禽傳染性支氣管炎病毒疫苗的研究進展

李 陽,李 摯,鄧鈺蓱,馬淑慧,徐 剛*

(1.天津農學院 動物科學與動物醫學學院 天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室,天津 300392;2.中華人民共和國太原海關,山西 太原 030006)

禽傳染性支氣管炎(infectious bronchitis,IB)是一種急性、高度接觸性傳染病,常見于雞,其病原為傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV),發病率高且傳染性極強,主要影響產蛋雞的生殖功能使其產蛋率及蛋品質下降,給國內外養禽行業帶來巨大的經濟損失[1-2]。IB在臨床上主要分為3種類型:呼吸型、生殖型及腎病型,臨床特征多為氣管啰音、打噴嚏及咳嗽等。IB首次發現于20世紀30年代的美國北達科他州[3],20世紀70年代初在我國開始出現,并于1982年首次報道致腎病型病例[4]。在發現IBV的幾十年以來,IBV毒株不斷變異,血清型眾多,新的血清型也不斷出現?，F有的商品化疫苗通常只能針對性地預防1～2種血清型,不能很好地預防其他血清型病毒的感染,而且免疫持續的時間不長,須多次接種疫苗。因此,當下的國內養禽業迫切需要一種針對大多數流行血清型免疫效果持久的IBV疫苗?，F將現階段疫苗的種類及研發情況進行歸納,并探討現有IBV疫苗的利弊和今后研發的方向。

1 IBV

冠狀病毒在分類上屬于套式病毒目、冠狀病毒科[5],包括α、β、γ和δ 4個屬,其基因組由單股正鏈RNA組成,大小從27 000到32 000 bp,是最大的RNA病毒[6-7]。IBV屬于γ冠狀病毒屬,基因約為27 000 bp,主要分為6個基因片段?；?主要編碼非結構蛋白,占基因組總長的2/3。占基因組總長1/3的基因2～6負責編碼IBV的4種結構蛋白:纖突蛋白(S)、小囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)和4個輔助蛋白(3a、3b、5a和5b)[8]。其中,S蛋白由3 400個核苷酸組成,翻譯后在氨基末端裂解為S1亞基,在羧基末端裂解為S2亞基[9]。S1亞基蛋白在受體結合中起主要作用[10],具有免疫原性,包含中和抗體的多種表位[11-12]。E蛋白是最小的結構蛋白[13-14],具有離子通道活性[13],主要協同M蛋白參與IBV增殖過程中的病毒出芽、裝配與釋放[15-17]。M蛋白在病毒蛋白中占比較大,主要負責病毒的裝配與成熟[18]。N蛋白為40～50 kDa,其主要作用是與病毒RNA結合形成保護基因組結構—核衣殼結構[19-20]。輔助蛋白3a、3b、5a和5b的具體功能未知,可能有增加病毒毒力的作用[21-22],但與病毒復制關系甚微[23]。

2 IB常規疫苗

2.1 減毒活疫苗IB減毒活疫苗的制備方法是將IBV毒株接種于雞胚內并連續傳代將其致弱,免疫原性保留程度較好。但是,免疫效果持續時間比較短,需要在接種2～3周后使用相同或其他毒株的組合再次進行強化接種才可以達到良好的免疫效果[24]。目前,Mass型的H120和H52株是世界上使用最廣泛的減毒活疫苗毒株。但在國內,QX與TW型是目前較為流行的基因型[25],且都與經典的Mass型疫苗株在基因型和血清型上存在較大差異,導致禽類免疫Mass型疫苗株后仍頻頻發病。

近年來,許多研究也發現了針對QX和TW型IBV流行株的疫苗候選株。通過傳代減毒致弱選擇的第90代YX10p90毒株[26]、連續傳代130代得到的SZ130株[27]、IBV QX型弱毒YN(aYN)株[28]、將QX型IBV QXL毒株連續傳87代致弱得到的QXL87株[29]等都是目前針對性預防QX型毒株的良好的疫苗候選株。目前,國內上市的唯一的QX型疫苗——雞新城疫、雞傳染性支氣管炎(LaSota株+QXL87株)二聯活疫苗中使用的就是QXL87株,免疫效果良好[30]。其次,XU等[31]發現,經過140次傳代的TW型減毒株aGD株安全性高,對SPF雞無明顯致病性,免疫后保護TW和QX型毒株的侵害,可以作為預防TW和QX型毒株的疫苗候選。

