幾種環境因子對普通小球藻生長及磷利用率的影響

劉敏，于建霖，康會會，孔慶霞

（天津農學院 水產學院，天津 300392）

據悉，2016 年我國水產養殖產量達五千多萬噸，為全國水產總量的74.5%[1]。高密度養殖是中國主要養殖模式，過多的殘餌與糞便會導致養殖水域TN、TP、CODMn等偏高[2-4]，尾水處理問題急需解決，但水產養殖尾水污染程度較低且量大，很難有效處理[5]。氨氮、亞硝酸鹽、磷等污染物在水產養殖尾水中最為常見[6]。焦雋對江蘇省農村污水研究顯示，水產養殖產生的TN 污染占總污染的11.57%，而51.12%則來自TP[7]。養殖尾水中磷的來源主要是養殖戶投喂的飼料中雜帶的飼料添加劑及其分解物，還有一部分來自水生生物的排泄物[8]。其中可溶性磷會隨水體進入環境中，造成水體富營養化，破壞生態環境[9]。

普通小球藻（Chlorella vulgaris）隸屬于綠藻門、綠藻綱、綠球藻目、小球藻科、小球藻屬，細胞直徑2～10 μm，呈球形或橢圓形[10]，內含豐富活性代謝產物、脂質、微量元素和蛋白質等天然物質，對外部環境條件適應性較強[11]，具有保健和藥理方面的作用[12]，主要以氮磷營養鹽為營養物質，可以利用其進行污水凈化，改善環境[13]。

近年來利用普通小球藻處理養殖尾水，實施水體生物修復，成為養殖尾水處理技術的重點之一[14]。2017 年，SHEN 等[15]研究表明小球藻有利于含鹽廢水中氮磷營養鹽去除，并有助于小球藻油脂積累。本研究結果將有助于進一步加深對普通小球藻去除活性磷效果和途徑的認知，為普通小球藻在水產養殖尾水處理中的科學使用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源及預培養

小球藻取自天津農學院海洋漁業資源實驗室，培養基為f/2 培養基（硝酸鈉75 mg/L；磷酸二氫鈉5 mg/L；f/2 微量元素1 mL/L；f/2 維生素0.5 mL/L）。培養基配制完成在高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min，將藻液與培養基1∶1 混合后放入智能高級型人工氣候培養箱中進行培養，每天搖瓶2～3次，防止小球藻貼壁或者沉底，培養鹽度為30，培養溫度為25 ℃，光照強度為50 μmol/ （m2·s），光暗比為14 h∶10 h，相對濕度為38%，持續光照培養，試驗前取適量藻液，放入高速離心機離心10 min。

1.2 指標測試分析與計算方法

1.2.1 普通小球藻比生長率計算

其中Nt為第t天小球藻藻液吸光度；N0為某一時間間隔開始時小球藻藻液吸光度；Δt為時間間隔。

1.2.2 磷濃度測量

采用磷鉬藍分光光度法測量磷濃度。

1.2.3 鹽度測量

采用?，敼P式鹽度計測量海水鹽度。

1.2.4 pH 測量

采用PHBJ-260 便攜式pH 計對藻液的pH 進行測量。

1.2.5 葉綠素熒光參數測量

采用浮游植物分類熒光儀（PHYTO-PM WALZ）對葉綠素熒光各個參數進行測定。

Fv/Fm代表光合作用的最大光能轉化效率，Fv/F0代表光合作用潛在活力，ΦPSⅡ代表光合作用實際光能轉化效率。其公式如下：

1.2.6 吸附動力學計算

準一級模型多用來描述物理吸附過程，其動力學方程形式為：

準二級模型主要用于描述物理和復雜的化學吸附過程，其動力學方程形式為：

式中，qe和qt分別為平衡時和t時刻下的吸附率；k1為準一級吸附速率常數；k2為準二級吸附動力學速率常數。

1.2.7 數據分析

試驗數據均采用origin 2018 進行數據分析。用 SPSS 2.0 進行單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05 為差異顯著。

