NAA+IBA 對圓齒野鴉椿插穗生根過程的影響

張博倫，喻蘇琴，姜雪茹，涂淑萍

（江西農業大學 林學院，江西 南昌 330045）

圓齒野鴉椿Euscaphiskonishii為省沽油科Staphyleaceae 野鴉椿屬Euscaphis常綠小喬木，是我國特有藥賞兼用優良鄉土樹種，其葉片、枝條等部位的提取物有消炎抑菌、抗腫瘤的作用[1]。該樹種結果量大，果皮紅艷、形態優美，且掛果期可長達6 個月以上，滿樹紅果頗為壯觀，是極具開發潛力的秋、冬、春三季觀果樹種。目前，該樹種主要采用種子繁殖，因其種子具有深休眠特性[2]，且發芽率低，實生苗性狀良莠不齊，使其推廣應用受到一定的影響。因此，大力推廣無性繁殖，培育無性系優良品種勢在必行。但該樹種組培繁殖體系尚不健全，其污染率極高[3]；嫁接繁殖技術繁雜，夏秋季嫁接成活率較低[4]；而扦插繁殖具有操作簡單、成苗速度快、繁殖系數高等特點[5]。有研究表明，從圓齒野鴉椿成年樹上剪穗扦插成活率普遍較低[6]，且其生根速度緩慢。因此，研究圓齒野鴉椿扦插過程中不定根的形成及其酶活性和內源激素含量的變化，初步掌握影響其插穗生根的機理，對提高圓齒野鴉椿的扦插繁殖效率具有重要意義。大量研究表明，在扦插生根進程中，插穗皮層內的過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和吲哚乙酸氧化酶（IAAO）等3 種氧化酶活性，內源激素含量及其比例的動態變化共同調控著插穗不定根發生過程[7]。目前，已有學者對圓齒野鴉椿扦插生根的影響因素進行了研究，但對其扦插生根機理方面的研究甚少，尚未見其扦插生根進程中相關酶活性和內源激素含量變化的研究報道。本試驗旨在研究NAA+IBA對圓齒野鴉椿插穗生根及其韌皮部3 種氧化酶（POD、PPO、IAAO）活性和4 種內源激素（IAA、ABA、GA3、ZR）的含量及其比例的動態變化的影響，分析上述氧化酶及內源激素與插穗生根之間的關系，以期為圓齒野鴉椿扦插繁殖提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于江西農業大學花卉盆景實訓基地（115°50′28″E，28°45′41″N）。扦插池設在四周開敞的防雨棚內，棚高2.5 m，其上覆蓋透光遮雨板，苗床為東西走向，長3 ～4 m，寬1 ～1.2 m，高40 cm，底部抬高1 m。扦插池底部鋪厚10 cm 左右小石塊便于排水，其上鋪設基質進行扦插，苗床上搭有60 cm 高的拱棚并覆蓋塑料薄膜和遮光度50%的遮陽網。

1.2 試驗材料

選擇5 年生、健壯、無嚴重病蟲害的圓齒野鴉椿為采穗母樹，于2022 年3 月8 日，剪取樹冠中上部的一年生枝條，并將枝條制備為長10 ～12 cm的穗條，要求至少保留2 個芽和2 枚小葉。

生長調節劑選用課題組前期研究篩選出的對圓齒野鴉椿扦插生根效果最好的150 mg/LNAA+150 mg/LIBA 混合溶液。

1.3 試驗方法

將剪好的插穗30 根一捆綁扎好，并分成兩組分別進行處理。處理I：將插穗放入150 mg/L 的α-萘乙酸（NAA）與150 mg/L 吲哚乙酸（IBA）的溶液中浸泡2 h；處理II：將插穗放入清水中浸泡2 h 作為對照（CK）。每個處理90 根插穗，重復3 次。處理后的插穗插入粒徑為3 ～6 mm 的蛭石中，扦插深度6 ～7 cm。

