茶提取物復合方對眼致病菌的抑制作用研究

李史儀，陸顯格，湛水秀，郝志龍，余文英*

1. 福建農林大學 園藝學院，福建 福州 350002；2. 福建農林大學 生命科學學院，福建 福州 350002；3. 植物與微生物相互作用福建省高校重點實驗室，福建 福州 350002

近年來，由于人們高強度、高頻率使用電腦、電視與手機等視頻終端產品及晝夜使用空調，患有不同程度干眼癥的人的數量逐年上升，患病率為17% ～ 33%[1]。干眼癥（Dry Eye Syndrome，DES；或Xerophthailmia），因眼球表面水分、豁液和脂質分泌不足造成淚液質、量及動力學的異常，引起淚膜不穩定及眼表面的損害，從而表征為視久疲勞、眼酸脹、干澀無淚及異物感等[2]。干眼癥常與結膜炎、瞼緣炎并發，主要表現為眼干澀引起的淚液分泌量減少以及淚液殺菌成分的變化，進而加重眼睛感染的概率，產生結膜炎、瞼緣炎等輕中度炎癥；而反過來，慢性炎癥引起瞼板腺堵塞進而影響淚液分泌，使眼睛愈發干澀[3,4]。結膜炎和瞼緣炎常為各種細菌、蠕形螨等感染引起的感染性炎癥[5]。目前醫院西藥主流治療手段為滴加人工淚液和眼藥水兩種方法。人工淚液短期內可改善干眼[6]，尤其是對眼睛術后引起的干眼療效好[7]，但其他原因引起的干眼治療效果并不穩定，且若長期使用易產生依賴性；眼藥水中人工化學藥物成分亦可能對人體產生副作用。常見的中醫治療方法有中藥內服、中藥穴位敷貼、針灸及中藥熏蒸等。劉瑩等[8]利用補腎養肝明目方（由枸杞、黃精、菊花、熟地、白芍、太子參、麥冬、五味子、山藥、白蒺藜、丹參、當歸、炙甘草等組成）治療，有效率達96.7%。謝琳等[9]報道采用益氣養陰活血法治療干眼病，有效率達82%。Ocak 等[10]亦發現中成藥芪明顆?？傆行食^90%。

茶具有抗菌明目等功效，與茶葉中的茶多酚及其氧化產物、茶皂素、茶多糖、維生素C、維生素A 等成分密切相關[11]。蒲公英的黃酮類與多糖類等有良好的抗炎、抑菌殺螨以及保護肝臟的作用[12]。菊花具有疏風清熱、平肝明目等功效，對金黃色葡萄球菌等有良好的抑制作用，已被用于干眼癥治療[13]。山茶油主要通過影響細胞壁與細胞膜的通透性，甚至破壞細胞膜的完整性以達到抑菌的效果[14]。由互葉白千層提取的白千層精油作為一種天然抑菌劑，含有單萜烯類、醇類及倍半萜烯類揮發性化合物?；ト~白千層精油具有抗細菌和真菌的作用，還被添加至護眼貼中，被廣泛應用于眼科疾病中螨蟲性瞼緣炎的治療[15,16]。但目前干眼中草藥配方的開發與應用仍不多，且給藥方式主要以內服湯劑為主。中藥熏蒸在短期內對干眼癥有較顯著的療效，其不僅能夠改善局部眼干癥狀且在根本上給予輔助治療，無毒副作用[17]。

為拓寬中草藥給藥方式如霧化熏蒸理療，本研究篩選便于霧化的茶、蒲公英、菊花、山茶油、互葉白千層等草本，分別探討了4 種茶類（綠茶、紅茶、白茶、烏龍茶）提取物對S.aureus與E.coli等眼致病細菌的抑菌效果，以篩選出最佳抑菌茶類，并進一步以此種茶類為主與其他中草藥按不同濃度進行復配，測試復配方對眼科炎癥致病菌的抑菌效果，以期得到對眼科炎癥致病菌有較佳抑制效果的復合配方，并將此抑菌消炎配方應用至干眼SPA 的霧化熏蒸理療中，從而為干眼癥的緩解治療提供一種新型的、天然的輔助性措施。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 草本

