酶催化法測定13C 標記尿素同位素豐度

雷 雯， 解 龍， 宋明鳴

（上?；ぱ芯吭河邢薰?上海市穩定同位素檢測及應用研發專業技術服務平臺, 上海 200062）

尿素-13C 是尿素[13C]呼氣試驗診斷試劑的有效成份，被廣泛應用于臨床診斷幽門螺桿菌（helicobacter pylori, Hp）感染[1-2]，Hp 是目前已知胃中唯一存活的微生物，當患者口服尿素-13C 藥物后，胃中的Hp 含有人類細胞中不存在的高活性脲酶，在胃酸存在下可以將尿素-13C 分解成13CO2，13CO2被小腸上段吸收后進入血液循環，到達肺部隨呼氣排出[3-4]。使用專業的質譜儀或13C 紅外光譜儀分析服藥前后呼氣樣本，當基線差值（delta over baseline，DOB）≥4 可判定為陽性[5-7]，即患者感染Hp，該方法因具有特異性高、無損傷、無放射性、快速等優勢被公認為胃部感染Hp 診斷的金標準[8-9]。呼氣試驗診斷試劑及原料藥尿素-13C 中同位素豐度的準確測定直接影響到臨床檢測結果，因此準確測定尿素-13C 的同位素豐度顯得尤為重要。

現有尿素-13C 同位素豐度檢測方法主要有液相色譜串聯質譜法[10]、氣相色譜串聯質譜法[11]、傅立葉變換-離子回旋共振質譜法[12]和氣體同位素質譜法[13]等。尿素-13C 原料藥同位素豐度檢測標準主要有美國藥典方法和行業標準方法[14]，美國藥典方法采用氣相色譜串聯質譜法，早期的2014 版美國藥典[15]方法中無需衍生化處理，直接測定尿素-13C 的同位素豐度，但現行2022 版的美國藥典方法[16]中采用衍生化的方法，衍生化步驟相對繁瑣。行業標準方法的原理是利用亞硝酸具有強氧化性[13]，將尿素-13C 氧化生成13CO2，但在反應過程中亞硝酸易分解生成NO2等雜質氣體，同時該方法也不具有選擇性。市場上尿素[13C]呼氣試驗診斷試劑主要分為2 類：①膠囊，尿素-13C 為純物質；②試劑盒，試劑盒中除了尿素-13C 外，還有輔料甘露醇、阿司帕坦、枸櫞酸等物質[17]，試劑盒中的輔料絕對不能添加食品級的碳酸鹽，因為碳酸鹽在胃酸中反應生成CO2，對測試結果進行干擾，針對不同類型尿素[13C]呼氣試驗診斷試劑，現有的檢測技術均無法模擬“胃”中的反應過程，因此開發一種既可以模擬“胃”中的反應過程，又快速的、專一性測試結果準確的尿素-13C 同位素豐度檢測方法顯得尤為重要。

胃中存在的Hp 含有人類細胞中不存在的高活性脲酶，在胃酸存在下可以將尿素-13C 分解成13CO2。脲酶是一種含鎳的寡聚酶，高活性的非氧化還原金屬酶，將尿素催化轉化生成碳酸銨，酸性條件下分解產生二氧化碳。脲酶也被認為是目前已知的催化效率最高的水解酶[18]。脲酶分解尿素的方法在其它領域應用相對比較成熟[19-21]，但用于呼氣試驗診斷試劑及原料藥尿素-13C 的測定卻未見文獻報道。本研究主要對酶活性的最佳溫度、最優的反應時間和脲酶用量等參數進行了優化，并就酶催化法與行業標準方法測定13C 同位素豐度的結果、方法精密度、準確度等進行了對比，初步建立了基于酶催化法測定尿素-13C 同位素豐度檢測方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

MAT-271 氣體同位素質譜儀（美國Finnigan質譜公司）；DF-101Z 智能集熱式恒溫磁力攪拌器（上海衛凱儀器設備有限公司）；ML204T 電子天平（梅特勒托利多科技（中國）有限公司）。