插穗處理結束后進行第一次取樣，扦插后每隔15 d 取樣1 次，共取樣6 次。每次每個處理取插穗12 根，重復3 次。插穗取出后立即用蒸餾水沖洗干凈，迅速觀察記載插穗的形態變化及生根狀況，并用濾紙擦干放入冰盒中帶回實驗室，用刀片剝取插穗基部長2 cm 內的皮層，剪碎混勻，用錫箔紙包好，放入液氮罐速凍后，置-80℃超低溫冰箱保存備用。

1.3.1 插穗生根過程的形態觀測

插穗插入基質后，每次取樣后立即觀察記錄插穗的形態變化及生根狀況。

1.3.2 插穗基部皮層內氧化酶活性及內源激素含量的測定

過氧化物酶（POD）活性采用愈創木酚法試劑盒進行測定；多酚氧化酶（PPO）活性采用鄰苯二酚法試劑盒進行測定；吲哚乙酸氧化酶（IAAO）采用比色法試劑盒進行測定。以上試劑盒均由蘇州科銘公司生產。

內源激素吲哚乙酸（IAA）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA3）、玉米素核苷（ZR）含量由中國農業大學化控中心采用酶聯免疫吸附法（ELISA）進行測定。

1.4 數據處理

利用Excel 2021 軟件對試驗數據進行整理，利用SPSS 19.0軟件進行差異顯著分析（Duncan法）和皮爾遜（Pearson）相關性分析，利用OriginPro 2021 軟件進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 NAA+IBA 處理對圓齒野鴉椿扦插生根進程的影響

對圓齒野鴉椿插穗生根過程的外部形態觀察，發現圓齒野鴉椿插穗生根類型以愈傷組織生根型為主，亦存在少量皮部生根型和混合生根型。說明圓齒野鴉椿屬于扦插生根較困難的樹種。

由表1 與圖1 可知，扦插后第15 天，處理I（150 mg/L NAA+150 mg/L IBA）插穗皮孔膨大，并形成凸起的顆粒狀（圖1A），且有13.8%的插穗在基部莖節附近出現白色絮狀物（愈傷組織），而處理II（CK）插穗的愈傷組織形成率仍為0。扦插后第30 天時，插穗上形成的愈傷組織增多（圖1B），處理I 愈傷組織形成率達69.4%，而處理II 的愈傷組織形成率僅為28.8%。扦插后第45 天，處理I 愈傷組織形成率達100%，且有2.7%的插穗出現不定根（圖1C）；而處理II 此時的愈傷組織形成率僅為44%。扦插后第60 天，處理I插穗生根率達72.2%，而處理II 愈傷組織形成率達100%，但生根率仍為0。扦插后第75 天時，處理I 插穗生根率已達100%，并出現二級根（圖1D）；而處理II 插穗生根率僅為51.4%。由此可見，圓齒野鴉椿插穗采用150 mg/LNAA+150 mg/LIBA混合液浸泡其基部2 h 后，可以促進插穗愈傷組織和不定根的形成，與對照相比愈傷組織形成時間可提早15 d 左右，而不定根的形成時間可提早30 d 左右。

圖1 圓齒野鴉椿扦插生根過程中插穗的形態變化Fig. 1 Morphological characteristics changes in rooting process of E. konishii cuttings

表1 不同處理圓齒野鴉椿插穗各取樣時期愈傷組織形成率及生根率的比較Table 1 Comparison of callus formation rate and rooting rate of E. konishii cuttings by sampling period in different periods of different treatments

2.2 NAA+IBA 對圓齒野鴉椿扦插生根過程中插穗氧化酶活性變化的影響

由圖2A—B 可知，扦插第0 天，處理I（150 mg/L NAA+150 mg/L IBA） 和處理II（CK） 相比，插穗POD 和PPO 活性顯著升高。在扦插生根過程中，兩個處理插穗POD、PPO 活性的變化趨勢一致，均表現為“先升后降”，且扦插后0 ～30 d，插穗POD、PPO 活性處理I（150 mg/L NAA+150 mg/L IBA）均顯著高于處理II（CK），處理I 于扦插后第15 天時達高峰值，而處理II 于45 d 時達高峰值?？梢?，提高插穗POD和PPO 活性可促進其愈傷組織及根原基的形成；而在不定根形成過程中，POD 和PPO 活性下降。