1.3 試驗方法

1.3.1 鹽度對普通小球藻生長的影響

設置不同鹽度梯度（0、5、10、15、20、25、30、45），取適量藻液稀釋至初始濃度為0.75×106個/mL，培養于100 mL 三角瓶中，設置兩個對照組，每個平行樣體積均為50 mL，確保每個錐形瓶的鹽度與藻初始濃度為設定值，每天人工定時搖3次并在波長為680 nm 下測量吸光度，計算其比生長速率。

1.3.2 鹽度對普通小球藻吸收磷的影響

設置不同初始磷濃度（0，5，10，15，20 mg/L），在鹽度為15、30，普通小球藻初始濃度為0.75×106個/mL，吸附反應溫度為25 ℃，pH 為7 的條件下進行培養，在培養過程中0、24、48、72、96 h取培養液，0.22 μm 的濾膜過濾后測磷的濃度。

1.3.3 鹽度對普通小球藻葉綠素熒光參數的影響

設置不同鹽度（0、15、30、45），在普通小球藻初始濃度為0.75×106個/mL，吸附反應溫度為 25 ℃，pH 為7 的條件下進行培養，在培養過程中0、24、48、72 h 取培養液，0.22 μm 的濾膜過濾后測磷的濃度。

1.3.4 藻密度對普通小球藻吸收磷的影響

設定藻液初始濃度OD680＝0.05、0.10、0.15（0.375×106個/mL、0.750×106個/mL、1.125×106個/mL），在磷濃度為5、20mg/L，吸附反應溫度為25 ℃，pH 為7 的條件下進行培養，在培養過程中0、24、48、72、96 h 取培養液，0.22 μm 的濾膜過濾后測磷的濃度。

1.3.5 初始pH 對普通小球藻吸附磷的影響

設定pH 值為5、7、9，在藻液初始濃度為0.75×106個/mL，磷濃度為5、20 mg/L，吸附反應溫度為25 ℃的條件下進行培養，在培養過程中0、24、48、72 h 取培養液，0.22 μm 的濾膜過濾后測磷的濃度。

1.3.6 吸附動力學分析

（1）24 h 吸附動力學分析

設定吸附反應條件為：吸附反應溫度為25 ℃，藻液初始濃度為0.75×106個/mL，磷濃度為5、20 mg/L，pH 為7。在此條件下進行培養，在1、2、4、8、12、18、24 h 取培養液，0.22 μm 的濾膜過濾后測磷的濃度。

（2）1 h 吸附動力學分析

在之前相同試驗條件下，在10、20、40、60 min取培養液，0.22 μm 的濾膜過濾后測磷的濃度。

2 結果與分析

2.1 普通小球藻細胞密度與吸光度曲線

本試驗用血球計數板在三目顯微鏡下計算普通小球藻細胞數，用紫外分光光度計在680 nm 波長下測定普通小球藻藻液吸光度，將藻密度與吸光度值進行回歸得線性回歸方程：y＝7.502x-0.003 6，（R2＝0.999 3）[16]。

2.2 鹽度對普通小球藻生長的影響

如圖1 所示，無鹽度組（0）和高鹽度組（45）小球藻生長受到明顯的抑制作用，培養四天后會出現部分小球藻死亡現象，兩試驗組之間差異顯著（P＜0.05）。其他鹽度組，小球藻生長較好，且無顯著差異（P＞0.05）。經過4 d 培養15 鹽度組小球藻藻液吸光度最高，可達0.884。

圖1 鹽度對普通小球藻生長的影響

陳貞奮等[17]研究表明小球藻（Chlorella vulgaris Beijerinck）在5～15 鹽度水域生長最適，適鹽能力較強，張奇等[18]研究發現小球藻（Chlorella vulgaris）具較廣的適鹽能力，可在0～45 鹽度海水中生長。對比本試驗結果，普通小球藻最適生長鹽度為5～30，較高較低鹽度對普通小球藻生長呈現的抑制作用大同小異。在淡水環境中，生長抑制作用更明顯，說明經過一定時間培養，普通小球藻鹽度適應能力變強，起到了鹽度馴化的作用。鹽度變化可以破壞藻細胞內外離子平衡，影響其滲透壓從而影響藻細胞生長，因此試驗中會出現隨著鹽度升高藻細胞生長受到抑制的現象。