減毒活疫苗的制備過程簡單、成本較低、使用方便,僅需噴霧免疫或飲水免疫就可以群體免疫,并在禽類體內同時產生細胞免疫和體液免疫[32]。但是,減毒活疫苗的研制耗時長,安全性較差,雖已經過傳代致弱,但仍然有一定的致病能力,有可能在雞群內造成IB的傳播。另外,減毒苗還存在毒力返強或是毒力不穩定的問題,同時使用多種減毒苗時,還可能造成減毒苗間或減毒苗和野毒株間重組變異產生新血清型[33-35]。

2.2 滅活疫苗滅活疫苗是指病毒通過物理或化學方法滅活使抗原失去致病性保留抗原性的疫苗。滅活苗安全性好,不會返毒,早在1977年COUGH等[32]就首次使用油乳劑IB滅活疫苗,王紅寧等[36]之后也研制出了IB多價油乳劑滅活疫苗。近幾年來,滅活苗通常與禽流感、雞新城疫、傳染性法氏囊病等病組成多聯疫苗,洪素梅等[37]試驗表明雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感(H9亞型)三聯滅活苗(LaSota株+M41株+Re-9株)[三聯苗(Re-9株)]投入應用后免疫效果良好。另外,從多年多個省市中篩選出的QX型IBV JS-96株制成的油乳劑滅活苗對QX型IBV的保護效果良好[38],此株可作為IBV多價滅活苗的候選毒株。

但是,滅活苗的缺點也十分明顯:滅活苗誘導的免疫反應很短,因此需要多次接種免疫,同時需要注射其他減毒活疫苗或者大劑量佐劑,成本較高,應用較為困難[39];而且改變注射部位也會影響其免疫效果,甚至可能產生排斥反應[40];滅活苗一般僅針對地方化流行的IBV免疫效果較好。因此,IBV滅活苗對于地方流行株應用范圍更廣,不宜商品化,無法在全國內大規模生產使用。

3 基因工程疫苗

3.1 亞單位疫苗亞單位疫苗是指利用基因工程的方法構建,在高效表達系統中表達強毒病原體的某種免疫相關抗原[41],提取抗原后制成的疫苗,安全性高、無毒、生產成本低、經濟效益高。IB基因工程亞單位疫苗的表達系統主要包括大腸桿菌表達系統、酵母表達系統和昆蟲細胞表達系統等[32]。IBV的主要免疫原基因為纖突蛋白S基因。據報道,全長S1基因重組蛋白免疫小鼠可以產生IBV特異性中和抗體[41]。蘇艷靜等[42]也利用昆蟲桿狀病毒表達系統成功表達了IBV GX-YL5毒株的S1蛋白,調整蛋白濃度后對成年新西蘭大白兔進行免疫,結果試驗動物的特異性免疫良好,S1蛋白的免疫原性足以作為亞單位疫苗的首選靶蛋白。另據報道,植物系統經試驗也可以有效表達IBV S基因——從根瘤菌提取的全長S基因轉入馬鈴薯并進行表達,用獲得的免疫原免疫雛雞且在體內發現抗體[43]。

S蛋白是IBV主要的免疫原蛋白,但研究發現N蛋白上也存在一定量抗原決定簇[44],其蛋白抗原指數比S蛋白要高[45],N蛋白上的線性B細胞抗原也被證實[46],因此N蛋白同樣也可以作為制作IBV亞單位疫苗的有效抗原,這為IBV亞單位疫苗的研發提供了一種新思路。但是,亞單位疫苗相對于其他類型的疫苗來說免疫原性較差,免疫效果較差,在制作時需要添加大量有活性的佐劑,并不能像活疫苗一樣在一定范圍內廣泛使用。

3.2 重組病毒活載體疫苗重組病毒活載體疫苗是利用分子生物學遺傳工程技術,將某一病原的保護性抗原基因整合到目的病毒的非必需基因片段,使該保護性抗原基因表達,一般以痘病毒或腺病毒作為載體。痘病毒是最早作為病毒疫苗載體的病毒,在獸醫領域第一次使用是在1982年牛痘病毒作為載體表達外源基因[47]。痘病毒在IBV疫苗中首次被使用是BINNS等[48]利用其作為載體表達S1蛋白研制出的IBV基因工程疫苗,安全性強,在體內復制無害,可以激發機體較強的免疫應答。雖然痘病毒活載體疫苗具有高效、成本低、免疫持久等優點,但經試驗對比發現,痘病毒疫苗和減毒疫苗的免疫效果相當,而痘病毒疫苗組的抗體水平低于減毒疫苗組[49],因此痘病毒載體疫苗仍然有優化改進的空間。將腺病毒作為重組病毒疫苗的載體時,腺病毒會導致淋巴組織的持續性感染[41-50],顯示以腺病毒為載體的重組疫苗安全性較差,適用范圍受到限制。

