他達拉非粒徑分布對其片劑溶出行為和生物等效性的影響

黃小宏，程 剛，王 征

（1. 沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110015；2. 珠海聯邦制藥股份有限公司 中山分公司，廣東 中山528400）

他達拉非是一種有效的磷酸二酯酶 5（PDE 5）抑制劑，通過選擇性抑制 PDE 5，提高環磷酸鳥苷（cGMP）濃度，松弛動脈血管平滑肌，增強陰莖勃起功能，達到治療勃起功能障礙（ED）的目的[1-2]。該藥物具有活性高，作用持久，不良反應少等優點[3]。他達拉非片由美國禮來公司研發，商品名為 Cialis。根據歐盟 EMEA 關于他達拉非片的科學性論述可知，他達拉非的生物藥劑學分類（BCS）為 Ⅱ 類，即低溶解性—高滲透性，且他達拉非片在制備過程中需要對原料進行微粉化[4]。他達拉非屬于難溶性藥物，目前，有研究通過制備固體分散體[5-6]、納米混懸液[7]等方式減小原料粒徑，提高藥物的溶解度和生物利用度。然而，上述技術存在工藝復雜、成本較高等不足。因此，我們從商業化生產可行性角度考慮，通過直接粉碎原料的方式降低原料粒徑，并研究不同粒徑分布的他達拉非對其片劑的溶出曲線和生物等效性的影響，以制備出與Cialis 生物等效的產品。

1 儀器與材料

1.1 儀器

GF-300AX 型高速粉碎機（上海天祥健臺）；J-50 型氣流粉碎機（意大利馬西姆）；SHK-220B型濕法混合制粒機（北京航天工藝研究所）；YK-160 型搖擺式顆粒機（江蘇瑰寶集團）；TG-ZA-Ⅱ型熱風循環烘箱（常州震華干燥設備廠）；HSD-100 型混合機（浙江迦南）；S250PLUS 型壓片機（淄博伊馬新華）；GBS-150A 型高效包衣機（溫州制藥機械廠）；UPS-4 型鋁塑鋁包裝機（德國烏爾曼）；Mastersizer 3000 型馬爾文粒度儀（英國馬爾文）；RC12A 型溶出度測定儀（天津天大天發）；LC-20A 型高效液相色譜儀（日本島津）。

1.2 材料

他達拉非片（美國禮來，商品名 Cialis，批號 C922336，規格 10 mg）；他達拉非（珠海聯邦制藥股份有限公司，批號 1609048、1906020）；Pharmatose 200M 乳糖（荷蘭 DMV）；微晶纖維素（山東聊城阿華）；交聯羧甲纖維素鈉（德國 JRS）；十二烷基硫酸鈉（湖南爾康）；HPCL 羥丙纖維素（日本曹達）；硬脂酸鎂（山東聊城阿華）；295K620011 薄膜包衣預混劑（上?？房担?；他達拉非工作對照品（珠海聯邦制藥股份有限公司，批號：120216）；乙腈、異丙醇、正己烷為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 不同粒徑分布原料的制備

取他達拉非原料適量，分別采用高速粉碎機（100 目篩）和氣流粉碎機（進氣壓力 0.6 MPa）進行粉碎，即得高速 100 目原料和氣流粉碎原料。

2.2 原料粒徑分布的檢測

按照《中國藥典》2020 年版規定的粒度和粒度分布測定法[8]，采用激光衍射法（干法）測定，設定儀器參數（振動進樣速度 50%，分散氣壓 3.5 MPa，掃描時間 10 s，折射率 1.52，遮光度0.5%～5%）。分別取上述粉碎后原料適量，測試粒徑分布，結果見表1。