圖2 不同處理圓齒野鴉椿扦插生根過程中插穗韌皮部3 種氧化酶活性的變化Fig. 2 Changes of three oxidase activity in phloem during cuttings rooting of E. konishii with different treatments

由圖2C 可知，扦插第0 天，插穗IAAO 活性處理I 顯著低于處理II，從扦插后15 ～60 d，處理I 和處理II 插穗IAAO 活性差異均不顯著，此后，兩個處理插穗IAAO 活性均顯著下降，至扦插第75 天時，處理1 顯著高于處理II?？梢?，插穗經150 mg/L NAA+150 mg/L IBA 處理后可顯著降低其IAAO 活性，抑制IAA 的降解，維持插穗中較高的IAA 含量，從而促進愈傷組織和根原基的形成。

2.3 NAA+IBA 對圓齒野鴉椿扦插生根過程中插穗內源激素含量及其比值變化的影響

2.3.1 對生長素（IAA）含量變化的影響

由圖3A 可知，在扦插第0 天，插穗IAA 含量處理I（150 mg/L NAA+150 mg/L IBA）為60.93 ng/g，顯著高于處理II（CK）17.66 ng/g；而且在扦插生根過程中，IAA 含量處理I（150 mg/L NAA+150 mg/L IBA）均顯著高于處理II（CK），其變化趨勢表現為“先降后升”，但處理II（CK）IAA 含量的變化幅度小于處理I。說明圓齒野鴉椿插穗經生長調節劑處理后可顯著提高其生長素（IAA）含量，從而促進愈傷組織和不定根的形成。

圖3 不同處理圓齒野鴉椿扦插生根過程中內源激素含量變化Fig. 3 Change of endogenous hormone content in E. konishii cuttings during adventitious root formation with different treatments

2.3.2 對脫落酸（ABA）含量變化的影響

由圖3B 可知，在扦插0 ～15 d，插穗脫落酸（ABA）含量處理I（150 mg/L NAA+150 mg/L IBA）均顯著高于處理II（CK），可能是ABA 含量的升高能夠增加插穗的抗性，降低切口感染帶來的影響，有利于愈傷組織的形成。扦插后30 ～45 d，兩個處理插穗ABA 含量相近，扦插第45 天后，處理II ABA 含量快速上升，至扦插后第60 天開始，ABA 含量處理II 顯著高于處理I。說明ABA 含量的降低有助于圓齒野鴉椿插穗不定根的生長。

2.3.3 對赤霉素（GA3）含量變化的影響

由圖3C 可知， 扦插后0 ～15 d， 處理I（150 mg/L NAA+150 mg/L IBA）插穗GA3含量變化不顯著，而處理II（CK）插穗GA3含量顯著增加。45 ～75 d，處理Ⅰ插穗GA3含量均顯著低于處理Ⅱ，說明GA3含量的降低有利于不定根的伸長。在整個扦插生根進程中除扦插第0 天插穗GA3含量處理I（150 mg/L NAA+150 mg/L IBA）顯著高于處理II（CK）之外，其他各個時期插穗GA3含量處理II 均高于處理I，這表明經過生長調節劑處理的插穗能提高體內GA3的含量，而在生根進程中降低插穗體內GA3含量，有利于促進插穗生根。

2.3.4 對玉米素核苷（ZR）含量變化的影響

由圖3D 可知，扦插0 ～15 d，兩個處理之間插穗ZR 含量相近，且變化均不顯著。此后，處理II 插穗ZR 含量顯著降低，從扦插第15 天后其含量除第60 天外，均顯著低于處理I。

2.3.5 NAA+IBA 對圓齒野鴉椿扦插生根過程中插穗內源激素比值變化的影響

由圖4可知，插穗中IAA/ABA、IAA/GA3和IAA/ZR 在整個扦插生根過程中處理I（150 mg/L NAA+150 mg/L IBA）均顯著高于處理II（CK）；且處理I（150 mg/L NAA+150 mg/L IBA）插穗IAA 與ABA、GA3、ZR 的比值均以扦插第0 天時為最高，除IAA/ABA 與扦插后第75 天相比差異不顯著外，其他均達顯著水平?？梢?，提高IAA 與ABA、GA3、ZR 的比值有利于促進插穗愈傷組織和不定根的形成和生長。