供試草本及草本提取液：茶葉（尤溪綠茶、尤溪白茶、尤溪烏龍茶、尤溪紅茶）、野菊花、蒲公英、互葉白千層精油（30%乙醇稀釋，濃度0.04 g/mL）、山茶油（30%乙醇稀釋，濃度0.04 g/mL）；茶葉由福建農林大學園藝學院茶葉加工工程實驗室提供，其余4 種購于福州大參林藥店。

1.1.2 供試菌種

供試菌種：金黃色葡萄球菌（S.aureus）、大腸桿菌（E.coli）、青霉菌（Penicilliumsp.）和鐮刀菌（Fusariumsp.），保存于植物與微生物相互作用福建省高校重點實驗室。

1.2 方法

1.2.1 草本水提液的制備

將尤溪綠茶、尤溪紅茶、尤溪白茶、尤溪烏龍茶、菊花和蒲公英分別用小型超微粉碎機（KN-500A）磨碎，600 目過篩；4 種茶樣分別取5 g 于250 mL 滅菌三角瓶，加入無菌水150 mL，按茶水比1 ∶30（g/v）的比例在沸水浴中浸提45 min，制成1 ∶30（g/v）的茶浸提液。同法分別制成1 ∶10（g/v）的菊花與蒲公英浸提液。將以上各浸提液抽真空過濾，移裝于滅菌容量瓶，密封，置4℃冰箱備用。

1.2.2 菌種制備

S.aureus和E.coli分別接種于LB 液體培養基，37℃下培養18 h，并調節濃度1×106備用；Penicilliumsp.和Fusariumsp.分別接種于PDA瓊脂培養基，28℃下培養3 d，備用。

1.2.3 抑菌效果測定

采用濾紙圓片法（Kirby-Bauer test）。

單一草本對供試細菌的抑菌試驗：將6 mm無菌濾紙片分別放入單一草本提取液中浸泡10 min，以無菌水中浸泡10 min 為對照（除山茶油及互葉白千層精油外），因精油用30%酒精做溶劑，因而在山茶油及互葉白千層精油中以30%的酒精浸泡10 min 做對照。E.coli或S.aureus菌懸液（1×106）200 L 分別均勻涂布于LB 平皿上，再將已浸泡10 min 的2 片濾紙片對稱置于距平皿圓心2 cm 處，37℃培養24 h，觀察并測量抑菌圈。

單一草本對供試真菌的抑菌試驗：取6 mmPenicilliumsp.或Fusariumsp.菌餅接種于平皿中央，再夾取浸泡10 min 的2 片濾紙片對稱置于離真菌菌餅2 cm 處，28℃培養72 h，觀察并測量抑菌圈。

草本復配組合對供試細菌的抑菌試驗：將初步篩選出的白茶與4 種草本蒲公英、菊花、互葉白千層精油、山茶油提取液按表1 組合進行抑菌試驗。

表1 以白茶為主的5 種草本提取液復配比例Table 1 Compound formulas ratio of 5 kinds of herbal extracts mainly based on white tea

抑菌圈測量與結果處理：用游標卡尺以十字交叉法測量抑菌圈直徑，抑菌效果采用試驗組抑菌圈直徑減去對照組抑菌圈直徑來計算，每次抑菌試驗5 個平皿重復及3 次生物學重復。采用Excel 做方差分析。

1.2.4 茶和優化復配方多酚測定

茶類多酚測定參照國家標準GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》中的福林酚試劑法[18]。篩選出的2 種優化配方中各組分用磨樣機磨碎，過40 目篩，按照所占比例稱取一定質量的各組分于10 mL 離心管，其余步驟參照GB/T 8313—2018 中的福林酚試劑法[18]。

1.2.5 優化配方抑菌穩定性試驗

熱處理對優化配方抑菌效果的影響：取2種優化配方的樣品液體提取物，分別于40℃、60℃、80℃下加熱45 min，采用濾紙圓片法測試對S.aureus和E.coli的抑菌效果。