Table 1 Results of particle size distribution表1 粒度分布檢測結果

由表1 檢測結果可知，與高速 100 目原料相比，氣流粉碎原料的粒徑分布D10、D50和D90均顯著下降。

2.3 他達拉非片的制備

參考美國 FDA 網站公布的 Cialis 說明書中的處方描述部分[9]，片芯輔料選擇乳糖、微晶纖維素、交聯羧甲纖維素鈉、十二烷基硫酸鈉（SDS）、羥丙纖維素、硬脂酸鎂。制備工藝參考歐盟EMEA 關于他達拉非片科學性論述中藥品的描述[4]，采用濕法制粒工藝分別針對高速粉碎原料和氣流粉碎原料進行他達拉非片制備。制備方法為稱取羥丙纖維素 0.575 kg，加入 6.612 kg 純化水攪拌至澄清透明，備用。稱取粉碎后原料 1.0 kg，再分別加入乳糖 17.88 kg、交聯羧甲纖維素鈉0.9 kg、十二烷基硫酸鈉 0.07 kg，混勻，加入羥丙纖維素溶液濕法制粒，干燥整粒，加入微晶纖維素 3.75 kg、交聯羧甲纖維素鈉 0.7 kg、硬脂酸鎂0.125 kg，混勻，壓片，包衣，即得他達拉非片（規格 10 mg，批號為 71218301、Y55011191211，對應原料粒度分布D90分別為 34.4、16.0 μm）。

2.4 溶出度測定方法的建立

2.4.1 色譜條件

色譜柱為辛烷基硅烷鍵合硅膠（250 mm × 4.6 mm, 5 μm）；流動相為 0.1% 三氟乙酸溶液—乙腈（55∶45）；檢測波長285 nm；流速1.2 mL·min-1；柱溫40 ℃；進樣體積50 μL。

2.4.2 對照品溶液

取他達拉非對照品約 20 mg，精密稱定，置于 100 mL 量瓶中，加乙腈 20 mL 使溶解，用溶出介質稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置于100 mL 量瓶中，用溶出介質稀釋至刻度，搖勻即得。

2.4.3 供試品溶液

取他達拉非片 6 片，按照溶出度與釋放度測定法（槳法）[10]，參考他達拉非片進口藥品注冊標準[11]，以 0.5% SDS 溶液為溶出介質，介質體積 1 000 mL，轉速為 50 rpm，溫度 37.0 ℃，分別在 10、30 min 時取溶出液 10 mL（及時補液），濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.4.4 方法學驗證

（1）專屬性試驗

濾膜干擾試驗：取他達拉非片，依法測定，在 10、30 min 分別取溶出液兩份，一份用孔徑為 0.45 μm 的濾膜過濾，作為供試品溶液；另一份3 000 rpm 離心 10 min，取上清液作為供試品溶液，按照“2.4.1 色譜條件”測定峰面積。濾膜過濾供試品溶液峰面積分別是離心所得上清液供試品溶液峰面積的 99.12% 和 99.92%，表明濾膜不干擾本品溶出度測定，見圖1（A、B、C、D）。

Fig. 1 HPLC chromatograms of the test of specificity圖1 專屬性試驗 HPLC 色譜圖

輔料干擾試驗：取空白輔料溶液，按照“2.4.1 色譜條件”進樣分析。結果表明，空白輔料不干擾本品溶出度測定，見圖1（E）。

綜上可知，該方法專屬性良好。

（2）回收率試驗

稱取空白輔料 12 份，置于 200 mL 量瓶中，另精密稱取他達拉非原料約 8.0、16.0、32.0、40.0 mg，各3 份，置上述 200 mL 量瓶中，加乙腈 40 mL 超聲使溶解，用溶出介質稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液 5 mL，分別置于 12 個 100 mL 量瓶中，再加溶出介質稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

另精密稱取他達拉非工作對照品約 20 mg，置于 100 mL 量瓶中，加乙腈 20 mL 超聲使溶解，用溶出介質稀釋至刻度；精密量取上述溶液5 mL 置于 50 mL 量瓶中，加溶出介質稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液，進樣測定，計算回收率，結果見表2。