2.3 鹽度對普通小球藻吸收磷的影響

本試驗基于2.2 試驗結論選取培養結束時小球藻藻液吸光度最大的鹽度值（15）與原培養基鹽度值（30）做對照，進行磷吸附效率研究。

如圖2 所示，24 h 內15 鹽度組在初始磷濃度為5 mg/L 時吸收速率較其他試驗組更快，且差異顯著（p＜0.05），其吸附效率高達91.80%，48 h時各濃度組吸附效率均達到95%以上，此時基本達到吸附平衡。兩鹽度組相比，15 鹽度組24 h 內對磷的吸附效率較高，48 h 后30 鹽度組對磷的吸附效率較高，小球藻對磷的利用更完全。研究表明，伴隨鹽度升高，不僅小球藻生長會受到影響，小球藻對營養鹽吸收也會受到抑制[19]。本試驗結果顯示，短時間內鹽度為15 時普通小球藻對磷吸收更快。

圖2 鹽度對普通小球藻吸收磷的影響

2.4 鹽度對普通小球藻葉綠素熒光參數影響

小球藻潛在活力強可反映其光合作用較強[20]。光合色素是微藻光合作用的有效色素，能較好地反映微藻生長狀況和光合作用效率[21]。

由圖3、圖4 可知，隨著時間增長，Fv/Fm、ΦPSII、Fv/F0顯著升高，48 h 達到最大值后有略微下降趨勢，經72 h 培養，30 鹽度組Fv/Fm、Fv/F0最強，15鹽度組ΦPSII最高，0 鹽度組各參數在24 h 內明顯提升后呈直線下降趨勢，隨著鹽度增長葉綠素a含量呈先升后降趨勢。

圖3 鹽度對普通小球藻葉綠素熒光參數的影響

圖4 鹽度對普通小球藻葉綠素熒光參數影響

小球藻生活環境會影響其生長，在受到脅迫時會發生顯著變化[22]。鹽度脅迫是影響植物光合作用的主要環境因子之一，目前已有許多關于鹽度脅迫對植物光合作用影響的研究。在受脅迫時，植物Fv/Fm會降低，所以測量Fv/Fm成為一種簡單快速脅迫監測方法，ΦPSⅡ為光合作用實際光能轉化效率，可反映電子傳遞情況。研究發現過高過低鹽度條件下，鹽生杜氏藻PSII 葉綠素熒光參數均會顯著降低。本試驗中普通小球藻在高鹽（45）條件下葉綠素熒光參數沒有顯著降低，相反在低鹽（0）條件下，普通小球藻葉綠素熒光參數顯著降低，說明普通小球藻有一定的耐鹽性且不適宜在鹽度較低條件下生長，這一優勢為其更好的適應與調節海水水質提供了依據。葉綠素a 與小球藻光合作用密切相關，可以通過色素含量來判斷小球藻生理狀態[23]，朱新廣等[24]研究表明，鹽度脅迫會降低葉綠素含量，抑制電子傳遞效率以及光能轉化效率，與本試驗結果相符。

2.5 不同藻密度對普通小球藻吸收磷的影響

小球藻密度的多少會影響其對磷的吸附效能，密度太小，不能有效吸收水體中的磷，密度太大會造成資源浪費，為降低成本，提高利用率，并有效去除水體中多余的磷，本試驗探究了藻密度對小球藻吸附效能的影響。如圖5 所示，在初始磷濃度不同的情況下，培養液中磷濃度變化趨勢總體是一致的，都呈下降趨勢，當藻液濃度適中（OD680＝0.1），96 h 后磷吸附效率可達99.49%。

圖5 初始pH 對普通小球藻吸附磷的影響

JAYAKUMA 等[25]研究顯示，藻濃度到達一定值時，吸附效率不會隨著藻濃度增加而增加。孫輝[26]研究顯示，隨著小球藻密度增加，其對鎘的吸附效率不斷增大，但吸附量會減少，較高密度會導致有效吸附表面積減少。