圖4 圓齒野鴉椿扦插生根過程種內源激素含量比值變化Fig. 4 Change of endogenous hormone content ratio in E. konishii cuttings during adventitious root formation

2.4 圓齒野鴉椿插穗生根的生理生化指標主成分分析

對圓齒野鴉椿扦插生根過程中的7 個生理生化指標進行主成分分析，計算其特征值的方差貢獻率和累計貢獻率，并根據主成分的特征值大于1的原則提取主成分。共取得2 個主成分（表2），其對應方差貢獻率分別為45.095%和32.050%，累計已達77.143%，基本包含了所測指標的全部信息。故本研究共取2 個主成分y1、y2，其余主成分可以忽略不計。2 個主成分的表達式分別為：

表2 各指標主成分的特征向量和累積貢獻率Table 2 The feature vector and cumulative contribution coefficient of the main components of the index

y1=0.38x1+0.40x2+0.44x3+0.20x4+0.39x5+0.33x6+0.45x7。

y2=-0.37x1+0.23x2+0.20x3+0.59x4-0.44x5-0.37x6+0.31x7。

載荷系數反映各主成分的相關性，數值分布在-1 ～1，且其絕對值越接近1，表明該物質與該主成分的相關性越強。由表3 可知，第一主成分的指標主要為ZR(0.799)、IAAO（0.783）、PPO(0.712)、ABA(0.694)、POD(0.668)，第二主成分的指標主要為IAA(0.88)。

表3 主成分得分和綜合得分?Table 3 Comprehensive evaluation scores

把每個原始指標進行標準化后的數據代入上述2 個主成分方程中，可以得到圓齒野鴉椿對應的2 個主成分得分；再以2 個主成分方差貢獻率占2 個主成分總方差累計貢獻率的比率為權重計算綜合得分，從而得到基于主成分分析法的圓齒野鴉椿扦插生根評價模型，即加權值計算公式為；

z=0.451y1+0.321y2。

從表3 可以看出，在處理I（150 mg/L NAA+150 mg/L IBA）與處理Ⅱ（CK）的第一主成分得分、第二主成分得分及綜合主成分得分的對比中，處理I 的得分均高于處理Ⅱ，說明NAA+IBA 可提高圓齒野鴉椿扦插生根率。

3 討 論

3.1 3 種氧化酶活性與圓齒野鴉椿插穗生根的關系

在植物的生長、發育過程中，酶發揮著重要的作用，其中酶的活性與不定根的發生有著密切的關系，目前對酶的研究主要集中在POD、PPO、IAAO 與扦插生根的關系[8]。過氧化物酶POD 參與生長素代謝、酚類物質合成以及細胞壁木質化[9]，郝愛麗等[10]發現高活性的POD 有助于插穗不定根的誘導，同時也有研究表明[11]，POD 作用的某些產物可能是不定根發生和發展所需要的輔助因子，能促進不定根的生成。在本試驗中，圓齒野鴉椿插穗POD 在愈傷組織形成時升高至峰值后持續下降，僅出現一個高峰，這與難生根樹種插穗的變化規律相一致[12]。有研究表明，活性升高的POD 能夠加快插穗愈傷組織的形成以及維管束分生組織的形成[9]，在不定根伸長生長期POD 活性下降則能夠有利于積累插穗內部IAA,從而促進細胞分裂和根系伸長，POD 可能是圓齒野鴉椿插穗生根的關鍵酶，150 mg/L NAA+150 mg/L IBA 生長調節劑處理能夠明顯提高POD 活性。