紫外線對優化配方抑菌效果的影響：取2種優化配方液體提取物分別在紫外燈下照射10 min、20 min 和30 min，采用濾紙圓片法測試對S.aureus和E.coli的抑菌效果。

2 結果與分析

2.1 單方劑的抑菌效果

2.1.1 4 種單一茶提取液的抑菌作用

從4 種單一茶提取液的抑菌效果可看出，不同茶類的提取液對不同菌的抑制能力有一定 差異（圖1、圖3A）。前期制取1 ∶30、1 ∶50、1 ∶70 和1 ∶100（g/v）的茶水浸提液效果初篩抑菌效果發現，1 ∶30（g/v）茶水比最好。因此采用4 種茶類的1 ∶30 茶浸提液進行抑菌效果比較，結果發現尤溪白茶對E.coli的抑制效果顯著大于其他3 種茶類（p＜ 0.05），抑菌圈直徑為11.9 mm；尤溪白茶對S.aureus的抑制效果亦大于其他茶類，且與紅茶差異顯著（p＜ 0.05），其抑菌圈直徑為11.8 mm?？梢?，尤溪白茶對常見眼科致病細菌的抑菌效果較好，故選擇尤溪白茶提取物進行后續復配方試驗。

圖1 4 種單一茶提取液的抑菌效果Figure 1 Effects of four kinds of single tea extracts on inhibiting growth of bacteria

2.1.2 4 種單一草本的抑菌作用

從其余4 種草本單一提取液的抑菌效果可看出，不同草本在對供試菌的抑制能力上表現出較大差異（圖2、圖3A、圖3B）。4 種單劑中，互葉白千層精油對E.coli的抑制效果顯著優于其余3 種藥劑（p＜ 0.05），抑菌圈直徑為14.3 mm；對S.aureus，互葉白千層精油的抑菌圈直徑為12.7 mm?；ト~白千層精油對于眼科致病真菌（Penicilliumsp.和Fusariumsp.）均有一定抑制作用（圖3C），而其余3 種提取物對供試的Penicilliumsp.和Fusariumsp.無抑制效果。

圖2 4 種單一草本提取液的抑菌效果Figure 2 Effects of four single herbal extracts on inhibiting growth of bacteria

圖3 各單一提取液抑菌效果Figure 3 Antibacterial effects of each single extract

2.2 二二復配的抑菌效果

2.2.1 2 ∶1 復配

從二二復配液（2 ∶1）對供試菌抑菌效果可看出，4 種二二復配液（2 ∶1）在對供試菌的抑制能力上差異不顯著（p＜ 0.05）（圖4A）。相對于其他3 種復配液，WT ∶EOMA-1 對眼科致病細菌（E.coli和S.aureus）的抑制作用更好，抑菌圈直徑分別為12.0 mm 和11.3 mm；WT ∶CO-1 的抑制效果最弱。且各草本經二二復配后對眼科致病細菌（E.coli和S.aureus）的抑制作用較單一方無明顯提高。

圖4 二二復配液對供試菌抑菌效果Figure 4 Antibacterial effect of compound solution containing two components on tested bacteria

2.2.2 3 ∶1 復配

從二二復配液（3∶1）對供試菌抑菌效果看出，四種二二復配液（3 ∶1）在對供試菌的抑制能力上表現出一定差異（圖4B）。WT ∶EOMA-2對E.coli和S.aureus的抑制作用均大于其他3種復配液，抑菌圈直徑分別為11.4 mm 和13.0 mm；且在E.coli的抑制效果上與其余3 種復配液存在顯著差異（p＜ 0.05）。與單方相比，4種二二復配液（3 ∶1）和二二復配液（2 ∶1）一樣，其對眼科致病細菌（E.coli和S.aureus）的抑制作用無顯著提高。

