PGRN缺失對豬血凝性腦脊髓炎病毒腦內感染小鼠的影響

柳雨竹, 王炳量,陳雨竹,甄 理,王真真,王改麗,李 姿,石俊超,蘭云剛*,宋德光*

(1.吉林大學 動物醫學學院,吉林 長春 130062;2.河北省鄉村振興促進中心,河北 石家莊 050000; 3.吉林省畜牧獸醫科學研究院,吉林 長春 130062)

豬血凝性腦脊髓炎(porcine hemagglutinating encephalomyelitis, PHE)是由豬血凝性腦脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus, PHEV)感染而引起仔豬的一種急性、高度接觸性傳染病[1]。PHEV是冠狀病毒科、β冠狀病毒屬成員[2],主要侵害3周齡以內的仔豬,病死率可達100%;根據臨床表現分為嘔吐衰減型、腦脊髓炎型、以及流感型。近年來由于PHEV的不斷變異,其感染引起的仔豬發病率與病死率逐年增加,然而針對PHE尚無有效的防制措施。

最新研究發現,β冠狀病毒通過富集在晚期內體/溶酶體中,利用溶酶體釋放病毒粒子[3]。靶向溶酶體功能的關鍵功能蛋白可能是抑制冠狀病毒感染和傳播的有效方法。溶酶體蛋白顆粒蛋白前體(progranulin,PGRN)是一種由granulin(GRN)基因編碼,富含半胱氨酸并具有促進生長、營養神經、抗炎等多種作用的分泌型糖蛋白[4]。PGRN在腫瘤細胞、成纖維細胞、神經元、小膠質細胞、血管內皮細胞和外周血中性粒細胞等中均有表達。研究證實,PGRN表達或轉運異常能改變溶酶體形態、水解酶活性,調控溶酶體膜組分含量等擾亂溶酶體正常功能,繼而干擾細胞分解代謝、信號傳導及質膜修復等多種生理過程,參與多種神經系統疾病的發生發展[5]。PHEV感染宿主后會導致大腦皮質區神經退行性病變相關蛋白TDP-43 等的產生和沉積,引發神經元軸突生長發育不良、神經元喪失、髓鞘變性等變化,表明PHEV感染誘發神經退行性病變[6],此外,前期研究發現PHEV感染顯著下調神經細胞PGRN的表達[6]。

然而PGRN在PHEV復制及其致神經損傷過程中的作用并不清楚。據此,本研究以PHEV腦內感染PGRN敲除鼠及其對照小鼠為研究對象,探究PGRN缺失對PHEV腦內感染小鼠的影響,研究結果將不僅有助于揭示PGRN在PHE發病過程中的作用,而且為抗PHEV藥物研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞和病毒PHEV株PHEV-CC14 (MF08-3115)[7],小鼠成神經母細胞瘤細胞(N2a細胞)均由本實驗室保存。

1.2 實驗動物PGRN敲除小鼠由中國農業大學流感病毒試驗室劉金華教授、寧夏大學魏凡華教授惠贈;試驗使用4周齡野生型、敲除型小鼠均由本實驗室培育。2組小鼠在腦內接種PHEV,在接種后5 d 麻醉處死,冰上取出腦組織通過液氮速凍后存放于-80℃冰箱用于后續試驗。

1.3 主要試劑DMEM培養基和胎牛血清均購自Gibco公司;胰蛋白酶購自Sigma公司;5×SDS-PAGE Loading Buffer、RAPI蛋白裂解液(P0013B),抗熒光淬滅封片液均購自碧云天生物技術有限公司;三色預染蛋白Marker、無蛋白快速封閉液(1×)均購自于上海雅酶生物醫藥科技有限公司;2×SYBR Green Master Mixture購自于Bimake公司;GAPDH抗體、TDP-43抗體、Anti-rabbit IgG(H+L)、Anti-mouse IgG(H+L)、FITC-mouse IgG(H+L) 488熒光二抗均購自于Proteintech公司;M-MLV反轉錄酶、RRI、10 mmol/L dNTP、RNAiso Plus Total RNA 提取試劑均購自于TaKaRa公司;PVDF膜(孔徑為0.45,0.22 μm)購自Merck Millipore公司;β-Amyloid抗體購于Santa公司;重組Anti-Alpha-synuclein抗體購于Abcam公司;10% PAGE高分辨彩色(紅色)凝膠超快速配制試劑盒、12% PAGE高分辨彩色(綠色)凝膠超快速配制試劑盒均購于武漢塞維爾生物科技有限公司;ECL化學發光底物購于Biosharp公司;PHEV多抗由本實驗室制備并保存。

