C57BL/6NcGAS基因敲除鼠的構建及對豬偽狂犬病病毒增殖的影響

李麗蘊,梁東閣,于海深,郭江濤,曾 磊

(河南農業大學 動物醫學院 農業農村部動物生化與營養重點實驗室/河南省動物生長發育調控重點實驗室,河南 鄭州 450046)

在病毒感染過程中,宿主細胞通過模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)識別病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)或損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs),并引發下游抗病毒天然免疫反應的級聯反應[1-3]。環GMP-AMP(cyclic GMP-AMP,cGAMP)合成酶(cGAS)是一種細胞質DNA傳感器,在所有哺乳動物中cGAS感知病原DNA的入侵,并刺激炎癥信號轉導、自噬和凋亡。cGAS是通過檢測處于錯誤位置的DNA來發揮作用。在正常條件下,DNA被緊密得包裝在細胞核中并受到保護。當DNA片段逃離細胞核并進入細胞質中時,這通常表明存在著一些不祥征兆,比如來自細胞內的損傷或來自侵入細胞內的病毒或細菌的外來DNA。cGAS蛋白通過識別這種處于錯誤位置的DNA而發揮作用。在正常情形下,它在細胞中處于休眠狀態。但是cGAS一旦檢測到DNA存在于細胞核外面時就會開始起作用。當cGAS與胞質中的雙鏈DNA結合時,cGAS在GTP和ATP作用下產生2′,3′-環GMP-AMP(2′-3′-cyclic GMP-AMP,2′,3′-cGAMP)[4],cGA-MP隨后激活干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)、TANK結合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)和干擾素反應因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)或NF-κB信號通路,促進干擾素-β(interferon-β,IFN-β)、白介素-18(interleukin 18,IL-18)和白介素-1β(IL-1β)的產生[5-8]。在這種信號級聯反應結束時,細胞或者得到修復,或者因損壞到無法修復的地步導致自我破壞。

偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)又稱豬皰疹病毒Ⅰ型(suid alphaherpesvirus 1,SuHV-1)或Aujeszky病病毒(Aujeszky's disease virus,ADV),是皰疹病毒科、甲皰疹病毒亞科、水痘病毒屬的一員。偽狂犬病 (pseudorabies,PR)是由PRV引起的多種動物發熱、奇癢(豬除外)并伴有腦脊髓炎的傳染病[9]。除了自然宿主豬,PRV還可以感染廣泛的哺乳動物,包括牛、羊、犬、狐貍、狼和老虎[10]。鑒于cGAS對宿主抵抗病毒感染過程中產生免疫調節作用的重要性,本試驗利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建cGAS基因敲除小鼠,并檢測cGAS基因敲除小鼠與野生型小鼠相比感染PRV后對PRV增殖的影響,證明cGAS在抑制病毒增殖中發揮的重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料C57BL/6N小鼠、非洲綠猴腎細胞Vero、PRV-QXX(野毒株)由農業農村部動物生化與營養重點實驗室保存;PRV gE、gB單克隆抗體由本實驗室制備;cGAS、β-actin購自武漢三鷹生物技術有限公司;黏附載玻片、蓋玻片購自江蘇世泰實驗器材有限公司;RNAiso Plus購自寶日生物技術(北京)有限公司;草酸銨結晶紫染色液購自北京索萊寶科技有限公司;DAPI染色試劑(即用型)購自武漢塞維爾生物科技有限公司;Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly cross-Adsorbed Secondary antibody、Alexa Fluor Plus 555購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1引物設計與合成 根據美國國家生物技術中心(national center for biotechnology information,NCBI)網站所公布的鼠cGAS基因序列,本試驗針對小鼠cGAS基因設計對應的sgRNA,引物名稱及序列見表1。PCR篩選雜合子小鼠引物設計見表2,PCR-cGAS-F1/R1引物的靶向等位基因為438 bp,野生型等位基因為4 101 bp。交叉雜合小鼠產生純合子小鼠,PCR-cGAS-F1/R1引物擴增長度為438 bp;PCR-cGAS-F2/R1引物擴增長度為480 bp。純合子438 bp,雜合子438/480 bp,野生型480 bp。