2.3 三三復配的抑菌作用

2.3.1 2 ∶1 ∶1 復配

從三三復配液（2 ∶1 ∶1）對供試菌抑菌效果可看出，6 種三三復配液（2 ∶1 ∶1）在對供試菌的抑制能力上表現出較大差異（p＜ 0.05）（圖5A）。 相比于其他5 種復配液，WT∶C∶CO-1對眼科致病細菌（E.coli和S.aureus）的抑制作用較好，抑菌圈直徑分別為11.9 mm和10.8 mm；WT ∶C ∶T-1 對E.coli和S.aureus的抑制作用均顯著最弱（p＜ 0.05）。

圖5 三三復配液對供試菌抑菌效果Figure 5 Antibacterial effect of the compound solution containing three components on the tested bacteria

2.3.2 3 ∶1 ∶1 復配

從三三復配液（3 ∶1 ∶1）對供試菌抑菌效果看出，6 種三三復配液（3 ∶1 ∶1）在對供試菌的抑制能力上表現出較大差異（圖5B）。WT ∶T ∶EOMA-2 效果較優，對E.coli和S.aureus的抑菌圈直徑分別為15.4 mm 和14.5 mm，相比于其他5 種復配液差異均顯著（p＜ 0.05）；WT ∶C ∶T-2 對E.coli和S.aureus的整體抑制效果均最弱（p＜ 0.05）。

2.4 四四復配與五五復配的抑菌結果

2.4.1 2 ∶1 ∶1 ∶1 和2 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1 復配

從四四復配液（2 ∶1 ∶1 ∶1）對供試菌抑菌效果可看出，4 種草本提取液四四復配（2 ∶1 ∶1 ∶1）在對供試菌的抑制能力上表現出較大差異（圖6A）。對于S.aureus，WT ∶C ∶T ∶EOMA-1抑菌效果顯著強于其他3 種復配液（p＜ 0.05），抑菌圈直徑為12.2 mm；WT ∶C ∶EOMA ∶CO-1的整體抑菌效果顯著最弱（p＜ 0.05）。

從五五復配液（2 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1）對供試菌抑菌效果（圖6A）可看出，WT ∶C ∶T ∶EOMA ∶CO-1 對眼科致病細菌（S.aureus和E.coli）的整體抑制作用與單方劑一致，其抑菌圈直徑分別為12.0 mm 和11.5 mm。

2.4.2 3 ∶1 ∶1 ∶1 和3 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1 復配

從四四復配液（3 ∶1 ∶1 ∶1）對供試菌抑菌效果看出，4 種草本四四復配液（3 ∶1 ∶1 ∶1）在對供試菌的抑制能力上表現出一定差異（圖6B）。相比于其他3 種復配液，WT ∶C ∶T ∶EOMA-2 對E.coli和S.aureus的抑制效果均顯著最強（p＜ 0.05），抑菌圈直徑分別為14.0 mm和11.8 mm。

從五五復配液（3 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1）對供試菌抑菌效果（圖6B）可看出，WT ∶C ∶T ∶EOMA ∶CO-2 對眼科致病細菌（E.coli和S.aureus）的整體抑制作用與單方劑一致，其抑菌圈直徑分別為11.0 mm 和12.0 mm。

2.5 復配液對真菌的抑制效果

各復配液對眼致病真菌（Penicilliumsp.和Fusariumsp.）抑制試驗發現，復配液對青霉菌Penicilliumsp.無抑制效果；復配液WT ∶T ∶EOMA-2、WT ∶T ∶EOMA-1、WT ∶C ∶T ∶EOMA-2、WT ∶EOMA ∶CO-1 對鐮刀菌Fusariumsp.有一定抑制作用（圖7），其余復配液無抑制效果。

圖7 復配液對鐮刀菌Fusarium sp.的抑菌圈效果圖Figure 7 Anti-fugni effect of the compound solution on Fusarium sp.

