牡蠣諾如病毒受體類Lewis 抗原合成相關基因CgFUT5 的克隆與表達鑒定

桂彬彬，曲 夢，張蔚然,3，李明玉,4，江艷華，姚 琳，王聯珠

1.中國水產科學研究院黃海水產研究所/農業農村部水產品質量安全檢測與評價重點實驗室，山東 青島 266071

2.大連工業大學 食品學院，遼寧 大連 116034

3.上海海洋大學 食品學院，上海 201306

4.中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島 266003

諾如病毒是人類所有年齡組急性腸胃炎散發和暴發的重要原因[1-3]，具有高度傳染性，10～100 個病毒顆粒即可引發感染[3]。在進入人體后，諾如病毒會特異性地與腸道中的附著因子結合，導致胃腸炎[4]。組織血型抗原 (Histoblood group antigcns,HBGAs) 已被確定為多種諾如病毒毒株的附著因子[5]。作為一種濾食性雙殼軟體動物，在被病毒污染的水體中，牡蠣體內的諾如病毒含量比環境中的高100 倍，病毒進入其體內難以被清除[6-7]，因此牡蠣被認為是諾如病毒的重要傳播媒介[8]。多項研究指出，諾如病毒在牡蠣中的富集是由于其能與牡蠣消化道中的碳水化合物特異性結合，而這些碳水化合物具有類似于人類HBGAs 的結構[9-11]。因此，有理由假設牡蠣中可能存在與人HBGAs相似的合成途徑和關鍵基因。

Lewis 抗原作為HBGAs 的一種，已經在微生物黏附和癌癥轉移等領域得到了深入研究[12-16]，Lewis 抗原在多種糖基轉移酶依次催化下合成[17]，根據不同巖藻糖基轉移酶的底物特異性，將巖藻糖從GDP-巖藻糖轉移至不同的前體寡糖上，產生不同類型的Lewis 抗原。在人類基因組中，FUT5基因的轉錄產物是合成Lewis 抗原的糖基轉移酶之一，屬于α-1,3/4-巖藻糖基轉移酶 (α-1,3/4 fucosyl transferases,α-1,3/4 Fuc Ts)[18]，同屬于這一類糖基轉移酶的還有FUT3、FUT4、FUT6、FUT7、FUT9、FUT10 和FUT11[19-20]。FUT5 偏好于在二型前體的基礎上合成LeX和sLeX抗原，也有研究表明FUT5 還參與合成Lea、Leb和sLea抗原[21]。Lewis 抗原在諾如病毒結合過程中起重要作用，這些經巖藻糖基化產生的碳水化合物可以和人A/H 型HBGAs 抗原在結合諾如病毒時產生競爭性抑制[22]，在對牡蠣類HBGAs 的研究中也有類似發現[23]。

目前已經證實牡蠣中存在Lewis 抗原，種類包括Lea、Leb、LeX和LeY等[24]，然而未見具體合成途徑及關鍵基因的研究。本研究克隆了太平洋牡蠣 (Crassostreagigas)FUT5基因，通過熒光定量法檢測了太平洋牡蠣各組織中FUT5基因的表達量，探討太平洋牡蠣FUT5基因的組織表達差異性，旨在為牡蠣富集諾如病毒的分子機理研究提供新的證據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

鮮活太平洋牡蠣 (體長10～13 cm) 樣本 (10 只) 采集自青島市黃島區某貝類養殖場。

1.2 總RNA 提取與cDNA 模板制備

取牡蠣消化腺組織，在液氮中研磨，根據試劑盒的操作說明，用動物組織RNA 提取試劑盒 (天根生化科技有限公司，中國) 制備牡蠣消化腺總RNA。用1% (w) 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性。用Nano Photometer Pearl 微分光光度計 (Implen，德國) 測定RNA 濃度。使用SMATER RACE 5'/3' 試劑盒 (TaKaRa，中國) 對總RNA 進行逆轉錄合成5'/3' cDNA 末端 (RACE)，使用Evo M-MLV Plus cDNA 合成試劑盒 (艾科瑞生物工程有限公司，中國) 對總RNA 逆轉錄合成1st Strand cDNA。

1.3 中間片段克隆

根據NCBI 公布的人 (Homosapiens,NC_000019.10)、黑猩猩 (Pantroglodytes,NC_036898.1)、熱帶爪蟾 (Xenopus tropicalis,NC_030680.2)、狗 (Canislupusfamiliaris,NC_051824.1) 等物種的FUT5基因序列，使用DNAMAN 軟件進行多序列比對，選取相似度較高的氨基酸序列在NCBI 網站上公布的太平洋牡蠣全基因組中搜索比對，找到預測的太平洋牡蠣FUT5(CgFUT5) 基因序列(XM_020069167.2)。利用Primer 5 軟件設計中間片段擴增引物FT5-1 和RT5-1 (表1)，以太平洋牡蠣消化腺總RNA 反轉錄合成的1st Strand cDNA 為模板，擴增CgFUT5基因中間片段。PCR 反應體系 (50 μL) 為：FT5-1、RT5-1 (10 μmol·L-1) 各1 μL，PCR 預混液25 μL，cDNA 模板3 μL，RNase free water 20 μL。反應條件為：94 ℃5 min；94 ℃ 1 min，48 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環；72 ℃ 5 min。PCR 產物經1% (w) 瓊脂糖凝膠電泳后，使用凝膠成像儀對電泳條帶進行觀察，選擇合適條帶進行切膠并送至測序公司測序。