多酚氧化酶（PPO）是一種含銅的酶，可催化酚類物質與IAA 縮合而形成一種生根輔助因子“IAA-酚酸復合物”，加速生長素的代謝，能大幅度提高扦插生根率[13]。Rout[14]發現在山茶的不定根誘導期，PPO 的活性上升明顯。在本試驗中，圓齒野鴉椿插穗的PPO 活性變化規律與POD 相類似，在愈傷組織形成時保持較高的水平，這有助于產生與生根相關的輔助因子，有利于根系發育突破表皮，當不定根生長伸長時，插穗體內酚類物質開始減少，PPO 活性開始下降，此時有利于不定根伸長。這與張錦春等[12]的研究結果一致。本試驗表明，與對照組相比，經150 mg/L NAA+150 mg/L IBA 混合溶液浸泡2 h 處理的插穗，PPO活性顯著升高，且其活性上升速度快，峰值出現早。從外部形態觀察，經生長調節劑處理的插穗生根時間比對照組提前了30 d 左右，說明高活性的PPO 能夠促進插穗生根。

吲哚乙酸氧化酶（IAAO）可以分解IAA，通過調節IAA 的含量來影響植物根系的發生。在本試驗中，經150 mg/L NAA+150 mg/L IBA 生長調節劑處理的插穗在第0 天時IAAO 活性顯著低于對照組，且扦插后處理組與對照組IAAO 活性均呈現下降趨勢，低活性的IAAO 只能夠氧化少量的IAA，有研究認為，當IAAO 活性降低時，其降解IAA 能力弱，能使大量的IAA 輸送到插穗基部，從而有利于根原基的誘導[15]，這與本研究結果一致。但也有一些研究表明，低活性的IAAO有助于插穗愈傷組織的形成，高活性的IAAO 有助于插穗不定根的形成和伸長生長[16]，因此IAAO對不定根的影響可能因樹種而異。

3.2 內源激素與圓齒野鴉椿插穗生根的關系

生長素IAA 在插穗生根過程中的作用已經被眾多學者從多個角度論證，認為IAA 是促進不定根發生的主要激素[13]，對不定根的形成有明顯在促進作用[5]。IAA 促進生根的作用機理主要為其作用于非常敏感的形成層等幼嫩部位的分生組織細胞，引起細胞分化和分裂，形成根原始細胞，影響再生初期蛋白質合成的數量和質量[17]，甚至有研究認為扦插生根的難易程度主要取決于IAA 的含量[18]。在本試驗中，150 mg/L NAA+150 mg/L IBA生長調節劑處理能使插穗體內進行高濃度的IAA含量積累，隨著插穗皮孔開裂、愈傷組織形成及根原基的形成，插穗IAA 含量逐漸降至最低值，隨著不定根的生長又逐漸升高。說明愈傷組織與根原基的形成需要消耗大量的IAA，而高濃度的IAA 積累有助于其對根原基的誘導，這與劉國彬等[19]的研究結果一致。對照組由于缺少NAA+IBA 的調節，插穗內的IAA 含量始低于處理組。

脫落酸ABA 是天然的植物抑制性激素，通常被認為是植物生根抑制劑，許多研究都表明高含量的ABA 能夠抑制插穗內根原基的誘導分化從而不利于插穗不定根的發生[20-21]。在本試驗中，ABA 的含量在前期總體呈現上升趨勢，ABA 含量的增加有助于增加插穗的抗逆性，降低切口機械損傷的影響[5]；之后在根原基本誘導及不定根伸長時ABA 含量持續下降，且150 mg/L NAA+150 mg/L IBA 混合溶液處理組插穗的ABA 含量明顯低于對照組，說明150 mg/L NAA+150 mg/L IBA混合溶液處理能夠有效的抑制插穗ABA 的合成，張帆等[22]認為ABA 含量降低有助于插穗內淀粉水解為糖，也有利于根原基的形成。

赤霉素GA3的主要生理功能是加速細胞的分裂和伸長生長速度，同時也能影響插穗的生根，如李朝嬋等[23]發現赤霉素GA3的升高有助于插穗愈傷組織的形成和不定根的誘導。同時有研究認為赤霉素可以促進植物不定根的發生，但大多數研究認為赤霉素是不定根形成的抑制物，赤霉素通過抑制形成根原基細胞的分裂或阻礙生長素誘導不定根發育這兩條途徑來抑制根系的形成[24]。在本試驗中，圓齒野鴉椿插穗經150 mg/L NAA+150 mg/L IBA 混合溶液處理后，GA3含量在根原基誘導和不定根伸長時持續下降，表明高含量的GA3會抑制圓齒野鴉椿根原基的形成及根系的伸長，這與李永欣等[25]的研究結果一致。對照組插穗的GA3含量較處理組一直處于較高濃度，而處理組插穗的生根率優于對照組，這也印證了GA3含量高會抑制插穗生根的觀點。