2.6 提取物有效抑菌物質

2.6.1 4 種茶提取物的有效物質含量

茶葉中的茶多酚具有抗氧化、抑菌抗炎等作用，且在水浸提液中含量較高[12]。由于加工工藝的不同，多酚類物質在加工過程中轉化，使得不同茶類多酚含量存在較大差異，故對4種茶類茶樣的水浸出物、多酚類、茶色素含量進行測定。從表2 可看出，尤溪綠茶和尤溪白茶的水浸出物和茶多酚含量均顯著高于尤溪烏龍茶和尤溪紅茶，而尤溪紅茶的茶紅素、茶褐素含量顯著高于尤溪烏龍茶（p＜ 0.05）。

表2 4 種茶樣中生化成分含量Table 2 Content of biochemical components in four types of tea samples %

2.6.2 優化配方的多酚含量

對篩選出的2 種抑菌效果較好配方WT ∶T ∶EOMA-2 和WT ∶C ∶T ∶EOMA-2（白茶含量分別為0.120 0 g 和0.066 6 g）的多酚含量測定結果（圖8）可看出，單劑白茶的多酚含量高于其余2 種復配方，經方差分析達顯著水平（p＜ 0.05）；其中，WT ∶T ∶EOMA-2 多酚含量高于WT ∶C ∶T ∶EOMA-2。

2.7 優化配方的抑菌穩定性

2.7.1 熱處理對優化配方抑菌穩定性的影響

將WT ∶T ∶EOMA-2 和WT ∶C ∶T ∶EOMA-2兩種優化配方分別在40℃、60℃和80℃下處理45 min，以未處理的優化配方為對照。結果表明，各優化配方在經過不同溫度處理后對S.aureus和E.coli幾乎無抑制效果；與對照組相比，抑菌效果下降明顯。

2.7.2 紫外線照射對優化配方抑菌穩定性的影響

將WT ∶T ∶EOMA-2 和WT ∶C ∶T ∶EOMA-2兩種優化配方分別置于紫外燈下分別照射10 min、20 min 和30 min，以未處理的優化配方為對照。結果（圖9）顯示，紫外照射30 min 優化配方WT ∶C ∶T ∶EOMA-2 對E.coli抑菌效果顯著下降（p＜ 0.05），WT∶T∶EOMA-2則不顯著。紫外照射對WT ∶T ∶EOMA-2 和WT ∶C ∶T ∶EOMA-2 抑制S.aureus的效果影響不顯著（p＜0.05）。

3 討論與結論

中醫認為茶葉具有消毒殺菌的作用，因此本試驗探討茶葉提取物對眼致病細菌（S.aureus和E.coli）及眼致病真菌（青霉菌和鐮刀菌）的抑制活性，分別測定了尤溪白茶、尤溪綠茶、尤溪紅茶和尤溪烏龍茶的抑菌圈直徑，并最終篩選出尤溪白茶作為復配液主要成分。在這4類（種）茶葉浸出液中，抗S.aureus和E.coli作用最強的為尤溪白茶和尤溪綠茶，然后為尤溪烏龍茶和尤溪紅茶。由于這4 種茶葉中尤溪白茶和尤溪綠茶的茶多酚含量較高，因此我們推測這些茶葉浸出物抑菌作用的主要成分可能為茶多酚，這與茶多酚在抗菌中有明顯作用相一致[19]。進一步地測定4種茶中茶多酚的結果表明，尤溪綠茶和尤溪白茶的多酚含量顯著高于尤溪烏龍茶和尤溪紅茶（p＜ 0.05）。白茶作為一種天然草本，具有抗視疲勞和抑菌抗炎的功效，且茶葉本身無論是內服還是外用（如干眼SPA中的霧化、熏蒸等）對人體的親和性表現較高，幾乎無副作用，故試驗各復配液均采用以白茶為主要成分（濃度最高）的方式進行復配。