1.4 Western blot檢測將采集的小鼠腦組織放于離心管中置于冰上,加入適量的含有PMSF的RIPA裂解液,用酒精消毒后,眼科手術剪碎組織,使用手持均漿器進行均漿,裂解30 min。將樣品以12 000 r/min 4℃離心10 min去除組織碎片,最后加入上樣緩沖液,開水煮沸10 min。取樣品加入預制的PAGE凝膠中,200 V恒壓30 min進行電泳分離;電轉印將蛋白印至PVDF膜上,使用快速封閉液封閉10 min后,加入β-Amyloid、TDP-43、α-SYN、PHEV抗體于4℃孵育過夜;TBST清洗5 min/次,用HRP標記的二抗孵育1 h,充分清洗后ECL顯影并采集圖像,使用Image J 對條帶的灰度值進行分析。

1.5 熒光定量PCR檢測采集的小鼠腦組織根據RNAiso Plus Total RNA提取試劑說明書提取細胞總RNA,測定濃度后反轉錄為cDNA。使用Line Gene9600 Plus熒光定量PCR檢測儀進行熒光定量PCR反應。反應體系如下:2×SYBR Green Master Mix 10 μL,cDNA模板2 μL,上、下游引物各1 μL,蒸餾水補充至20 μL。所有數據均由Gene 9660軟件分析。

1.6 引物合成在GenBank中查找PHEV、GAPDH、IL-1β、TNF-α、CCL4、CCL5、CXCL10、IFN-α、IFN-β、IL-10、IL-12p40等基因序列,使用Primer Premier 5.0軟件設計相應的引物,將引物序列發送至吉林省庫美生物科技有限公司合成(表1)。

表1 熒光定量PCR反應引物信息

1.7 石蠟切片制作小鼠腦組織取出后放在10%中性福爾馬林溶液中固定24 h以上,之后放入不同濃度的酒精中脫水,二甲苯透明后,浸蠟和包埋,最后切片。

1.8 間接免疫熒光將上述切片進行脫蠟復水等步驟后,選用檸檬酸鈉(pH=6.0)溶液進行抗原修復,37℃ 10%脫脂奶粉封閉1 h后,孵育一抗過夜,后用PBS沖洗表面殘余抗體,室溫孵育熒光二抗1 h,PBS沖洗,滴加抗熒光淬滅液(含Hoechst)封片。熒光顯微鏡觀察,選擇不同波段激發光,采集圖像。

2 結果

2.1 PHEV腦內感染小鼠后的體質量和存活時間變化選取4周齡、眼觀體表健康的野生型小鼠(PGRN+/+)和PGRN敲除小鼠(PGRN-/-),在小鼠兩眼連接線的中點向上2～4 cm的部位,進行腦內接種PHEV。記錄接毒后1～5 d的體質量變化(圖1 A),同時統計5 d內2組小鼠的存活率(圖1 B),結果表明,PGRN敲除后體質量下降趨勢緩慢并且延長了小鼠的存活時間。

圖1 2組腦內接種小鼠的體質量變化(A)和生存曲線(B)

2.2 PHEV腦內感染小鼠后病毒含量的變化對4周齡的野生型小鼠(PGRN+/+) 和 PGRN敲除小鼠(PGRN-/-)進行腦內接種PHEV,收集發病的小鼠腦組織進行Western blot、熒光定量PCR和間接免疫熒光檢測,結果如圖2所示,與野生型小鼠相比,PGRN敲除小鼠腦內的病毒含量顯著降低。

A.腦內接種后腦組織內蛋白水平檢測圖;B.腦內接種后腦組織熒光定量PCR;C.腦內接種后2組小鼠大腦皮層內病毒含量熒光圖。***.P<0.001

2.3 PHEV腦內感染小鼠后相關細胞因子的變化在接毒后4～5 d,2組小鼠出現明顯的神經癥狀,采集2組小鼠的腦組織,取全腦應用熒光定量PCR方法檢測細胞因子的變化,發現干擾素和抗腫瘤細胞因子含量明顯升高,趨化因子含量降低,結果如圖3所示。

注:*.P<0.05;**.P<0.01

2.4 PHEV腦內感染小鼠后神經退行性病變相關蛋白的變化收集2組發病后的小鼠腦組織,應用Western blot檢測,發現PGRN敲除鼠腦內TDP-43蛋白的表達水平顯著升高,而α-SYN、β-Amyloid蛋白的表達水平無顯著性差異,結果如圖4所示。