尿素-13C（99.25%13C（原子百分比，下同），上?；ぱ芯吭河邢薰荆?；標樣尿素-13C（≥99.0%13C，3 個批號：I0H205、I1H205 和R081Q0，USP 參考標準）；尿素-13C（99.4%13C，批號：U822503，多倫多化學研究公司）；濃硫酸（AR，江蘇強盛化工有限公司）；脲酶（～1 U/mg，西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司）；尿素（AR，天然豐度1.11%13C）、甘露醇（AR）、亞硝酸鈉（AR），均為國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 質譜條件

電子轟擊（electron impact，EI）離子源；離子源溫度130 ℃；電子能量100 eV；法拉第杯；高壓10 kV；質量掃描30～50 m/z。

1.2.2 酶催化法轉化原理

酶具有專一性，尿素-13C 在脲酶水溶液的存在下催化轉化生成碳酸銨-13C，碳酸銨-13C 在酸性條件下分解產生13CO2，將13CO2氣體引入MAT-271氣體同位素質譜儀中檢測質荷比為44 和45 離子流強度，并計算13C 同位素豐度。

1.2.313C 同位素豐度計算公式

CO2質荷比為44，13CO2質荷比為45，將反應生成的13CO2氣體引入到MAT-271 氣體同位素質譜儀中，檢測質荷比為44 和45 的離子流強度，利用行業標準方法[14]計算13C 同位素豐度：

式中，E、I44、I45分別表示待測物質13C 同位素豐度、質荷比為44 的離子流強度和質荷比為45 的離子流強度。

1.2.4 樣品前處理

圖1、2 分別為進樣旋塞閥和三球反應管的示意圖。取3～10 mg 尿素-13C、50 mg 脲酶加入三球反應管中的“A”位置或“B”位置，取1～2 mL 蒸餾水放入三球反應管中的“A”位置，取0.5～1 mL，3 mol/L 硫酸溶液放入三球反應管中的“C”位置，進樣旋塞閥“4”與三球反應管“5”連接，進樣旋塞閥“1”與真空系統連接，打開旋塞閥“2”和“3”，抽真空。待液體中無氣泡，此時可將進樣旋塞閥中的旋塞閥“2”和“3”關閉，將三球反應管和進樣旋塞閥從真空系統中取下，先將“A”中的蒸餾水倒入“B”球泡中，3～5 min 后再將“C”中的硫酸溶液倒入“B”球泡中混合后生成13C 標記二氧化碳氣體即可作為測定13C 同位素豐度的樣品氣。玻璃連接處均涂抹高真空硅脂。

圖1 進樣旋塞閥Fig.1 Injection stopcock

圖2 三球反應管Fig.2 Three ball reaction tube

在對儀器做好必要的校正設置后，進樣旋塞閥“1”接入氣體同位素質譜儀，將三球反應管的球泡浸入酒精液氮調制的冷凍液中數分鐘，利用氣體同位素質譜儀的進樣系統抽真空，待真空度低于50 Pa 后，打開旋塞閥“2”和“3”，將三球反應管內的13CO2引入氣體同位素質譜儀中，檢測質荷比為44和45 的離子流強度，通過式（1）計算13C 同位素豐度。

2 結果與討論

2.1 反應溫度的考察

酶催化反應的3 大特點為：專一性、溫和性和高效性。酶的溫和性是指酶催化反應需要在相對溫和的條件下進行，適宜pH 和溫度，尿素-13C 與脲酶的水溶液pH 接近7.0，脲酶活性最佳pH 為7.4，pH 在適宜的范圍內?！癆”球泡中的蒸餾水在抽真空時會出現溫度降低的現象，溫度低至10 ℃，此溫度下酶的活性不足，反應溫度過高又會造成酶失活，選擇適宜的反應溫度對準確測定13C 同位素豐度至關重要。三球反應管浸泡在相應溫度的燒杯中，反應5 min，檢測質荷比為45 的離子流強度，將反應溫度為40 ℃的離子流強度設置為100%，其余反應溫度的相對強度見表1，隨著反應溫度的增加，相對強度逐漸增加，在40 ℃時達到最大，之后下降，在20～60 ℃時，13C 同位素豐度無顯著性差異，反應溫度選擇40 ℃。在10 ℃下酶的活性不足，生成的13CO2氣體較少，13C 同位素豐度偏低。

表1 不同反應溫度下的13C 同位素豐度Tab.1 13C isotopic abundances at different reaction temperatures

