非靶向脂質組學探究花生四烯酸對奶牛乳腺上皮細胞的影響

盧 挺,董偉韜,陳 艷,趙曉萱,劉佩雯,賀海健,張全偉,賀鈺烜,趙興緒*,張 勇 *

(1.甘肅農業大學 動物醫學學院,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省動物生殖生理及繁殖調控重點實驗室,甘肅 蘭州730070;3.甘肅農業大學 生命科學與技術學院,甘肅 蘭州 730070)

奶牛乳腺上皮細胞(bovine mammary epithelial cells,MAC-T)是奶牛乳腺實質的主要細胞,在哺乳期間,MAC-T產生酪蛋白、乳轉鐵蛋白、乳糖、甘油三酯和富含甘油三酯的脂滴等各種乳成分,然后通過頂膜,將每一種乳成分分泌到乳腺腺泡腔中[1-2]。MAC-T還是高度分化的免疫細胞,在受到外界刺激時,通過Toll樣受體識別病原體的相關分子模式,產生免疫應答反應,被廣泛用于體外奶牛乳房炎模型的建立和體外泌乳研究[3]。奶牛乳腺炎是奶牛場最常見的疾病,由于患病奶牛的乳腺組織發生炎癥反應,導致病牛產奶量減少、牛奶質量變差,每年都造成巨額的經濟損失。牛奶中的脂類具有多種生物活性,對人類健康和食品的物理功能都有影響。脂質除了基本的能量儲存和代謝作用外,還是啟動、促進和化解炎癥的信號分子[4]。HAYASHI等[5]通過液相色譜技術,發現在患有乳房炎的奶牛所產的牛奶中,多不飽和脂肪酸的含量有一定的變化,其中ω-6多不飽和脂肪酸呈現升高趨勢,ω-3多不飽和脂肪酸呈下降趨勢,并且在不同的炎癥發展時期,所含的脂質含量及種類各不相同。

花生四烯酸(arachidonic acid,AA)是一種20碳鏈的ω-6多不飽和脂肪酸,化學式為C20H32O2,通常呈發夾狀結構。AA在機體內與細胞膜上的磷脂相結合,如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺等,賦予細胞膜流動性和靈活性[6]。炎癥的發生過程中,在幾種磷脂酶的作用下,AA從細胞膜上釋放出來。游離狀態的AA可以通過酶促(脂氧化酶、環氧化酶和細胞色素P450途徑)和非酶促(花生四烯酸乙醇胺途徑和自氧化反應)反應途徑,產生前列腺素、白三烯、異前列腺素等一系列類二十烷酸,參與免疫、炎癥、氧化應激反應和損傷過程[7]。而細胞膜中的AA通過脫?；h,使細胞中游離AA的濃度保持在很低的水平,并限制AA的氧化,使體內AA保持在一個很低的水平,防止未酯化的AA不受控制的積累,誘導細胞凋亡而損害細胞存活[8]。POMPEIA等[9]報告稱,AA的細胞毒性是不可否認的,但很可能是它在體內的基本功能之一。

脂質組學技術能夠分析和鑒定脂質分子及其互相作用的分子,進而揭示多樣性脂質分子代謝及其代謝調控,從而深入探索其與細胞、器官甚至機體的生理、病理過程之間的關系[10-11]。因此,本研究基于非靶向脂質組學分析AA處理后MAC-T脂質代謝圖譜的變化,識別AA改變的關鍵差異代謝物,以期為深入研究AA的生理作用和進一步闡明AA影響MAC-T的泌乳及免疫功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器AA(Sigma);DMEM高糖培養基(HyClone);胎牛血清(Invigentech);甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚、甲酸銨、二氯甲烷和異丙醇(CNW Technologies)。超凈工作臺、CO2細胞培養箱、Q Exactive Focus高分辨質譜儀、離心機(Thermo);超高效液相儀(Agilent);研磨儀(上海凈信科技有限公司)和超聲儀(深圳方奧微電子有限公司)。

1.2 細胞培養及處理MAC-T購自青旗(上海)生物技術發展有限公司。細胞在含15%胎牛血清的DMEM高糖培養基中,于37℃、5%CO2培養箱中培養,待細胞融合到70%～80%時用于后續試驗。使用0.1 mg/L AA刺激MAC-T細胞12 h,設為AA處理組,添加同等體積完全培養基組設為對照組。

