質譜時代經典微生物鑒定在臨床微生物實習教學中的傳承與創新

王柏蓮 林 青 林慧珍 蔣誠傳 廖 瑜 潘慧穎 李泰階

廣西醫科大學附屬武鳴醫院醫學檢驗科，廣西南寧 530199

科學技術的發展帶動了醫學技術的進步，臨床微生物學檢驗經歷了漫長的手工鑒定過程，從經典手工鑒定到全自動微生物鑒定再到如今的質譜鑒定時代，實現了革命性的飛躍。廣西醫科大學附屬武鳴醫院是武鳴區唯一的一所三級甲等醫院，承擔著武鳴區內幾所醫學院校的大專生、本科生的實習帶教工作，這些學生畢業后很多就業于基層醫院或一些檢測儀器設施不夠完善的小型醫院，大部分基層醫院并未配置質譜儀，其檢測能力尚待提高，而如何在當今的質譜時代下，讓學生既能掌握質譜快速鑒定微生物技術，又能牢固掌握經典微生物鑒定方法（形態學及生理生化學），并利用經典鑒定方法與質譜鑒定技術的結合，提高對苛養菌、厭氧菌和罕見菌的認知，使學生能夠從容地走向工作崗位，這是一個值得探索的問題。

1 質譜技術原理以基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）技術鑒定微生物為例

微生物的主要生物活性物質是蛋白質和核酸，核酸決定蛋白的表達，蛋白的表達決定生物體表型?；诘鞍踪|指紋圖譜進行的微生物鑒定,相比核酸水平進行的鑒定更為準確和直接[1]。MALDITOF MS 技術通過對微生物蛋白質的解吸分析達到對微生物鑒定和分型目的。其檢測原理是基質與微生物蛋白質形成共結晶體，共結晶體在激光照射下，發生解吸和電離，菌體蛋白質發生離子化，帶電離子在電場作用下進入飛行時間檢測器，離子依質荷比不同而分離，最終在飛行管末端檢測到每個離子峰度，形成指紋圖譜。通過軟件對這些指紋圖譜進行處理并和數據庫中已知微生物標準圖譜進行比對，達到鑒定微生物目的[2]。

2 MALDI-TOF MS技術在微生物鑒定中的優勢與局限

近年來，MALDI-TOF MS 是在微生物鑒定領域方面發展迅速的一種新型鑒定技術，不僅對常見病原菌鑒定準確率達95%以上[3]，還能快速鑒定經典方法很難鑒定的苛養菌、厭氧菌、罕見菌等。經典的生理生化鑒定方法對這些生長條件要求高，生化反應不活躍的細菌，很難鑒定到種水平[4]；質譜技術在真菌鑒定方面，特別是對酵母菌的鑒定已成為一種常規的鑒定方法，對絲狀真菌的鑒定也取得了一定成效[5]；MALDI-TOF MS 技術憑借其具有簡單快速、高效準確的優點，已廣泛應用于食品[6]、水產[7]、獸醫及臨床[8-9]等多個領域的病原微生物鑒定工作，在細菌、真菌和病毒鑒定方面，展現出巨大的應用潛力。但該技術也存在一定的局限性，如質譜技術無法鑒定數據庫中沒有的菌種、新出現的菌種，另外對混合菌的鑒定還不太準確，直接檢測時因細菌濃度不夠而不能檢出[10]；遺傳物質相近的菌種，由于蛋白質指紋圖譜接近無法區分，導致鑒定結果存在偏差和誤差[11]，如陰溝、神戶、霍氏等；質譜技術無法代替需經全面生化反應和血清學試驗鑒定分型的細菌，如沙門菌屬、志賀菌屬等需要經典手工的血清學鑒定作為補充。

3 質譜時代經典微生物鑒定的傳承與創新

質譜時代下臨床微生物教學面臨的現狀：由于質譜技術在微生物鑒定中具有高效、快速、準確、經濟優勢，加上臨床工作量大，師資力量不足，帶教老師只顧著埋頭完成工作，往往忽略了給實習生傳授經典的微生物鑒定方法，只有當質譜結果與細菌形態特征不相符時，才會用經典的鑒定方法進行鑒定。學生進入微生物室實習階段，是理論與實踐結合的提升，但是目前由于過度依賴質譜，致使學生在課堂上學到的經典鑒定方法的理論知識未能在臨床實踐中得到鞏固，如何解決目前面臨的這個問題？本文從以下幾個方面進行探索與實踐。