表2 PCR鑒定引物

根據NCBI網站提供的mRNA序列,應用NCBI的Primer-BLAST網頁設計Q-PCR引物,檢測目的基因名稱和引物序列見表3。引物由上海生工生物有限公司合成。

表3 熒光定量PCR引物

1.2.2cGAS基因敲除小鼠的構建 敲除小鼠品種名稱為C57BL/6N-Mb21d1tm1cyagen,序列號為KOCMP-00464-Mb21d1,品種類型為C57BL/6N。設計gRNA目標序列如下:gRNA1(上游):GAGTGTCAAGCGAACATTTCAGG;gRNA2(上游):GA-ATGACTCTTACCGGATAGTGG。cGAS基因(NC-BI 參考序列:NM_173386;Ensembl:ENSMU-SG00000032344)位于小鼠第9號染色體上。鑒定了5個外顯子,ATG起始密碼子位于外顯子1中,TGA終止密碼子位于外顯子5中(轉錄本:ENSMUST00000070742)。外顯子2～4將被選為目標位點。外顯子2從大約40.50%的編碼區開始。外顯子2～4占編碼區的37.21%。有效KO區域的大小為3 210 bp。KO區域沒有任何其他已知基因。Cas9和gRNA將共同注射到受精卵中用于KO小鼠的生產。

幼鼠將通過PCR進行基因分型,然后進行測序分析。PCR基因分型具體方法如下:剪取小鼠尾尖后使用基因組DNA提取試劑盒,獲得高純度的基因組DNA,測量濃度后進行定量。PCR反應完成后將其產物進行核酸凝膠電泳,通過電泳結果挑選出雜合子小鼠,并將雜合子小鼠進行雜交配對以產生純合子小鼠。

1.2.3Western blot 用Western blot方法檢測C57BL/6N小鼠cGAS敲除情況及感染PRV-QXX后對PRV-gB和PRV-gE 蛋白表達影響。取6周齡左右C57BL/6N和C57BL/6N-cGAS-/-小鼠各6只,每3只為1組,共分為4組,每種小鼠各取1組為空白對照組,其余組為試驗組,試驗組滴鼻感染50 μL 稀釋后的PRV-QXX,將TCID50=1×107PRV-QXX病毒液用DMEM倍比稀釋為TCID50=5×103,DMEM做空白對照。病毒感染3 d后,處死小鼠并將肺臟組織分為3份,分別進行收取組織中總蛋白,用于Western blot試驗、提RNA用于Q-PCR試驗、4% PFA固定用于H&E試驗。取腦和肺臟組織研磨并收取蛋白后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),后進行轉膜、室溫封閉、孵育一抗(cGAS兔多克隆抗體和PRV-gB、PRV-gE單克隆抗體)、孵育二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG)和顯影。以β-actin作為內參。

1.2.4H&E染色 用H&E染色檢測cGAS-/-對小鼠組織形態及感染PRV-QXX后肺臟組織中炎性浸潤的影響。取上述試驗中在4% PFA中固定后的肺臟組織進行H&E染色,染色步驟依次為:組織塊沖水、酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、染色、封片等。

1.2.5小鼠存活率檢測 取6周齡左右C57BL/6N和C57BL/6N-cGAS-/-小鼠各15只,并分別取3只小鼠做空白對照,其余12只感染PRV-QXX,將TCID50=1×107PRV-QXX病毒液用DMEM倍比稀釋為TCID50=5×105。將小鼠用乙醚麻醉后滴鼻感染50 μL稀釋后的病毒液,用DMEM做空白對照,每隔12 h觀察小鼠精神狀態并記錄死亡情況。