Table 2 Results of the test of recovery rate表2 回收率試驗結果

由表2 可知，該法回收率為 99.14%～100.73%，RSD 為 0.49%，可知本法回收率良好。

（3）線性試驗

取他達拉非工作對照品約 20 mg，精密稱定，置于 100 mL 量瓶中，加入 20 mL 乙腈，超聲使溶解，再加溶出介質稀釋至刻度，作為貯備液。精密量取貯備液適量，用溶出介質稀釋，制成不同濃度溶液，按照不同進樣體積進行測定，以進樣量對峰面積進行線性回歸，結果見表3。

Table 3 Results of the test of linearity表3 線性試驗結果

結果表明，他達拉非進樣量在 0.105～2.090 μg 范圍內，與峰面積線性關系良好，線性方程Y= 1688985X+ 798；相關系數r= 1.000 0。

（4）溶液穩定性試驗

取他達拉非片，依法測定，在 10、30 min 分別取溶出液，濾過，取續濾液作為供試品溶液，室溫放置 12 h，分別于 0、1、2、3、4、6、8、10、12 h 測定峰面積，RSD 值分別為 0.20%、0.20%，說明供試品溶液室溫放置 12 小時內穩定性良好。

2.5 溶出曲線的測定

2.5.1 標準介質（0.5% SDS 溶液）溶出曲線

分別取自制品和 Cialis，按照“2.4 溶出度測定法”測定，溶出介質選用 0.5% SDS 溶液，分別于 5、10、15、30、45、60 min 取樣測定，結果見表4，相應溶出曲線見圖2（A）。

Fig. 2 Dissolution curves of self-made products and Cialis in 0.5% SDS (A), 0.3% SDS (B) solutions and water (C)圖2 自制品和 Cialis 在 0.5% SDS (A)、0.3% SDS (B) 溶液和水 (C) 中的溶出曲線圖

Table 4 Dissolution curves of self-made products and Cialis in 0.5% SDS solution表4 自制品和 Cialis 在 0.5% SDS 溶液中的溶出曲線

由表4 可知，在 0.5% SDS 溶液中，自制品和 Cialis 在15 min 累積溶出度超過 85%。文獻[12]指出，參比制劑與仿制制劑在 15 min 以內平均溶出率均達 85% 以上，可以判定二者溶出曲線相似。因此，可知自制品和 Cialis 在 0.5% SDS 溶液中相似。

2.5.2 其他介質（0.3% SDS 溶液、水）溶出曲線

由于溶出介質中添加了助溶劑 SDS，為了提高溶出曲線的區分效果，將溶出介質中 SDS 濃度由 0.5% 降低至 0.3% 和 0%（水），分別取自制品和 Cialis，按照“2.4 溶出度測定法”測定，分別于 5、10、15、30、45、60 min 取樣測定，結果見表5、表6，相應溶出曲線見圖2（B、C）。

Table 5 Dissolution curves of self-made products and Cialis in 0.3% SDS solution表5 自制品和 Cialis 在 0.3% SDS 溶液中的溶出曲線

由表5 可知，在 0.3 % SDS 溶液中，原料D90= 34.4 μm 的自制品溶出速度明顯減緩，15 min累積溶出度已小于 85%，不符合與 Cialis 相似的要求。而原料D90= 16.0 μm 的自制品和 Cialis溶出速度減緩不明顯，15 min 累積溶出度仍超過 85%，仍符合相似的要求。由表6 可知，由于他達拉非在水中為低溶解性[4]，各樣品在水介質中溶出終點（60 min）的累積溶出度均小于 40%，通過表6 數據和圖2（C）可知，原料D90= 16.0 μm 的自制品和 Cialis 的溶出曲線仍具有更好的擬合效果。

2.6 生物等效性研究

2.6.1 給藥方案

根據溶出曲線測定結果，選擇采用原料D90= 16.0 μm 制備的自制品（批號 Y55011191211）作為受試制劑、Cialis（批號 C922336）作為參比制劑，進行空腹條件下單中心、隨機、開放、兩周期、雙交叉的人體平均生物等效性研究。受試者禁食過夜至少 10 小時后，次日空腹服用他達拉非片受試制劑或參比制劑，給藥后 4 小時內禁食。