1.3 樣品制備細胞脂質代謝物的提取要求細胞量至少達到 1×107/mL 以上。將按1.2方法處理好的AA處理組和對照組細胞消化終止后離心,各收集3份。加入200 μL H2O,液氮中反復凍融1 min 3次。加入480 μL的甲基叔丁基醚-甲醇混合液(5∶1),-40℃ 靜置1 h后,4℃、6 000 r/min離心15 min。取上清300 μL于EP管中,真空干燥,用100 μL二氯甲烷-甲醇混合液(1∶1)復溶,4℃、13 000 r/min離心15 min,取上清-80℃儲存備用。所有樣品另取20 μL上清混合為質控(QC)樣品。

1.4 非靶向脂質組學分析UHPLC條件:采用Phenomen Kinetex C18色譜柱,流動相A為乙腈-水(6∶4),10 mmol/L甲酸銨;B相為異丙醇-乙腈(9∶1),0.5 mmol/L甲酸銨水溶液。梯度洗脫程序為:0～1.0 min,40%B;1.0～12.0 min,40%～100%B;12.0～13.5 min,100%B;13.5～13.7 min,100%～40%B;13.7～18.0 min,40%B。在柱溫55℃、流速0.3 mL/min的條件下進樣2 μL。MS條件:正、負離子模式噴霧電壓分別為5和 -4.5 kV;正、負離子模式的毛細管溫度分別為320和300℃;護套氣體流量為35 Arb;輔助氣體流量為10 Arb;全MS分辨率為 70 000;MS/MS 的分辨率為 17 500;NCE模式碰撞能量為15/30/45 eV。

1.5 數據分析用ProteoWizard將原始數據轉換成.mzXML格式,用XCMS做保留時間校正、峰識別、峰提取和峰對齊等處理,于BiotreeDB(V2.1)自建二級質譜數據庫進行脂質鑒定。使用 SIMCA-V 16.0.2 和SPSS 26.0軟件進行統計分析,包括T檢驗、變異倍數分析、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 試驗質量控制將分析得到的QC樣本基峰色譜圖進行譜圖重疊比較,可以看出樣本的色譜峰響應強度和保留時間基本重疊,說明試驗重復性好(圖1)。因此用于本試驗儀器的穩定性、試驗的重復性、數據質量的可靠性良好。

圖1 QC樣本在正離子(A)和負離子(B)模式下總離子流色譜圖

2.2 單變量統計分析單變量統計分析可以直觀地展示比較組中脂質分子的整體差異表達倍數情況。圖2顯示了AA處理組細胞與對照組細胞之間脂質代謝物差異分析比較火山圖。如圖3所示,本項目在2種離子模式下共鑒定出1 145種脂質分子,涉及6大類脂質,即甘油磷脂類、甘油脂類、鞘脂類、孕烯醇酮脂類、糖脂類和固醇脂類。

圖2 AA處理組、對照組在正離子(A)、負離子(B)模式下的差異脂質比較分析的火山圖

圖3 脂質分類圖

2.3 多元變量統計分析使用SIMCA軟件對數據進行對數轉換加中心化格式化處理,然后對所得的脂質分子進行PCA和OPLS-DA建模分析(圖4)。PCA(圖4 A、B)和OPLS-DA(圖4C、D)模型顯示,在正、負離子2種模式下,AA處理組與對照組的樣品點均有明顯分離,沒有重疊,并且樣本全部處于95%置信區間內,這表明AA處理后,MAC-T細胞內的脂質代謝物發生顯著變化。隨后對OPLS-DA模型進行200次置換檢測(圖4E、F),其中R2Y是相關系數,表示模型的擬合效果,是1個定量的測量(范圍0～1),表示所建立的模型能在多大程度上代表真實的數據;Q2表示OPLS-DA模型的預測能力,Q2越靠近0.50表示模型預測能力較好。由圖4E可見,正離子模式下R2Y和Q2分別為1.01和0.28,負離子模式下R2Y和Q2分別為0.99和0.49,這些參數表明OPLS-DA模型不存在過擬合現象,且具有良好的分離性能和可預測性,數據可靠。

