環介導等溫擴增技術可視化快速檢測表皮葡萄球菌方法的建立

李 冉，薛 晶，郭文平，康精萌，劉金霞

（承德醫學院病原生物學實驗中心，河北承德 067000）

醫院內感染是影響住院患者原發病治療效果和預后的重要危險因素。2014～2019年期間，我國醫院內感染患病率為2.3%～2.7%，同期美國現患率為3.2%～4%，歐洲為5.9%[1,2]。葡萄球菌作為醫院內感染的常見病原體，主要包括金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌[3]。表皮葡萄球菌，為條件致病菌，主要是通過粘附、定植在醫療器械表面，形成生物被膜，細菌培養和鑒定常常出現假陰性，導致病原學診斷難度加大[4,5]。因此，對表皮葡萄球菌感染的早期診斷和精準治療至關重要。環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種等溫核酸擴增，特異性和靈敏度較好，且不需要昂貴熱循環設備[6,7]?；诖?，本文針對表皮葡萄球菌SesB基因，建立改良的可視化LAMP反應體系，以期應用于感染者的早期快速診斷。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

細菌DNA提取試劑盒、PCR試劑盒、6×Loading Buffer、D2000 Marker均購自北京天根生化科技有限公司；Bst2.0 DNA聚合酶購自New England BioLabs公司；甜菜堿和鈣黃綠素購自Sigma公司；中性紅試劑購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 菌株來源

表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）ATCC 12228；肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）BAA1705；甲型副傷寒桿菌（Salmonella para-typhi A）；恥垢分枝桿菌（Mycobacteria smegmatis）；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；肺炎鏈球菌（streptococcus pneumoniae）均為承德醫學院病原生物學實驗中心保存。

1.3 DNA提取

將表皮葡萄球菌ATCC 1228及各菌種分別接種至5 mL普通肉湯培養基中，搖床130 r/min，37 ℃培養18 h，得到菌懸液。根據細菌DNA提取試劑盒說明，提取各菌種的基因組DNA，應用核酸蛋白分析儀定量稀釋為100 μg/μL，放置于-20 ℃冰箱保存。按以下公式計算拷貝數：拷貝數（copies/μL）=（ng數×10-9×6.02×1023）/（堿基對數×660）

1.4 引物設計

經查閱文獻[8,9]，SesB基因為表皮葡萄球菌的特異性保守基因，針對SesB基因（GenBank：EF424054.1）選擇特異性引物，并以LAMP的外引物為PCR反應引物，引物序列見表1。

表1 LAMP和PCR引物序列

1.5 LAMP反應標準體系

根據Bst2.0 DNA聚合酶說明說配置標準體系，10×緩沖液2.5 μL；10 mM的dNTPs溶液3.5 μL；5 M的甜菜堿溶液2 μL；100 mM的MgSO4溶液1.5 μL；40 μM的FIP/BIP各1 μL；5 μM的F3/B3各1 μL；Bst DNA聚合酶1 μL；DNA模版1 μL，無菌無酶水補足至25 μL。配置好的反應體系置于掌上離心機瞬時離心，向反應管中滴加20 μL液態石蠟油，封閉體系。以無菌無酶水代替DNA模板加入反應體系作為陰性對照，反應條件為恒溫65 ℃，反應60 min后置于冰上終止反應。

1.6 PCR擴增體系和條件

反應體系包括：20 μM的引物F3、B3各1 μL；PCR Mix 12.5 μL；DNA模板1 μL，無菌無酶水補足至25 μL。PCR反應條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 5 min，擴增完成后于冰上終止反應。取5 μL擴增產物和1 μL Loading Buffer混合后，取5 μL加入2%瓊脂糖凝膠孔中，水平電泳30 min后，置于凝膠成像分析儀觀察條帶。

1.7 LAMP可視化檢測染料優化

1.7.1 鈣黃綠素顯色 在反應前，分別向配置好標準體系中加入終濃度為0.05 mM的鈣黃綠素和終濃度為0.6 mM的氯化錳溶液后石蠟油封閉體系，65 ℃反應60 min，觀察反應前后反應管顏色變化，陰性為淡橙色，陽性為淺綠色。