本試驗初步篩選出抑菌能力較好且對眼睛與眼部皮膚親和性較高的5 種草本：尤溪白茶、菊花、蒲公英、互葉白千層精油和山茶油。尤溪白茶、菊花、蒲公英進行煎煮浸提，單劑提取液濃度分別為0.033 g·mL-1、0.1 g·mL-1和0.1 g·mL-1；盡管互葉白千層精油已被廣泛應用于眼貼或加熱眼罩，鑒于純高濃度互葉白千層精油在干眼SPA 霧化時對眼睛及眼部皮膚具有一定刺激性，本試驗選擇的是濃度為4%的互葉白千層精油稀釋液，山茶油亦同理，以保證對眼睛的親和性。再以尤溪白茶為主與其余4 種提取液按比例混合，得到4 種兩兩復配液（2 ∶1 和3 ∶1）、8 種三三復配液（2 ∶1 ∶1和3 ∶1 ∶1）、4 種四四復配液（2 ∶1 ∶1 ∶1 和3 ∶1 ∶1 ∶1）和2 種五五復配液（2 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1 和3 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1）。試驗加入了無菌水和30%乙醇為對照。結果方差分析表明，WT ∶T ∶EOMA-2和WT ∶C ∶T ∶EOMA-2 對眼科致病細菌（E.coli、S.aureus）的綜合抑制效果最好。其中WT ∶T ∶EOMA-2 表現最佳，對E.coli和S.aureus的抑菌圈直徑分別為15.4 mm 和14.5 mm，優于所有單劑的抑菌效果；WT ∶C ∶T ∶EOMA-2 的抑菌效果僅略低于單劑中的互葉白千層精油，考慮到干眼SPA 霧化熏蒸治療中高純互葉白千層精油會對眼睛與眼部皮膚產生一定的刺激性，因此在復配液中建議WT ∶C ∶T ∶EOMA-2，在保證抑菌抗炎療效的同時提高互葉白千層精油稀釋度以增強親和性。

所有復配液中WT ∶C ∶T-1 和WT ∶C ∶T-2 對S.aureus與E.coli的抑制能力最弱，且相比于各成分單劑其綜合抑菌能力顯著下降，可能與尤溪白茶在與菊花、蒲公英分別取一定體積復配后各自的質量濃度下降有關，因而引起復配液抑菌能力有所下降。另外，二二復配液、三三復配液與單一浸提液的抑菌效果比較顯示出尤溪白茶與菊花、蒲公英之間并無協同抑菌作用。WT ∶T ∶EOMA-2 和WT ∶C ∶T ∶EOMA-2 綜 合抑菌效果最優，盡管各配方中多酚含量顯著低于單劑白茶的茶多酚含量（p＜ 0.05），但與單劑對比抑菌效果有所增強或相當，可見復配液中的互葉白千層精油和山茶油與其他成分之間存在協同效應，且互葉白千層精油的增益效果更顯著?；ト~白千層精油與山茶油的有效抑菌成分尚待進一步測定。大多數復配液在互葉白千層精油的存在下均表現出良好的抑菌活性。綜上結果表明，復配液中的各種抑菌成分之間可能存在協同效應或者拮抗作用，并非所有效果較好的單一植物提取液在按比例混合后其抑菌活性能夠得到增強，在實際應用中仍需根據致病源的特性、各復配方的穩定性以及不同濃度下各草本提取液與人體的親和程度研制復合配方，并進行多次平行試驗，以確定其抑菌能力。

本試驗還探討了2 種優化配方WT ∶T ∶EOMA-2 和WT ∶C ∶T ∶EOMA-2 在 不 同 溫 度和紫外照射時間下的抑菌穩定性，結果表明各優化配方在40℃后抑菌效果顯著下降（p＜0.05），這可能與茶樹精油的易揮發性和耐熱性差[20]以及茶多酚對溫度非常敏感[21]等因素有關。因此，優化配方應當在低溫下保存。隨著紫外照射時間的變化，WT ∶T ∶EOMA-2和WT ∶C ∶T ∶EOMA-2 抑菌效果變化不顯著（p＜ 0.05），對紫外線照射的穩定性良好。

本試驗旨在為干眼SPA 霧化治療提供一種天然的草本復合配方，發揮其抑菌抗炎功效。有研究報道許多干眼病患者亦伴有螨蟲性瞼緣炎，致病原為皮脂螨和蠕形螨[4]，因此后期我們將對試驗中的復配液進行抑螨率的測定。