A,C,E.正離子模式; B,D,F.負離子模式;A、B圖中橫坐標PC[1]和縱坐標PC[2]分別表示第一和第二主成分得分值;C、D圖中橫坐標t[1]P表示預測主成分得分值,縱坐標t[1]O表示正交主成分得分值;E、F圖中橫坐標表示200次置換檢驗的置換保留度,縱坐標表示R2Y或Q2的取值,Intercepts表示R2Y和Q2回歸直線的截距

2.4 顯著性差異表達的脂質分子篩選在正、負離子模式下,根據T檢驗的P值小于0.05和OPLS-DA模型第一主成分的變量權重值(VIP)大于1,這2個指標為卡值標準,對檢測出的脂質分子進行進一步的篩選,從1 145個脂質中篩選出10個具有統計意義的顯著性差異脂質分子,歸屬為4個脂類,7個亞類。其亞類分別為:?；咸烟侨┧崽侵?acylglucuronosyldiacylglycerol,AcylGlcADG)、葡萄糖醛酸糖脂(glucuronosyldiacylglycerol,GlcADG)、單?；视?monoacylglycerol,MAG)、磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)、磷脂酰乙醇(phosphatidylethanol,PEtOH)、硫化己糖基神經酰胺脂肪酸(sulfurHexosylceramide hydroxyfatty acid,SHexCer)和甘油三酯(triacylglycerol,TG)。由圖5可以看出,AA處理組與對照組相比較,AcylGlcADG(14:1/14:1/14:1)、GlcADG(18:2/22:2)、MAG(18:1)、PC(22:5/22:5)、PC(4:0/27:0)、PC(7:0/26:1)、PEtOH(16:0/16:1)、PEtOH(16:1/18:1)和TG(16:0/18:0/20:4)的相對表達量顯著降低;SHexCer(d35:2)的表達量顯著升高。

2.5 差異脂質分子相關性分析進行差異脂質相關性分析有利于進一步了解生物狀態變化過程中代謝物之間的相互調節關系,代謝物相關性往往揭示了代謝物之間變化的協同性:與某類代謝物變化趨勢相同,則為正相關;與某類代謝物變化趨勢相反,則為負相關。采用pearson方法對差異脂質的定量值進行相關系數計算,2個變量之間的相關程度通過相關系數r來表示。相關系數r的值在-1～1之間,但可以是此范圍內的任何值。正相關時,r值在0～1之間;負相關時,r值在-1～0之間。r的絕對值越接近1,兩變量的關聯程度越強,r的絕對值越接近0,兩變量的關聯程度越弱。相關系數在0.6～1.0之間呈強相關,0.4～0.6之間呈中等程度相關,0.2～0.4之間呈弱相關,0.0～0.2之間呈極弱相關或無相關。

處于同一代謝通路上的脂質分子具有較強的相關性。在正離子模式下(圖6A),PC(7:0/26:1)和PC(4:0/27:0)、PC(22:5/22:5)、PEtOH(16:0/16:1)、TG(16:0/18:0/20:4)、MAG(18:1)相互之間呈強正相關性,且PC(7:0/26:1)和PC(22:5/22:5)、TG(16:0/18:0/20:4)、MAG(18:1)之間具有顯著性相關(P<0.05);PC(4:0/27:0)和PEtOH(16:0/16:1)具有顯著性相關(P<0.05);PC(22:5/22:5)和TG(16:0/18:0/20:4)、MAG(18:1)之間具有顯著性相關(P<0.05);TG(16:0/18:0/20:4)和MAG(18:1)之間具有顯著性相關(P<0.05)。在負離子模式下(圖6B),SHexCer(d35:2)和PEtOH(16:1/18:1)、GlcADG(18:2/22:2)之間呈強負相關性;與AcylGlcADG(14:1/14:1/14:1) 之間呈中等負相關性;AcylGlcADG(14:1/14:1/14:1)和PEtOH(16:1/18:1)、GlcADG(18:2/22:2)相互之間呈強正相關性,且具有顯著性相關(P<0.05)。

A.正離子模式;B.負離子模式。圖中橫縱坐標代表該組對比的差異脂質,不同位置的色塊代表對應位置脂質間的相關系數大小,紅色表示正相關,藍色表示負相關,顏色越深代表相關性越強