2.2 反應時間的考察

盡管酶的催化效率比無機催化劑更高，但不如酸堿滴定反應速度快，因此選擇合適的反應時間是準確測定13C 同位素豐度的關鍵。尿素-13C 于40 ℃下，使用過量的50 mg 脲酶能在1 h 內完全分解3～10 mg 尿素-13C，脲酶的最佳pH 為7.4，在“1.2.4 樣品前處理”過程中將三球反應管“C”中的硫酸溶液倒入“B”球泡中混合，此時“B”球泡中的溶液呈酸性，脲酶失活，酶催化反應結束。反應時間是指“A”中的蒸餾水倒入“B”球泡中開始，一直到“C”中的硫酸溶液倒入“B”球泡中結束。

檢測質荷比為45 的離子流強度，將反應時間為60 min 的離子流強度設置為100%，其余反應時間的相對強度見表2，反應時間為1 min 時生成的13CO2氣體較少，13C 同位素豐度偏低，反應時間為60 min 時13C 同位素豐度下降，可能是由于反應時間過長，進樣旋塞閥“4”與三球反應管“5”的連接處有少量空氣進去。由表2 可知，酶催化反應在20 min 內完全反應，在3～5 min 反應時間下檢測13C同位素豐度與完全反應時測試的結果一致，為了縮短反應時間，反應時間優選3～5 min。

表2 不同反應時間下的13C 同位素豐度Tab.2 13C isotopic abundance at different reaction times

在無樣品的空白進樣實驗中發現，由于玻璃連接處均涂抹高真空硅脂，在30 min 內無空氣漏入，40 min 時有少量空氣漏入，漏入空氣的量約占實際樣品氣量的0.1%，空氣中二氧化碳所占的比例為0.03%，二氧化碳的漏入比例非常少，可以忽略不計。尿素-13C 樣品實際檢測過程中整體耗時＜15 min，因此玻璃連接處無需做進一步處理。如果“C”中的硫酸溶液加入過多，在抽真空的時候會有少量濺出，通過管壁流入“B”球泡中，后續的酶催化反應終止，這一現象不易察覺，儀器進樣后才能發現沒有氣體生成，在硫酸溶液中加入少量的甲基紅指示劑可以讓這種“終止反應”被輕易察覺，在反應沒有結束時，“B”球泡中不會有甲基紅指示劑的顏色。

2.3 脲酶用量的考察

在三球反應管“A”位置分別取10、25、50、75、100 mg 的脲酶和1 mL 蒸餾水，取100 μL 30 mg/mL 尿素-13C（標示值99.4%13C）加入三球反應管“B”位置，1 mL、3 mol/L 硫酸溶液加入三球反應管“C”位置，在pH 為7.0、40 ℃溫度下，反應3 min，檢測質荷比為45 的離子流強度，將脲酶用量為100 mg 的離子流強度設置為100%，其余脲酶用量的相對強度見表3。數據表明，隨著脲酶用量的增加相對強度逐漸增加，在10 mg 脲酶催化反應下，最終生成的13C 標記二氧化碳較少，僅為儀器進樣需求的1/4，13C 同位素豐度受質譜本底影響偏低，脲酶用量超過25 mg 時，反應氣量均達到儀器進樣需求，同時測試結果與標示值99.4%13C 基本一致，脲酶用量的增加可以進一步縮短反應時間，因此脲酶用量優選50 mg。

表3 不同脲酶用量下的13C 同位素豐度Tab.3 13C isotopic abundance under different urease dosages

2.4 方法精密度和準確度考察

使用自然豐度尿素與USP（R081Q0）進行1:1配制成同位素豐度為50.06%13C 的試樣，采用1.2.4 節中方式，對不同廠家的尿素-13C 進行同位素豐度檢測，各平行測樣6 次，結果見表4。RSD 均＜0.1%，表明方法精密度良好。USP 3 個批次的尿素-13C 測試值平均值與標識值誤差在0.05%13C 范圍內，USP（I0H205）測試結果與文獻[11]報道值99.0%13C 偏差為0.04%13C，TRC 的尿素-13C 測試平均值與標識值誤差為0.02%13C，1:1 配制的尿素-13C 測試平均值與理論值誤差為0.04%13C，表4 數據顯示測定值與標樣的標示值誤差均在0.1%13C以內，表明方法準確度較高。