2.6.2 生物樣品采集和處理

分別在給藥 0 時（給藥前 1 小時內）和給藥后 0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、4.00、5.00、6.00、9.00、12.00、24.00、48.00、72.00、96.00 h（共 17 個采血點）分別由前臂靜脈采血 4 mL 至已標記好含有抗凝劑（EDTA-K2）的真空采血管中，輕柔顛倒混勻 6 次，離心10 min，取上層血漿置于凍存管中，轉移至 -80 ℃ 冰箱中冷藏儲存，供藥代動力學分析。

2.6.3 藥動學結果和等效性分析

健康志愿者空腹單次口服受試制劑或參比制劑后，平均血藥濃度—時間曲線見圖3。根據血藥濃度數據，采用非房室模型（NCA）對藥動學參數（Tmax、Cmax、AUC0-t和AUC0-∞）進行估算，結果見表7。

Fig. 3 Mean blood drug concentration-time curves of test preparation and reference preparation圖3 受試制劑和參比制劑的平均血藥濃度—時間曲線

Table 7 Descriptive statistical results of average pharmacokinetic parameters of test preparation and reference preparation（± s, n=10）表7 受試制劑和參比制劑的平均藥代動力學參數描述性統計結果（± s, n=10）

Table 7 Descriptive statistical results of average pharmacokinetic parameters of test preparation and reference preparation（± s, n=10）表7 受試制劑和參比制劑的平均藥代動力學參數描述性統計結果（± s, n=10）

算術均數藥動學參數 單位受試制劑（批號：Y55011191211）參比制劑（批號：C922336）Tmax h 2.90 ± 1.71 2.30 ± 1.42 Cmax ng·mL-1 185.99 ± 40.53 199.19 ± 47.54 AUC0-t h·ng·mL-1 4 550.26 ± 1 116.49 4 712.12 ± 1 213.68 AUC0-∞ h·ng·mL-1 4 778.83 ± 1 222.15 4 960.27 ± 1 377.39

由表7 可知，受試制劑與參比制劑的達峰時間Tmax、達峰濃度Cmax、AUC0-t和AUC0-∞均相近。采用平均生物等效性評價方法對Cmax、AUC0-t和AUC0-∞進行評價，經對數轉換后，受試制劑與參比制劑的Cmax、AUC0-t和AUC0-∞幾何均值比分別為 93.63%、97.01% 和96.97%，90%置信區間分別為 88.13%～99.43%、91.03%～103.39% 和 90.58%～103.81%?？芍?，空腹單次口服自制品（原料D90= 16.0 μm）后，與 Cialis 比較，Cmax、AUC0-t和AUC0-∞的 90% 置信區間均落在 80%～125% 范圍內，受試制劑與參比制劑具有生物等效性。

3 討論

采用高速粉碎方式對他達拉非原料進行前處理，可使原料粒徑降低至D90= 34.4 μm，而氣流粉碎方式能使原料粒徑進一步降低至D90= 16.0 μm，且隨著原料粒徑降低，制備所得片劑的溶出速度變快。

選擇標準介質 0.5% SDS 溶液對自制品與參比制劑進行溶出行為相似性評價時，不同粒徑分布原料所制產品與參比制劑均相似，無法準確區分原料粒徑對溶出行為的影響。因此，為提高溶出曲線的區分力，將溶出介質中助溶劑 SDS 濃度降低至 0.3%，原料D90= 34.4 μm 的自制品溶出速度明顯減緩，與參比制劑的溶出行為已不相似；而原料D90= 16.0 μm 的自制品與參比制劑的溶出速度減緩不明顯，溶出行為保持相似；將 SDS 濃度繼續降低至0% 時，原料D90= 16.0 μm的自制品與參比制劑的溶出曲線仍具有更好的擬合效果。最終，通過生物等效性研究證明，降低原料粒徑至D90= 16.0 μm，可制備得與參比制劑生物等效的產品，可知他達拉非原料粒徑分布對其片劑溶出行為和生物等效性具有至關重要的影響。