3 討論

奶牛乳房炎是飼養牛的傳統傳染病,對動物福利和經濟問題都會造成嚴重的影響。由于預防和治療措施的高成本、牛奶產量較低以及早期淘汰,奶牛乳房炎是養牛業遭受經濟損失的主要原因[12]。MAC-T在泌乳和乳腺免疫方面發揮著重要的作用,被廣泛用于體外奶牛乳房炎的研究[13-14]。

AA作為哺乳動物必須脂肪酸之一,具有多種生物學功能。AA特殊的結構,使其天然的與細胞膜上的磷脂相結合,賦予膜柔韌性、流動性和選擇性滲透性,尤其是神經系統、骨骼肌和免疫系統功能所必需的[6,15]。AA可以通過酶促和非酶促反應參與機體氧化應激反應和損傷過程,會產生負責解決炎癥和傷口愈合的介質。AA還被證實具有治療曼氏血吸蟲和日本血吸蟲的潛力[16]。AA對膜流動性的控制會影響參與細胞信號傳導的特定膜蛋白的功能,并在維持細胞和細胞器完整性以及血管通透性方面發揮重要作用。AA對于動物體的生長發育和繁殖性能具有一定的促進作用,還可以提高動物體的免疫力[17]。但是AA在機體內的作用并不總是有益的,有報道稱,AA氧化產生的代謝物不會引發炎癥,但會促進炎癥過程的發展,攝入過量的AA會增加心血管疾病的發生以及動脈粥樣硬化的形成,且對一些細胞具有毒理作用[18]。AA誘導的細胞壞死具有膜完整性迅速喪失、細胞體積增大、存在松散和凝聚的染色質、嗜堿粒細胞減少和DNA完整性被破壞等特點[9]。本研究采用UHPLC-QE-MS系統,對外源性AA處理的MAC-T進行非靶向脂質組學分析,共檢測出1 145種脂質代謝物,發現外源性AA對MAC-T細胞中甘油磷脂類、甘油脂類和鞘脂類影響較大。

本研究中,甘油脂類差異脂質MAG(18:1)和TG(16:0/18:0/20:4) 的含量顯著降低。甘油脂通常是指由甘油和脂肪酸(含飽和和不飽和脂肪酸)經酯化所生成的脂類。甘油扮演貯存與輸送的角色,大部分存在于乳糜微粒及極低密度脂蛋白內。研究表明TG是外源性AA的第1個受體庫,隨后轉移到其他磷脂庫中。在細胞活化過程中,AA從磷脂中釋放,然而,其中大量的AA會被迅速重新整合到TG庫中儲存,只有少量的AA參與下一步的代謝過程。一旦磷脂庫在細胞激活過程中耗盡,TG庫也會向磷脂庫提供AA[19]。細胞中游離AA水平由2個競爭反應控制,一方面,磷脂酶A2介導的磷脂sn-2位置的切割產生游離脂肪酸;另一方面,CoA依賴性?；D移酶調節的?；磻獙⒂坞x脂肪酸重新摻入磷脂。在未刺激細胞中,再?；磻诹字窤2介導的脫?；襟E中占主導地位,因此游離AA保持在非常低的水平[20]。而當游離狀態的AA增加時,AA的釋放速率明顯小于重新結合到TG庫和磷脂庫中的速率,導致細胞中TG含量降低,進而影響TG代謝為二酰甘油,使得二酰甘油向磷脂代謝轉化率降低[21-22]。這或許是本試驗中磷脂PC(22:5/22:5)、PC(4:0/27:0)、PC(7:0/26:1)、PEtOH(16:0/16:1)和PEtOH(16:1/18:1)含量顯著降低的原因之一。本試驗還發現了糖脂類差異脂質AcylGlcADG(14:1/14:1/14:1)和GlcADG(18:2/22:2)的含量顯著降低;鞘脂類差異脂質SHexCer(d35:2)的含量顯著升高,鞘脂及其代謝產物如神經酰胺和磷酸膽堿,還參與調節細胞的生長、分化、衰老和細胞程序性死亡等許多重要的信號轉導[23]。綜上所述,外源性AA可使MAC-T細胞脂類代謝發生變化,主要影響甘油脂類和鞘脂類代謝過程,這些差異表達的脂質分子可能成為奶牛乳房炎發展過程中的相關脂類干預靶點。