1.2.6病毒PFU檢測 取6周齡左右C57BL/6N和C57BL/6N-cGAS-/-小鼠各6只,每3只為1組,共分為4組,其中2組為空白對照組,2組為試驗組,試驗組滴鼻感染50 μL PRV-QXX,將TCID50=1×107PRV-QXX病毒液用DMEM倍比稀釋為TCID50=5×103,用DMEM做空白對照。感染3 d天后處死小鼠,收取肺臟組織的病毒液。用Vero細胞鋪板于24孔板,每孔細胞數量為1×105個。將收取的病毒液用DMEM進行倍比稀釋。待24孔板中的Vero細胞長至90%時,棄上清加入稀釋后的病毒液,放入細胞培養箱吸附1 h,棄病毒液加入維持培養基繼續培養4 d。用4% PFA室溫固定細胞,利用1%結晶紫染色,流水浸洗后倒扣晾干,顯微鏡下統計噬斑數。

1.2.7Q-PCR檢測cGAS-/-對PRV感染后相關基因轉錄的影響,將上述得到的肺臟組織用TRIzol裂解法收取RNA并反轉錄為cDNA后,以cDNA為模板,用TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNase-H Plus)進行Q-PCR檢測。β-actin mRNA表達水平為內參值,計算PRV-TK、PRV-gB、IFN-β、ISG15和ISG20 mRNA表達水平,試驗重復3次。

1.2.8免疫組化檢測cGAS-/-對PRV-gB蛋白表達影響 將感染PRV不同時間點的C57BL/6N和C57BL/6N-cGAS-/-小鼠肺臟組織,經過石蠟包埋后進行切片,烘片后進行脫蠟和復水。然后用EDTA抗原熱修復法對組織切片進行抗原熱修復:將組織切片放置煮沸的抗原修復液中,繼續煮沸15～20 min,自然緩慢冷卻至室溫后用雙蒸水浸洗2次。用1×磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)浸洗后進行室溫封閉和通透,再分別進行室溫孵育PRV-gB單克隆抗體(1∶500稀釋)、熒光二抗和DAPI染色劑浸染細胞核等步驟,1×PBS和雙蒸水分別浸洗3次后封片,晾干后拍照。

2 結果

2.1 C57BL/6N-cGAS-/-小鼠的構建與鑒定已知敲除片段為外顯子2～4所在區域(圖1A)。為確認敲除片段是否正確,對純合子小鼠基因組進行測序。由測序結果可知(圖1B)與理論序列信息一致,表明該KO小鼠已成功構建,可用于后續試驗。取3只雜交產生的幼鼠(2只公鼠,1只母鼠)用上述PCR方法進行基因型鑒定。PCR分型使用的2個對照:水對照(不添加DNA模板);野生型對照(小鼠基因組DNA 400 ng)。電泳分離出大小為438 bp左右的目的條帶(圖1C),表明3只幼鼠均為純合子陽性。隨后另取3只純合子小鼠的肺臟和腦組織用Western blot方法檢測cGAS基因已經敲除完全(圖1D),以野生型小鼠的肺臟和腦組織作對照。

A.小鼠Mb21d1敲除區域示意圖; B.C57BL/6N-cGAS-/-測序結果;C.cGAS-/-純合子鑒定結果(M.DL1000 DNA Marker;1#．幼母鼠;2#,3#．幼公鼠); D.Western blot檢測cGAS敲除結果

2.2cGAS敲除對C57BL/6N小鼠肺臟和腦組織形態影響為驗證cGAS敲除后是否對小鼠組織形態產生影響,使用H&E染色檢測了小鼠肺臟和腦部的組織形態。結果顯示,cGAS敲除后對小鼠肺臟和腦組織形態無明顯影響(圖2)。