A.β-Amyloid 蛋白圖;B.TDP-43 蛋白圖;C.α-SYN蛋白圖。ns.P>0.05;*.P<0.05

3 討論

PHE是由PHEV感染引起的一種急性接觸性傳染病,在全世界范圍內廣泛流行,主要感染仔豬,臨床上可分為神經型和嘔吐型[8]。2015年,美國密歇根州暴發了以流感樣癥狀為主的、感染成年豬的新型PHEV病毒株[9],韓國也報道了在腹瀉的新生仔豬中發現了1株新型PHEV[10],表明PHEV是在不斷進化的,并且存在變異的風險。因此,深入研究PHEV致病機制和防控手段刻不容緩。

溶酶體作為機體內一種十分重要的細胞器,通過消化細胞內錯誤折疊的蛋白維持機體的穩態。最新研究發現,β-冠狀病毒利用溶酶體進行復制并導致溶酶體功能障礙,但不清楚哪些溶酶體功能相關蛋白在這個過程中發揮關鍵作用。前期研究發現,β-冠狀病毒屬成員PHEV感染能顯著下調溶酶體功能蛋白PGRN表達,暗示該蛋白在PHEV復制過程中發揮重要作用[7]。而本研究首先對PGRN基因缺失小鼠腦內接種PHEV,通過體質量變化和生存率的統計,發現與對照組野生型小鼠相比,敲除PGRN后感染PHEV小鼠的存活時間延長,推斷敲除PGRN后PHEV的感染和復制受到抑制。隨后利用Western blot、熒光定量PCR、間接免疫熒光方法對小鼠腦內病毒含量進行檢測,發現敲除PGRN小鼠腦組織內的病毒含量顯著降低,暗示PGRN在PHEV體內復制過程中發揮重要作用。那么PHEV是否通過下調PGRN并影響溶酶體功能,進而利于病毒的復制和傳播,還有待于進一步研究。

此外,PGRN在胚胎發育早期分布于整個新皮層,在腦部主要由小膠質細胞和神經元細胞表達[11]。PGRN廣泛參與機體的炎癥反應、損傷修復、生長發育等多項病理及生理活動。在炎癥反應中,PGRN可以促進抗炎細胞因子IL-10、IL-1β等的分泌[12]。此外,PGRN與TNF呈拮抗關系,競爭性的結合TNF因子受體,拮抗TNF介導的炎癥反應[13]。已發現PGRN缺失增強了神經炎癥反應,在敲除PGRN后,隨著年齡增加,小鼠在18周齡時會出現小膠質細胞和星形膠質細胞被激活的現象[14]。

為了明確PGRN缺失對感染小鼠炎癥反應的影響,本研究利用熒光定量PCR方法對小鼠的腦細胞因子進行了檢測。結果表明,當敲除PGRN后,干擾素含量顯著升高,增強了對病毒的清除作用。當PGRN缺失后,TNF-α的含量顯著升高,增強了促炎反應,加速了病毒的清除,而趨化因子表達量的降低,暗示敲除PGRN對免疫細胞的遷移產生了抑制作用,但是具體的作用機制尚不明確。

研究表明隨著小鼠年齡的增長,會引起RNA結合蛋白TDP-43的泛素化[15],而病理性TDP-43蛋白的沉積會導致認知功能的下降[16]。PGRN缺失后會導致小膠質細胞變成病理性的狀態,影響溶酶體功能,增強TDP-43蛋白的分泌[17]。在PHEV感染小鼠后,也會引起神經退行性相關蛋白TDP-43表達顯著升高[6]。將PHEV感染PGRN缺失鼠,檢測腦內TDP-43蛋白的表達量,結果發現與未缺失的接毒小鼠相比,TDP-43的表達量顯著升高,因此推測PHEV與PGRN兩者呈協同作用,增強TDP-43蛋白的聚集。

總之,本研究初步證實PGRN缺失能抑制體內PHEV的復制,增強免疫反應,并影響病毒的致病性,研究結果為進一步揭示PGRN在PHEV復制過程中的作用機制提供研究基礎,并為抗β冠狀病毒藥物研究提供參考。