1.7.2 中性紅顯色 在反應前，向配置好的標準反應體系中加入終濃度為500 μM的中性紅溶液后石蠟油封閉體系，65 ℃反應60 min，觀察反應前后反應管顏色變化，陰性為橙黃色，陽性為紅色。

1.7.3 濁度觀察 配置標準反應體系，石蠟油封閉體系，65 ℃反應60 min，比較反應前后反應管濁度變化，陰性為澄清，陽性為渾濁。

1.8 LAMP體系優化

優化結果通過瓊脂糖凝膠電泳和可視化兩種方法呈現，并比較兩種方法優化結果的一致性。

1.8.1 MgSO4優化 保持LAMP標準反應體系中其他條件不變，分別在反應體系中加入0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 μL濃度為100 mM的MgSO4溶液，使其終濃度為0、2、4、6、8、10、12、14 mM，恒溫65 ℃反應60 min。

1.8.2 甜菜堿優化 保持LAMP標準反應體系中其他條件不變，分別在反應體系中加入0、1、2、3、4、5、6、7 μL濃度為5M的甜菜堿溶液，使其終濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 M，恒溫65 ℃反應60 min。

1.8.3 溫度優化 向反應體系中加入優化后的MgSO4濃度和甜菜堿濃度，保持LAMP標準反應體系中其他條件不變，分別在反應溫度于59、61、63、65、67、69、71 ℃下反應60 min。

1.8.4 反應時間優化 向反應體系中加入優化好的MgSO4濃度和甜菜堿濃度，保持LAMP標準反應體系中其他條件不變，在最優反應溫度下，分別反應20、30、40、50、60、70 min。

1.9 特異性評價

為確保反應體系的特異性，以表皮葡萄球菌ATCC 12228基因組DNA為陽性對照，副甲型傷寒桿菌、肺炎克雷伯菌、恥垢分枝桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌基因組DNA為對比菌種，無菌無酶水為陰性對照組，對LAMP引物以及PCR引物特異性進行驗證。

1.10 靈敏度評價

表皮葡萄球菌ATCC 1228基因組DNA使用核酸蛋白分析儀定量，稀釋為1×104copies/μL后再依次進行10倍稀釋，并以此系列DNA為模板進行LAMP和PCR反應，驗證反應體系的靈敏度。

2 結果

2.1 LAMP可視化方法選擇

鈣黃綠素顯色結果顯示，反應后體系顏色由淡橙色變為綠色，反應前后顏色對比明顯(圖1C)。中性紅作為pH指示劑顯色結果顯示，反應后體系由橙黃色變為橙紅色，反應前后對比明顯(圖1B)。濁度比對結果顯示，通過裸眼觀察反應體系濁度變化不明顯(圖1A)。由于中性紅在體系中易出現結晶影響觀察，最終選擇鈣黃綠素作為可視化染料。

圖1 不同類別染料的可視化結果比較

2.2 LAMP體系優化情況

MgSO4優化結果顯示，當體系中MgSO4濃度為4 mM條帶最亮，其次為6 mM，且當其終濃度超過6 mM時條帶亮度逐漸降低（圖2A、2B）；甜菜堿優化結果顯示，當其終濃度為0.4 M時，條帶最亮，甜菜堿添加量為1.4 M時條帶亮度降低（圖2C、2D）；溫度優化結果顯示，在61 ℃時，出現條帶，當反應溫度為63 ℃時，條帶最亮，隨反應溫度升高條帶亮度逐漸降低，且當反應溫度達到71 ℃條帶消失（圖2E、2F）；時間優化結果顯示，在50 min時出現特征性的梯狀條帶，60 min時條帶的亮度較高且與70 min時條帶亮度差別較?。▓D2G和圖2H）。

圖2 LAMP體系優化結果

2.3 LAMP檢測體系特異性評價

LAMP和PCR兩種檢測方法均僅表皮葡萄球菌基因組DNA發生擴增，其他菌株均未發生擴增，且LAMP擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果與鈣黃綠素可視化結果一致（圖3）。