圖2 cGAS敲除對C57BL/6N小鼠肺臟和腦組織形態無影響

2.3cGAS敲除提高PRV毒力PFU測定結果顯示,PRV感染C57BL/6N小鼠后測定PFU為102.6PFU/mL,在C57BL/6N-cGAS-/-小鼠體內PFU為105.6PFU/mL,表明隨著PRV感染時間增加C57BL/6N-cGAS-/-小鼠的病毒毒力顯著高于C57BL/6N小鼠(圖3)。結果表明,敲除cGAS能顯著提高PRV毒力。

與對照組比較,*.差異顯著(P<0.05);**.差異極顯著(P<0.01);ns.差異不顯著(P>0.05)。下同

A.Q-PCR檢測感染PRV不同時間PRV-gB基因拷貝數;B.Q-PCR檢測感染PRV不同時間PRV-TK基因拷貝數

A.Western blot檢測感染PRV后PRV-gB和PRV-gE蛋白的表達量;B.免疫組化檢測感染PRV后PRV-gB蛋白的表達量

A.Q-PCR檢測感染PRV不同時間IFN-β基因拷貝數;B.Q-PCR檢測感染PRV不同時間ISG15基因拷貝數;C.Q-PCR檢測感染PRV不同時間ISG20基因拷貝數

2.4 敲除cGAS促進PRV-gB和PRV-TKmRNA轉錄取感染PRV-QXX的C57BL/6N和C57BL/6N-cGAS-/-小鼠的肺臟組織,Q-PCR檢測PRV-gB、PRV-TKmRNA表達水平。隨著PRV-QXX感染時間增加,C57BL/6N-cGAS-/-小鼠體內PRV-gB(圖4 A)和PRV-TK(圖4 B)mRNA表達量顯著高于C57BL/6N小鼠。結果表明,敲除cGAS促進PRV-gB和PRV-TK基因轉錄。

2.5 敲除cGAS上調PRV-gB和PRV-gE 蛋白表達Western blot檢測結果顯示,C57BL/6N-cGAS-/-小鼠PRV-gB和PRV-gE蛋白顯著高于C57BL/6N小鼠(圖5A)。同時免疫組化的結果進一步證實隨著PRV感染時間增加,C57BL/6N-cGAS-/-小鼠PRV-gB蛋白表達顯著高于C57BL/6N小鼠(圖5B)。結果表明,敲除cGAS促進PRV-gB和PRV-gE蛋白的表達。

2.6 敲除cGAS抑制PRV調控的IFN-β、ISG15及ISG20 mRNA轉錄Q-PCR檢測C57BL/6N和C57BL/6N-cGAS-/-小鼠感染PRV-QXX后體內IFN-β、ISG15及ISG20 mRNA表達水平。隨著PRV-QXX感染時間增加,C57BL/6N小鼠體內IFN-β(圖6A)、ISG15(圖6B)和ISG20(圖6C)mRNA表達量顯著高于C57BL/6N-cGAS-/-小鼠。結果表明,敲除cGAS抑制了IFN-β、ISG15及ISG20 mRNA轉錄。

2.7 敲除cGAS促進PRV感染肺臟組織炎性浸潤H&E染色檢測C57BL/6N及C57BL/6N-cGA-S-/-小鼠感染PRV-QXX后肺臟組織內炎性浸潤情況。隨著PRV感染時間的增加,C57BL/6N-cGAS-/-小鼠肺臟組織內炎性浸潤顯著多余C57BL/6N小鼠(圖7)。結果表明,敲除cGAS促進了PRV感染引起的肺臟組織內的炎性浸潤。

2.8cGAS敲除降低PRV感染后小鼠存活率為檢測C57BL/6N和C57BL/6N-cGAS-/-小鼠在感染PRV后存活率的差異,經統計分析,C57BL/6N和C57BL/6N-cGAS-/-小鼠在感染病毒3 d后均出現死亡,但C57BL/6N-cGAS-/-小鼠的死亡率顯著高于對照組,并且在病毒感染5 d后全部死亡(圖8)。結果表明,cGAS敲除后可促進小鼠死亡。