玉米素核苷ZR屬于細胞分裂素CTK的一種，其生理功能主要是促進細胞分裂，誘導芽的形成以及芽的生長，細胞分裂素主要存在于進行細胞分裂的部位，如莖尖、根尖等[26]。有研究發現CTK 水平較高時，能促進細胞分化進而有利于不定根生成[27]，也有研究表明CTK 濃度高會抑制生根[25]，而濃度低時才有助于根原基的誘導以及不定根的生長[28]，在本試驗中，經過150 mg/L NAA+150 mg/L IBA 混合溶液處理過的插穗ZR 值在初期有所升高，可能是為了提高插穗抗逆性，之后持續降低，這表明低濃度ZR 有利于圓齒野鴉椿插穗根原基的形成以及不定根的伸長。這與袁利利等[29]得出的高濃度ZR 值能促進不定根伸長的結論相反，究其原因可能是因為樹種不同。

內源激素對植物插穗生根過程中的調控是一個復雜而精細的過程，不是單一的激素的含量變化對根系產生作用，而是多種激素相互協同、制約的過程，多種激素的互相作用是調控生根的關鍵[30]。有研究認為，IAA/ABA、IAA/ZR 的比值高有益于插穗生根，但不同樹種對于激素間比值的反應敏感度并不相同[31]。在本試驗中，經過150 mg/L NAA+150 mg/L IBA 混合溶液處理過的插穗IAA/ABA值在整個生根階段均高于對照組，說明高比值的IAA/ABA 有利于圓齒野鴉椿插穗生根；IAA/ABA值在愈傷組織形成時下降至0.5，在不定根生成時維持在0.5 左右，說明此時有助于愈傷組織形成及根原基誘導，之后IAA/ABA 比值上升有助于圓齒野鴉椿不定根伸長生長。有研究表明，IAA/ZR對生根同樣有影響作用[32]。在本實驗中，處理組IAA/ZR 值與IAA/ABA 值相類似，在整個生根階段均顯著高于對照組，在愈傷組織生成時下降，在不定根生長時比值上升。處理組IAA/GA3在愈傷組織形成后迅速下降，以促進不定根的誘導。在整個生根過程中，IAA/ZR 比值均大于5，IAA/GA3比值均大于10，說明插穗內源激素IAA 含量高于ZR 含量及GA3含量時有助于不定根的形成。但處理組與對照組IAA/ABA 值均小于1，這可能是圓齒野鴉椿插穗生根率低的主要原因。

本研究對扦插過程中插穗的外觀形態變化進行了描述，統計了插穗生根類型，并對扦插生根進程中的相關酶活性及內源激素含量進行了測定分析，但并未對影響扦插生根進程中其他種生理生化指標如營養物質（可溶性蛋白、淀粉、可溶性糖）、酚類化合物含量進行測定，下一步有必要對其生根過程的解剖結構進行觀察，以便準確劃分插穗的生根階段，并揭示不同生根階段與各類生理生化指標變化之間的關系。

4 結 論

本研究可以得出以下結論：1）150 mg/L NAA+150 mg/L IBA 混合溶液浸泡插穗基部2 h，對圓齒野鴉椿插穗生根具有明顯的促進效果。2）圓齒野鴉椿插穗生根類型主要為愈傷組織生根型，少量為皮部生根型和混合生根型。3）采用150 mg/L NAA+150 mg/L IBA 混合溶液處理插穗基部2 h，可以提高插穗基部皮層內POD 和PPO活性，降低IAAO 活性，以及提高IAA 含量及其與ABA、GA3、ZR 的比值，從而促進圓齒野鴉椿插穗愈傷組織和不定根的形成。