圖3 特異性評價結果

2.4 LAMP檢測體系靈敏度評價

當表皮葡萄球菌DNA濃度為10 copies/μL時，LAMP檢測瓊脂糖電泳仍出現特異性梯狀條帶，提示LAMP體系的最低檢測限為10 copies/μL；PCR電泳結果圖表明其最低檢測限為100 copies/μL，LAMP的靈敏度比普通PCR高出10倍（圖4）。

圖4 靈敏度評價結果

3 討論

表皮葡萄球菌常常導致心臟瓣膜感染、血流感染以及與假體關節等植入物感染，對患者的生命健康造成了嚴重的威脅[10,11]。在致病機制方面，與金黃色葡萄球菌不同的是表皮葡萄球菌只含有一種溶血肽δ-毒素，其感染通常是亞急性或慢性，早期臨床表現不典型，因此，病原學診斷是臨床醫務工作者的瓶頸問題[11]。環介導等溫擴增技術特異性強，靈敏度高，不需要專業的技術人員和檢測設備，僅需要一個恒溫水浴鍋就可以完成檢測，十分適宜在基層推廣使用。并且，近年來研究人員通過控制氣溶膠污染和染料的選擇等方面對該技術不斷改進，使其使用領域不斷擴大。Kitajima等[12]將RT-LAMP檢測新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）和RT-PCR比較，發現在SARS-CoV-2的診斷中，RT-LAMP在實用性上與RT-PCR一致，具有高度靈敏度和特異性，且RT-LAMP反應時間短、操作簡單更適用于現場檢測。本研究對LAMP檢測表皮葡萄球菌的反應體系進行優化后，應用鈣黃綠素染料對實驗結果進行可視化，一步檢測即可出結果，較適用于床旁或基層使用，且根據實驗結果可以看出LAMP反應的靈敏度要比普通PCR高出10倍，操作也更加簡單便捷。但是，因為LAMP反應的高靈敏度和反應擴增產物量巨大，需要十分注意LAMP擴增后核酸氣溶膠造成實驗室環境污染，引起假陽性的問題[13]；同時，像羥基萘酚藍等染料需要在LAMP反應結束后加入，如若開蓋也會增加核酸氣溶膠污染的可能。為此，體系配置、核酸擴增和電泳要嚴格分區操作，也可在配置好的體系中滴加石蠟油，對反應體系進行封閉，減少污染問題的發生。除此之外，在體系反應前加入鈣黃綠素、中性紅等染料，可免除反應結束后揭蓋再加入染料的步驟，既提高了反應的可視性，也可避免開蓋后出現核酸氣溶膠污染的問題。

LAMP反應有多種可視化方法，本研究比較了直接肉眼觀察反應體系濁度的變化以及向體系中加入鈣黃綠素或中性紅染料觀察反應前后體系顏色變化的三種方法。濁度改變主要是由于DNA擴增過程中產生的焦磷酸根可以與反應體系中的Mg2+結合形成沉淀，體系濁度發生改變，但是直接肉眼觀察濁度改變并不是十分明顯。中性紅顯色主要是依靠其pH指示劑的特性，由于DNA擴增中產生的氫離子使體系pH降低，使加入中性紅的LAMP體系反應后，陰性為黃色，陽性為紅色，顏色對比效果最明顯[14]。實驗過程中發現，中性紅染料在反應后較容易出現結晶析出，導致結果觀察不穩定。鈣黃綠素顯色主要是通過焦磷酸根競爭性結合Mn2+，使淬滅狀態的鈣黃綠素游離后顯色，該法反應前向體系中加入鈣黃綠素和氯化錳反應體系呈現淡橙色，反應后陽性為淺綠色，對比較明顯[15]且反應后顯色結果穩定易判斷。因此，最終選擇以鈣黃綠素和氯化錳為可視化檢測方法。

本研究建立了鈣黃綠素可視化快速檢測表皮葡萄球菌的LAMP反應體系。結果表明LAMP檢測體系靈敏度高，特異性好，通過加入鈣黃綠素染料，一步操作即可完成對病原體的檢測，且不需要昂貴的檢測儀器，適用且有望應用于基層及偏遠貧困地區用于表皮葡萄球菌感染的早期診斷。