3.3 重組細菌活載體疫苗重組細菌活載體疫苗作為一種新型疫苗,和病毒活載體疫苗同是活載體疫苗的主要種類。細菌活載體疫苗主要以減毒沙門菌和分枝桿菌為主。由于細菌的培養方便,耗時短,易擴增,經改造后的細菌毒力低,可以一同運輸多抗原和增強免疫的基因的真核表達質粒[41]。王芳等[51]將構建的重組減毒鼠傷寒沙門菌接種小鼠,觀察1個月后未發現小鼠有異?，F象,解剖后臟器也未見異常,且仍能從小鼠體內分離到細菌,這標志著此疫苗能夠使機體產生足夠的免疫保護。此外,以減毒鼠傷寒沙門菌為載體表達IBV S1基因的重組疫苗防御效果與減毒苗和滅活苗相當[52],以分枝桿菌為載體的IBV重組疫苗同樣具有良好的免疫效果,可以保護SPF雞免受同血清型強毒株的攻擊[53]。雖然以細菌為載體的重組疫苗具有較好的免疫效果,遞呈抗原及基因能力良好,但是其安全性爭議較大,一些減毒的重組疫苗進入機體免疫后仍會毒力返強并產生損傷。另外,重組細菌活載體疫苗在機體免疫時會在一定程度上出現免疫原耐受的現象,導致其免疫效力大幅下降,并不能在禽類養殖業廣泛使用。

3.4 核酸疫苗核酸疫苗又稱基因疫苗,指將含有編碼的免疫源性蛋白質基因序列注入特定的宿主細胞內,其通過宿主細胞表達抗原蛋白并使宿主細胞產生相對應的免疫應答,主要分為DNA疫苗和RNA疫苗2種,目前主要以研究DNA疫苗為主。與傳統減毒苗、滅活苗相比,核酸疫苗無需載體,通過特定途徑激活免疫機制,可以大大降低因載體轉化造成免疫效力下降的風險[54]。在我國,步志高等[55]最早構建了IBV的DNA免疫質粒,證明了其可誘導機體產生體液免疫和細胞免疫。在國外也很早開發出一種名為pDKArkS1-DP的DNA疫苗,接種后免疫效果顯著,受強毒株攻擊后保護率也能達到80%左右[56]。ZUO等[57]利用新設計的免疫原開發了DNA疫苗pV-Scon,接種后可誘導細胞和體液免疫,病毒脫落明顯減少,對于像IBV此類高變異性的病毒DNA疫苗有效可行。另外,S1編碼的DNA疫苗比N基因編碼的DNA疫苗的免疫效果強,在機體受到病毒攻擊后提供主要保護,基于此還開發了一種編碼S1、N和M蛋白的IBV的多價DNA疫苗[58-59]。但是,DNA疫苗大部分都通過肌肉注射進行免疫,這就限制了DNA疫苗在禽類當中的應用[60]。

4 新型佐劑在IB疫苗的應用

疫苗佐劑也稱抗原佐劑,本身不具有抗原性,是一類能夠增強抗原免疫原性的物質。加入了佐劑的疫苗能在很大程度上增強疫苗本身的免疫原性,使免疫效果達到預計效果。常用的疫苗佐劑包括鋁鹽佐劑、油乳佐劑、天然佐劑、細胞因子佐劑、脂質體佐劑、納米佐劑、Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)、皂苷佐劑、聚合物佐劑等。目前,我國獸用的新型佐劑疫苗主要是使用納米佐劑的疫苗。

納米佐劑是指用聚合物等納米粒子材料制成的佐劑[61],其優勢在于納米粒子獨有的物理特性可以使其穿過組織間隙或毛細血管,包裹抗原后表現出較高的穩定性,溶解性強,被機體吸收后可誘導機體產生強烈的特異性免疫反應。LOPES等[62]通過離子凝膠法制備了一種含有BR-I基因型毒株的IB滅活疫苗,該疫苗用殼聚糖納米顆粒包裹,接種納米顆粒包裹的疫苗組相對于其他組在氣管和腎臟等主要部位會產生更強烈的體液和細胞免疫反應。此外,CHANDRASEKAR等[63]通過試驗開發了一種新型納米佐劑系統,此佐劑系統不僅能使疫苗免疫原性增強,還能將病毒抗原分解為供抗原遞呈細胞(antigen presenting cell,APC)攝取的最佳直徑,促進APC對抗原的吸收與加工。納米佐劑疫苗發展潛力巨大,但是近年來納米佐劑技術的發展并不成熟,納米佐劑的材料選取以及納米技術是研發新型納米佐劑疫苗仍要攻克的難關。