表4 精密度和準確度考察Tab.4 Precision and accuracy investigations

2.5 不同檢測方法測定結果比對

同一樣品分別采用酶催化法與行業標準法測定結果比對，各平行測樣6 次。行業標準法的原理是尿素-13C 樣品與亞硝酸鈉試劑在硫酸的條件下反應生成13CO2氣體，將生成的13CO2氣體送入質譜儀檢測系統，用質譜測定其13C 同位素豐度，結果見表5。2 種檢測方法的精密度均＜0.1%，表明2種方法精密度較好，且13C 同位素豐度無顯著性差異。行業標準法采用亞硝酸鈉與硫酸作用生成亞硝酸，利用生成的亞硝酸具有強氧化性，將尿素-13C 氧化生成13CO2，在反應過程中亞硝酸易分解生成NO2等雜質氣體，而酶催化法利用脲酶的專一性，只分解尿素-13C，整個反應無雜質氣體生成，因此，酶催化法相對行業標準法具有很大的優勢。

表5 酶催化法與行業標準方法測定結果比對Tab.5 Comparison of determination results between enzymatic catalysis method and line standard method

2.6 實際樣品檢測

酶促反應對底物有一定的選擇性，所催化的反應通常也僅限于一種特定類型，生成特定的產物，這種現象稱為酶的特異性。酶的特異性是指酶對催化底物的選擇性。尿素、原料藥尿素-13C、膠囊等均屬于純物質，尿素[13C]呼氣試驗診斷試劑盒是混合物，其中含有大量輔料甘露醇、阿司帕坦、枸櫞酸等物質。輔料的添加對結果是否有影響，在pH 為7.0、40 ℃、反應時間為5 min 的條件下，考察了輔料甘露醇的影響。表6 中尿素-13C 化學試劑同位素豐度測試結果為99.15%13C，尿素-13C 化學試劑與甘露醇質量比為1:5 時同位素豐度測試結果為99.13%13C，兩者相差-0.02%13C，表明輔料甘露醇對尿素-13C 同位素豐度的結果沒有顯著性影響，進一步表明方法選擇性較強。對市售的尿素[13C]呼氣試驗診斷試劑盒中尿素-13C 同位素豐度測試結果為99.21%13C，市售產品符合現行2022 版的美國藥典方法[16]中有關尿素-13C 同位素豐度大于等于99.0%13C 的要求。表5 結果表明，酶催化法對于基質樣品尿素[13C]呼氣試驗診斷試劑盒同樣適用，同時酶催化法模擬“胃”中的反應過程，不僅對尿素-13C 進行了檢測，也檢驗了輔料中是否含有微量的碳酸鹽，排除輔料帶來的影響。

表6 不同來源的尿素-13C 同位素豐度測定Tab.6 Determination of urea-13C isotopic abundance from different sources

采用酶催化法對市售的不同來源的尿素、尿素[13C]呼氣試驗診斷試劑（膠囊和試劑盒）及原料藥進行13C 同位素豐度，表6 數據表明不同來源的尿素-13C 同位素豐度存在差異，建立的酶催化法測試尿素-13C 同位素豐度的檢測方法適用于化學試劑、呼氣試驗診斷試劑及原料藥尿素-13C 中13C 同位素豐度的測定。

3 結 語

本文通過對脲酶催化反應時間、脲酶催化反應溫度和脲酶用量等實驗參數進行優化，確定最優條件下脲酶催化反應時間為3～5 min，脲酶催化反應溫度為40 ℃，脲酶用量為50 mg，開發了基于酶催化反應測定尿素-13C 同位素豐度的檢測方法。測試結果表明：建立的檢測方法精密度和準確度良好，能夠滿足不同類型的尿素-13C 同位素豐度檢測的需求；建立的酶催化法既可以模擬“胃”中的反應過程、又具有快速的、專一性強、無雜質氣體生成等優勢，適用于化學試劑、呼氣試驗診斷試劑及原料藥等不同類型的尿素-13C 同位素豐度的質量控制，同時可以用于檢驗尿素[13C]呼氣試驗診斷試劑盒中輔料對尿素-13C 同位素豐度是否存在干擾，為藥品質量監管提供技術支持。