徑15 cm）的邊緣，置23 ℃的恒溫培養箱中連續培養8～10 d。將以上培養獲得的菌絲體作為第一代菌株，于菌絲尖端打孔制備接種塊，接種于PDA 培養基上繼續進行傳代培養。重復以上操作使羊肚菌菌株連續傳代培養6～7 代，并測定記錄每一代菌株的菌絲生長速度及其菌落的形態特征。

1.2.3 初篩

生產菌種的制備：將前期儲藏于-80 ℃冰箱的16 株羊肚菌菌株活化后，接種于PDA 培養基，置23 ℃培養3～6 d。將以上復活后菌株接種于栽培種培養料中，20 ℃暗光培養25～30 d，待菌絲長滿料袋后繼續培養7～10 d作為生產菌種。

選址和建棚：選擇土質疏松潮濕、排水良好的地塊（試驗大棚位于陜西省商洛市柞水縣下梁鎮西川村），搭建6 m×35 m×3 m 規格的拱棚，棚上覆蓋遮陽網，避免強光直射。

播種及菌絲生長期管理：11 月上旬至下旬播種。于棚內作栽培畦，畦高15 cm，將栽培畦分割為面積5 m2的小區（寬1.5 m，長3.3 m，小區間的距離為0.3 m）。每株供試菌株播種3 個小區。在栽培畦上挖深20～25 cm 播種溝，然后將掰成核桃狀的菌種塊均勻撒在溝內，播種量為0.5 袋/m2，播種后覆蓋10～15 cm 的自然土并適當噴水。菌絲生長期間，主要是土壤含水量的管理，控制土壤含水量 20%～25%即可。

放置營養袋：播種后約10 d，開始放置外源營養袋，在營養袋的一面劃一道10 cm 長口，營養袋劃口的一面朝向畦面平放，稍壓一下袋，使羊肚菌菌絲可以直接接觸營養袋中的培養料。羊肚菌菌絲將慢慢長入營養袋中吸收營養，并向土層內的菌絲傳送。每個小區均勻放置20～30袋營養袋。

出菇管理：羊肚菌出菇管理期間，應保持大棚溫度10～18 ℃、空間相對濕度80%～90%、土壤含水量15%～25%；每天早、晚各通風1 h，保證菌絲生長期間有足夠的新鮮空氣。隨著氣溫的下降，在12 月中旬最低氣溫大約5 ℃時，在拱棚上加蓋薄膜保溫。

采摘及記錄：子實體出土7～10 d 后便可生長成熟，一般菌蓋顏色變淺、表面蜂窩狀凹陷充分伸展即可采收。管理及采收期間觀察記錄出菇時間、子實體形態等信息，同時統計分析小區產量。

1.2.4 復篩

根據初篩試驗結果，選擇出菇狀況良好的菌株作為出發菌株，于PDA 培養基上連續傳代培養5 代（約40 d）后，用于復篩試驗。于2021—2022 年在陜西省商洛市柞水縣進行復篩試驗。根據初篩試驗結果調整營養袋放置方式，即將劃口數量由1 道變為2道，以使菌絲能充分利用營養袋內的營養物質。每株供試菌株的栽培面積為30 m2/小區（寬1.5 m，長20 m，小區間的距離為0.3 m），3次重復。記錄羊肚菌出菇情況，選擇具有穩定結實能力的菌株進入中試。

1.2.5 中試試驗

將復篩所得的菌株于PDA 培養基上連續傳代培養5 代（約40 d）后，用于中試試驗。于2022—2023 年在陜西省商洛市柞水縣進行中試試驗。根據復篩試驗結果，優化播種方式，即將覆土層厚度調整為6～9 cm，既可保證土壤含水量和保溫效果，又利于通氣。每株供試菌株的栽培面積為50 m2/小區（寬1.5 m，長33 m，小區間的距離為0.3 m），3次重復。試驗記錄羊肚菌出菇情況。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定及系統發育學分析

由圖1 可知，羊肚菌菌株SMM-06、SMM-07、SMM-11、SMM-12、SMM-13 與梯棱羊肚菌M.importuna聚為一支，支持率達100%，其他菌株與六妹羊肚菌M.sextelata聚為一支，支持率達92%。根據16株菌株ITS 序列在NCBI 中的比對分析結果，結合形態學分析可知，菌株SMM-06、SMM-07、SMM-11、SMM-12、SMM-13 均為梯棱羊肚菌M.importuna，其他菌株為六妹羊肚菌M.sextelata。