2.6 初始pH 對普通小球藻吸附磷的影響

由圖6、圖7 可知，pH 值對小球藻吸附效率影響不顯著，對小球藻生長影響顯著，表現為各pH 組磷吸附效率總體呈下降趨勢，低pH 值時小球藻生長受到明顯抑制作用。經過72 h 培養后，磷濃度可由20.000 mg/L 降至2.359 mg/L，pH＝7試驗組小球藻密度可達到初始密度的6.07 倍。

圖6 初始pH 對普通小球藻吸附磷的影響

圖7 初始pH 對普通小球藻生長的影響

由表1 可以看出，不管藻液初始pH 為多少，吸附72 h 后pH 值都穩定在一個范圍內，初始pH較小組，培養結束pH 值明顯升高，pH 值較大組，培養結束pH 值會減小。張奇等[18]研究表明，在pH 為5.5～11.5 環境中小球藻都能生長，且在pH＝9 時生長量達到最大，與本試驗結果吻合，pH 通過改變普通小球藻滲透壓來改變其生長及對營養鹽的吸收，在一定范圍內隨著pH 增加，普通小球藻生長加快，可有效提高其對磷濃度的吸附效率。研究表明，當溶液pH 呈酸性時，會導致藻細胞有機物流失，不利于其生長，與本研究結果偏堿性環境下更有利于普通小球藻生長一致。

表1 不同磷濃度下藻液吸附72 h 后pH 值變化情況

2.7 吸附動力學分析

由圖8～圖11 可見，磷初始濃度為5 mg/L，吸附1 h 后，吸附效率達到61%，2 h 后，吸附效率達到81%，24 h 后，吸附效率達99%，與72 h吸附效率相差不大，此階段屬于快速吸附階段；磷初始濃度為20 mg/L 時，1 h 后吸附效率達到80%，24 h 后，吸附效率達83%，吸附效率超過80%，說明經過24 h 吸附已基本達到吸附平衡。

圖8 24 h 內普通小球藻對磷吸附

圖9 1 h 內普通小球藻對磷吸附

采用準一級動力學、準二級動力學模型對動力學數據進行擬合以更好地解釋小球藻對磷的吸附過程。由圖10 可以看出磷初始濃度為5 mg/L時，吸附1 h，R2＝0.999 82。由圖11 可見磷初始濃度為20 mg/L 時，吸附1 h，R2＝0.999 99，通過計算得出小球藻對磷的吸附更適合準一級動力學模型[27-28]。

圖10 普通小球藻對磷吸附動力學曲線

圖11 普通小球藻對磷吸附動力學曲線

生物吸附通?？煞譃槲锢砦胶突瘜W吸附，兩者可共同作用，要想知道是物理吸附還是化學吸附，必須對其進行深入分析，通過動力學模型對試驗數據進行擬合，確定其吸附類型，探討其吸附機理。正常情況下，藻類生物吸附劑的吸附可以分為三個階段，第一階段為快速吸附期，這一階段內吸附效率較快基本可以達到吸附平衡，李英敏等[29]研究小球藻對Cu2+的吸附性能及動力學結果顯示，在吸附起始階段，吸附效率較快。李英敏等[30]還研究表明，小球藻對鉛吸附10 min內可以達到較大值。李悅[31]研究表明小球藻對鈾的吸附過程符合擬二級動力學方程，吸附效率前5 min 可達90%左右，與本試驗結果吸附起始階段24 h 內普通小球藻對磷的吸附效率較高（超過80%）吻合。

3 結論

通過不同鹽度對普通小球藻生長及磷利用率的探究，可得如下結論，高鹽度（45）和低鹽度（0）對普通小球藻生長均有抑制作用，5～30 鹽度之間普通小球藻能較好生長，最適生長鹽度為15，鹽脅迫會抑制普通小球藻光合作用，降低其光能轉化效率，不利于其對磷吸收；在藻密度為0.75×106個/mL，pH為7 時普通小球藻生長較好，對磷的吸附效率較高，1 h 內為快速吸附期。綜上所述，普通小球藻在鹽度15、pH 為7 和藻密度為0.75×106個/mL 時，生長最快，光合活性最強，且磷吸附效率最高。本試驗初步探明了不同鹽度下普通小球藻吸附磷的最佳條件，為利用普通小球藻處理養殖尾水提供了理論依據。