3.1 以形態學為基礎，增強學生對常見病原菌的感性認知

細菌形態學檢查是細菌重要的鑒定手段之一，通過觀察細菌鏡下形態染色特點和平板上菌落特征，可以為后續的檢驗提供參考依據，對少數具有典型特征的細菌可以進行初步診斷[12]。臨床微生物待測標本在完成檢測前涉及多個崗位環節，包括標本核收、接種、涂片閱片、分離鑒定、藥敏試驗、結果報告等。學生輪轉到分離鑒定崗位時，帶教老師會帶領學生對前一天接種的平板進行判讀，挑選出可疑菌落進行鑒定。帶教老師采用以提問題為基礎的啟發式教學模式[13]，引導學生識別臨床標本可疑致病菌在不同平板上的菌落特征及其染色特點。如：血平板上菌落形成“臍窩狀”的細菌懷疑什么細菌？為什么會有“臍窩狀”？血平板上有生姜氣味、產生金屬光澤的菌落懷疑什么細菌？麥康凱平板適合哪類細菌生長？為什么有些菌落是紅色，有些菌落是無色透明？通過提問式、啟發式教學模式引導學生對臨床常見病原菌的菌落形態特征有初步的感性認識，對于不常見和不認識的可疑菌落做重點標記，等待質譜鑒定結果再決定下一步的鑒定步驟。

3.2 生化反應是框架，由點到面構建細菌知識體系

3.2.1 基于觸酶試驗構建革蘭氏陽性菌知識體系 革蘭氏陽性病原性球菌是一類主要引起化膿性感染的球菌。臨床常見主要包括葡萄球菌屬、鏈球菌屬和腸球菌屬。挑選出的可疑革蘭氏陽性病原性球菌通過觸酶試驗由點到面進行拓展。通過觸酶試驗把革蘭氏陽性球菌分成觸酶陽性的葡萄球菌屬和觸酶陰性鏈球菌屬、腸球菌屬兩大類。通過七葉苷、膽汁七葉苷試驗鑒別出鏈球菌屬和腸球菌屬；利用桿菌試驗、Optoeh 試驗、CAMP 試驗鑒別出化膿性鏈球菌、肺炎鏈球菌、B 群鏈球菌；進行血漿凝固酶試驗，鑒定葡萄球菌的致病性。金黃色葡萄球菌能產生凝固酶，使血漿凝固，是葡萄球菌屬中致病力最強的。鑒定出金黃色葡萄球菌后，可以進一步做能夠初步鑒定流感嗜血桿菌的“衛星試驗”。通過由點到面、觸類旁通進行拓展，把革蘭氏陽性病原性球菌的生化鑒定要點高度概括總結，梳理出脈絡清晰的鑒定思路，使學生系統、牢固地掌握革蘭氏陽性病原性球菌經典鑒定方法。

3.2.2 基于氧化酶、氧化發酵實驗構建革蘭氏陰性菌知識體系 革蘭氏陰性桿菌是臨床最常見的病原菌之一，是泌尿道、呼吸道、腸道、腹腔和盆腔等常見病原菌。革蘭氏陰性桿菌鑒定是否準確，對選擇正確的藥敏鑒定板條非常重要。面對種類繁多的革蘭氏陰性桿菌，怎樣才能達到正確鑒定的目的？從培養學生正確的鑒定思路著手，通過關鍵性試驗進行細菌的大致分類。對于挑選出的可疑革蘭氏陰性桿菌病原菌，可通過氧化酶試驗和葡萄糖氧化發酵試驗把革蘭氏陰性桿菌分成三大類：一是腸桿菌科細菌，氧化酶陰性、發酵葡萄糖；二是非發酵菌，氧化酶陽性（不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌除外），不發酵葡萄糖；三是氧化酶既陽性又發酵葡萄糖的弧菌屬、氣單胞菌屬和鄰單胞菌屬。腸桿菌科細菌又可以根據苯丙氨酸脫氨酶和葡萄糖酸鹽試驗分為三大類：一是苯丙氨酸脫氨酶和葡萄糖酸鹽試驗陰性的腸桿菌科細菌；二是苯丙氨酸脫氨酶陰性，葡萄糖酸鹽陽性的腸桿菌科細菌；三是苯丙氨酸脫氨酶陽性，葡萄糖酸鹽陰性的腸桿菌科細菌。通過關鍵性試驗對細菌進行鑒定分類，使學生對種類繁多的革蘭氏陰性桿菌進行生化鑒定時，沿著氧化酶試驗和葡萄糖氧化發酵試驗這條主線，達到思路清晰、觸類旁通的效果，不至于面對種類繁多的革蘭氏陰性桿菌，感到無所適從。