2.2 菌株穩定性

將16株菌株接種至PDA 培養基上，每隔8～10 d取菌落頂端的菌絲塊傳代一次，并記錄每代菌株的菌絲生長速度及菌落的形態特征，結果見圖2、圖3，表2。

圖2 羊肚菌菌絲菌落形態（初始菌株，于PDA培養基中培養3～4 d）

圖3 羊肚菌菌絲菌落形態（連續繼代培養56 d）

表2 繼代培養過程中羊肚菌菌絲生長速率變化 單位：cm/d

由表2 可知，當羊肚菌菌株連續傳代培養至第56 天，SMM-01、SMM-03、SMM-06、SMM-07、SMM-11、SMM-12、SMM-13菌株的菌絲生長速度（平均長速，下同）未發生明顯的變化，其他菌株的菌絲生長速度都顯著變慢。

由圖2 可知，16 株初始羊肚菌菌株菌絲生長速度都較快，菌落邊緣都較為整齊，未出現棉絮狀的菌落，也未產生明顯色素。

由圖3 可知，當羊肚菌菌株連續繼代培養至第56 天，菌株SMM-04、SMM-16 菌絲生長完全停滯；菌株SMM-02、SMM-05、SMM-10、SMM-14 的菌落呈棉絮狀，邊緣不整齊，且色素明顯；菌株SMM-01、SMM-03、SMM-08、SMM-09、SMM-15 的菌落邊緣不整齊，且色素明顯；菌株SMM-13的色素明顯。

2.3 初篩試驗結果

由表3 可知，初篩試驗，羊肚菌SMM-04、SMM-05、SMM-08、SMM-09、SMM-10、SMM-15 菌株都未出菇；SMM-01、SMM-02、SMM-03、SMM-14 菌株雖正常出菇，但產量普遍較低（均低于900 kg/hm2），且出菇時間明顯長于其他菌株；SMM-06、SMM-07、SMM-11、SMM-12、SMM-13 菌株出菇表現良好，產量均高于1 350 kg/hm2，且出菇時間較短。羊肚菌菌株SMM-06、SMM-07用于后續的復篩試驗。

表3 初篩試驗結果

2.4 復篩試驗結果

由表4 可知，復篩試驗，羊肚菌SMM-06、SMM-07 菌株都能正常出菇，且產量及出菇時間同初篩試驗結果相比，未發生顯著的變化。

表4 復篩試驗結果

表5 中試試驗結果

2.5 中試試驗結果

中試自2022 年11 月24 日開始，至2023 年4 月17 日結束，進入中試階段的羊肚菌菌株（同初篩試驗所用菌株相比，所用菌株均已傳代培養10代以上且-80 ℃冷凍保藏了20個月以上）均出菇穩定，且子實體形態較好（圖4—5）。中試進一步優化栽培技術，羊肚菌產量與復篩試驗相比，有了小幅度地提高。由此可見，羊肚菌SMM-06、SMM-07 菌株是較為適宜秦巴山區氣候環境特點的羊肚菌穩產菌株。

圖4 人工栽培的羊肚菌SMM-06菌株子實體

圖5 人工栽培的羊肚菌SMM-07菌株子實體

3 小結

初篩試驗結果與菌株穩定性試驗結果發現，凡是在初篩試驗中出菇表現良好的羊肚菌菌株（產量高于1 350 kg/hm2），在連續傳代培養過程中都具有較好的穩定性，即菌株連續傳代6～7 代（培養50～60 d）后，其菌絲的生長速度及菌落形態（主要包括菌落邊緣整齊度、菌落是否呈現棉絮狀及產生色素狀況等）與初始菌株相比，未發生明顯的變化。

基于以上發現，復篩試驗以連續傳代5代（培養約40 d）的羊肚菌菌株作為試驗菌株，考察羊肚菌菌株的穩產性，再經中試試驗（所用菌株已傳代培養10 代，培養約80 d 以上）驗證，成功選育出較為適宜秦巴山區氣候環境特點的羊肚菌穩產菌株SMM-06、SMM-07。