5 反向遺傳技術在IB疫苗的應用

反向遺傳操作技術是近年來新興的一種以遺傳學為基礎通過改變遺傳物質或基因型從而深入研究病毒致病基因的技術。利用反向遺傳操作技術定點改造流行毒株毒力基因制成的疫苗稱為反向遺傳基因疫苗。脊髓灰質炎病毒是最早利用該技術拯救出來的RNA病毒[64]。由于冠狀病毒基因組較大,普通的質粒無法作為載體,而且其原生毒性較強,其反向遺傳操作系統的構建一直難以成功,首次成功是20世紀初ALMZAN等[65]利用細菌人工染色體技術成功構建的豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的反向遺傳操作系統。之后,CASAIS等[66]利用痘苗病毒為載體成功拯救出IBV Beaudette株,該株無毒力,可在細胞中繁殖。近年來,周生等[67]、JIANG等[68]利用反向遺傳操作技術以IBV H120株為骨架分別替換流行株IBYZ、ck/CH/IBYZ/2011的S基因,構建的重組株制作的疫苗免疫后效果良好,安全性較高。

利用反向遺傳技術制作出的疫苗為活疫苗,不僅具有與活疫苗相同的良好的免疫原性和安全性,在機體內也能夠誘導較好的免疫反應。該技術可以人為地改變流行毒株的毒力基因并較快地致弱毒株,在大規模制作疫苗時可以省去傳統致弱活疫苗冗長的步驟以及其他新型疫苗繁瑣的程序,降低生產成本,在一定程度上解決IBV血清型眾多而沒有針對性疫苗引發的問題。

近幾年國內對于IB疫苗的研究大多都集中于天然無毒力的IBV Beaudette株,雖然此毒株可以在細胞中繁殖,便于研究,但是它對禽類并無致病性,那么基于此株研究出的疫苗在實際生產生活中是沒有實際意義的。如果能將反向遺傳操作技術利用在我國現有的流行株上,針對性地尋找并改造流行株的關鍵致弱位點或基因,就能在IBV新的血清型出現時快速地研發出疫苗,降低養殖戶成本損失,造福行業。

6 小結與展望

IB是危害禽類養殖業的主要傳染病,接種IB疫苗仍然是當前我國預防和控制IB最有效的手段,主要以減毒活疫苗與滅活苗等常規疫苗使用較為普遍?；贗B病原的研究和當代分子生物學基礎的基因工程疫苗在安全性、免疫效果、持久性等方面都有了提升,新型佐劑疫苗的研究也為IB的預防提供了新思路。但是,IB疫苗的開發和使用仍然面臨著一些問題:IBV基因突變率高,血清型種類眾多,一些新血清型仍在暴發式地出現,不同血清型的毒株之間交叉保護程度較小甚至沒有;疫苗的貯存、運輸、接種方式與飼養管理也同時影響著免疫效果。

目前,傳統疫苗仍是最經濟有效的疫苗,尤其是減毒活疫苗,但是與其他類型的疫苗相比,其最大的缺點就是時效性太差。制備針對流行毒株的減毒活疫苗時,常規傳代致弱通常需要1年以上的時間。如此耗時對于及時研發針對流行毒株的疫苗工作存在較大弊端,因此,有必要尋找更為穩定而且便捷的方法及時獲得可防控流行毒株的減毒活疫苗。近年來,利用反向遺傳技術針對IBV傳代后毒力減弱的機制研究發現,單獨突變S基因或復制酶基因1ab上的關鍵區域,可導致病毒毒力顯著減弱,說明S基因或復制酶基因1ab是影響IBV毒力或致病性的關鍵[31,69-70]。如果能進一步探究這些關鍵區域位點的普遍性,確定影響IBV毒力的決定性氨基酸位點,就可以利用反向遺傳技術,快速精準的改造流行毒株的毒力決定位點,實現對流行毒株的快速致弱,可以更有效、更快捷地研發出更實用、高效、安全的新型IBV疫苗,減少傳統疫苗給養殖業帶來的不便與危害。