3.3 血清學是補充，快速診斷病原菌

質譜技術鑒定無法代替血清學，血清學試驗是質譜鑒定技術的有效補充。需經全面生化反應和血清學試驗進行分型的細菌如沙門菌屬、志賀菌屬、霍亂弧菌，致病性大腸埃希菌等，質譜只能鑒定到屬水平，必須進行經典手工的血清學鑒定才能進行分型和保證鑒定結果的準確性。比如質譜鑒定出沙門菌屬，須用沙門菌A ～F 多價血清做玻片凝集試驗，凝集后進一步作O 抗原、H 抗原進行分型。對這些可引起人與人之間的傳播的病原菌，質譜的快速鑒定加上血清學的有效補充，可以快速診斷病原菌，這對控制傳染病的傳播具有重要意義，并為臨床感染性疾病的快速準確診斷和有效治療提供方案[14]。

3.4 關鍵生化反應結合質譜鑒定技術的應用

質譜鑒定是對微生物的蛋白質進行分析，核酸決定蛋白的表達，遺傳物質相近的菌種檢測結果會存在一定的誤差，因此需要關鍵生化反應加以鑒別。例如SS 平板上志賀菌與不發酵乳糖或緩慢發酵乳糖的大腸埃希菌，菌落形態相似，志賀菌抗血清有交叉反應，質譜鑒定為大腸埃希菌，四種多價血清凝集，可用關鍵生化反應醋酸鈉試驗鑒別出來。臨床常見的腸桿菌屬細菌，如陰溝腸桿菌、神戶腸桿菌、阿氏腸桿菌、霍氏腸桿菌，其蛋白峰十分接近，質譜無法區別出來，因此可利用兩個關鍵生化反應V-P 試驗和蜜二糖試驗進行鑒別。

3.5 借助質譜鑒定技術建立罕見細菌菌種庫，提高學生對苛養菌、厭氧菌和罕見菌的認識

閱板時遇到不常見、不認識的可疑菌落，借助質譜鑒定結果，查閱相關資料和文獻，通過外送菌株進行16s RNA 測序確證后[15]，實驗室建立本室罕見細菌庫目錄。微生物實習期一般為6 ～8 周，實習生在實習期內無法獲取一些罕見細菌的標本，導致對某些罕見、苛養菌缺少直觀認識[16]。帶教老師可以通過罕見細菌庫目錄挑選出需要教學的細菌，在帶教老師的指導下由學生進行培養，通過培養鑒定讓學生掌握罕見菌的菌落特征、染色特點、生化特性、耐藥特點，提高實習生專業實踐能力。質譜技術的發展在當今實習帶教中發揮了重要的作用，為學生認識和學習苛養菌、厭氧菌和罕見菌提供了有利機會，同時借助質譜技術，建立實驗室罕見細菌菌種庫，可實現對當代學生的創新性教學。

4 小結

臨床微生物實習生在實習階段是深化理論知識、提升專業實踐能力的關鍵階段。在質譜快速鑒定微生物時代下，把質譜快速鑒定與經典的微生物鑒定貫穿于病原體鑒定的教學過程中，使學生既能掌握先進質譜快速鑒定新技術，并在質譜技術指導下掌握苛養菌、厭氧菌和罕見菌的菌落形態特征、染色特點、生化特性，又能夠熟練掌握經典手工鑒定方法，以便更好地適應各級醫院微生物實驗室的工作需要。