圖8 cGAS敲除促使小鼠存活率降低

3 討論

天然免疫是宿主抵御病原體的第一道防線,而cGAS是天然免疫中的重要銜接蛋白。有研究報道,cGAS是一種觸發Ⅰ型干擾素通路的細胞質DNA傳感器,而且還揭示了一種新的免疫信號傳導機制,其中cGAS產生第二信使cGAMP,cGAMP結合并激活STING[11],從而觸發Ⅰ型干擾素的產生[12]。在缺乏cGAS的細胞中,例如成纖維細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞不能產生Ⅰ型干擾素和其他細胞因子。干擾素家族的細胞因子現在被認為是先天免疫反應的關鍵組成部分和對抗病毒感染的第一道防線。

根據干擾素結構組成及功能可以將其分為3大類:分別為Ⅰ型干擾素、Ⅱ型干擾素、Ⅲ型干擾素,并可以根據它們所傳遞信號的受體復合體進行進一步分類。Ⅰ型(IFNα/β)和Ⅲ型(IL28A、IL28B、IL29)干擾素通常被認為是抗病毒類別[13]。干擾素刺激基因(ISG)在干擾素抗病毒途徑中有不同的作用。一些ISGs的功能是阻止病毒復制,而另一些ISGs則能夠促進或增強某些病毒的復制[14]。ISGs的產生分為2種途徑,抗病毒干擾素通過JAK/STAT信號通路誘導ISGs的產生,還有一些ISGs是在沒有通過干擾素的情況下由病毒感染直接誘導產生的[15]。最早發現的抗病毒ISGs是非常有效的(例如MX1、PKR、OAS1),在近幾年中又發現了新的成員(TRIM 5、ZAP、APOBEC3G、IFITM3)。ISG介導的抗病毒活性的一個特點是,單個干擾素效應器可以抑制病毒復制。據報道,ISG15可以阻止病毒介導的干擾素調節因子3(IRF3)的降解,從而增加IFN-β的表達[16]。

病毒必須進入細胞翻譯和復制基因組,然后釋放感染新的細胞,以此完成它們的生命周期。病毒生命周期的每個階段都是ISG干預的潛在目標。病毒依賴宿主核糖體進行蛋白質合成,而翻譯是ISG干預的常見目標。例如,鋅指抗病毒蛋白(ZAP)、干擾素誘導的帶有四肽重復序列的蛋白(IFIT)家族、OAS-RNASE途徑和PKR這些ISGs可以抑制翻譯[17-19]。除了翻譯,病毒或宿主蛋白的翻譯后修飾對病毒復制和傳染也很重要。ISG15是ISG復雜性的典范,并在將翻譯與翻譯后修飾相結合方面發揮了新的作用[20]。

理論上,所有能夠攜帶DNA進入宿主細胞質的微生物,如DNA病毒、細菌、寄生蟲(如瘧疾)和逆轉錄病毒(如HIV),都可能觸發cGAS-STING通路[21-22]。cGAS酶促合成cGAMP作為一種信號放大機制,可增強相關免疫反應。然而cGAS在宿主細胞質中檢測到自身DNA也可能導致自身免疫性疾病,如系統性紅斑狼瘡、Sj?gren綜合征和Aicardi-Goutières綜合征[23]。先前的研究表明,通過siRNA下調豬cGAS顯著降低了PRV感染后IFN-β mRNA轉錄水平,提示PRV感染可以激活cGAS[24];以及BRD4抑制劑通過cGAS-STING誘導DNA損傷應答和抗病毒天然免疫,抑制PRV的感染[4]。本試驗結果顯示隨著PRV感染時間的延長,敲除cGAS基因可以顯著促進PRV-TK、PRV-gBmRNA的轉錄,PRV-gE蛋白的翻譯以及子代病毒的毒力,因此cGAS在C57BL/6N小鼠體內抑制PRV病毒增殖中發揮重要作用。