表1 實驗中所用引物Table 1 Primers used in this experiment

1.4 基因全長克隆

根據中間片段克隆得到的序列，使用Primer 5 軟件設計RACE 克隆引物FRT5/RRT5 (表1)。以SMATER RACE 5'/3' 試劑盒合成的cDNA 做模板，擴增5'/3' 序列。反應體系為：RNase Free Water 15.5 μL，2×seqAmp Buffer 25 μL，SeqAmp DNA polymerase 1 μL，5'/3' RACE cDNA 2.5 μL，10×UPM 5 μL，RRT5/FRT5 1 μL。反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，35 個循環；72 ℃5 min。

將RACE PCR 產物經1% (w) 瓊脂糖凝膠電泳，膠回收純化后克隆到pUC19 線性載體上。將重組載體轉化到TOP10 感受態細胞，并進行藍白斑篩選和PCR 鑒定。選擇結果良好的克隆送至測序公司測序。

1.5 序列分析

分析測序結果，將中間片段及5'、3' 序列拼接，得到完整的CgFUT5基因序列。使用Snapgene 軟件預測氨基酸序列并計算出分子量和等電點；運用TMHMM 在線系統(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) 分析蛋白質跨膜結構域；利用DNAMAN 軟件進行多序列比對，在MEGA 7.0 軟件中采用鄰接法進行序列比對，構建系統發育樹。

1.6 組織表達分析

取3 只牡蠣的外套膜、鰓、閉殼肌、唇瓣和消化腺組織，在液氮中研磨混合，提取各組織總RNA，使用RT-qPCR反轉錄試劑盒 (TaKaRa，中國) 制備熒光定量cDNA 模板。根據CgFUT5基因序列合成引物Q-FT5-A/Q-RT5-A (表1)，以太平洋牡蠣β-actin基因 (NCBI 網站登錄號AF026063) 為內參基因，設計引物F-actin/R-actin (表1)[25-26]。通過RTqPCR 檢測牡蠣外套膜、鰓、閉殼肌、唇瓣和消化腺中的CgFUT5基因表達水平，每個組織樣品設置3 個平行組，反應體系為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s (收集熒光信號)，40 個循環。組織相對表達量使用2-ΔΔCt方法計算[27]。

1.7 原核表達

對前期克隆得到的CgFUT5基因序列依據大腸桿菌密碼子偏好性進行稀有密碼子優化，使用金斯瑞密碼子優化工具 (https://www.genscript.com.cn/gensmart-free-genecodon-optimization.html) 在線進行。優化后的基因序列在氨基酸序列C 端添加6×His 標簽序列，克隆至pET-28a(+) 質粒，得到的重組質粒命名為pET-CgFUT5。同時構建截斷N 端部分氨基酸序列并添加6×His 標簽序列，克隆至pET-28a(+) 質粒，得到的重組質粒命名為pET-His-Δ59-CgFUT5。

將pET-CgFUT5 與pET-His-Δ59-CgFUT5 質粒分別轉化到大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態細胞，經卡那霉素篩選后挑取單菌落接種于含50 μg·mL-1卡那霉素的液體LB 培養基，經36 ℃搖床過夜培養后按體積比1∶50 轉移至含有卡那霉素的TB 培養基中擴大培養。至菌液OD600為0.6 時，加入終濃度為0.6 mmol·L-1的IPTG 溶液，設置培養溫度為36 ℃，培養時間為6 h。取1 mL 誘導后的菌液離心并收集菌體沉淀。加入80 μL 雙蒸水 (ddH2O) 重懸菌體沉淀后，加入20 μL 5×蛋白上樣緩沖液吹打混勻，煮沸10 min 以裂解細菌，12 000 r·min-1離心2 min，取10 μL 上清液加入聚丙烯酰胺體積分數為12%的SDS-PAGE 凝膠上樣孔中，同時加入蛋白標準Marker、BL21 空菌陰性對照和pET28a 空載陰性對照組菌液。在垂直電泳儀 (百晶生物有限公司，中國) 中經120 V 電壓分離后，取膠塊置于室溫搖床中用考馬斯亮藍染色液染色1 h，再經脫色液充分脫色至蛋白條帶清晰可見。

1.8 免疫印跡分析

取1 mL 成功表達CgFUT5 蛋白的菌液，離心收集菌體后按體積比8∶2 加入ddH2O 和蛋白上樣緩沖液，經煮沸離心后進行SDS-PAGE 電泳，同時加入蛋白Marker 和pET28a 空載陰性對照菌液。電泳完成后在30 V 恒定電壓下轉移蛋白至硝酸纖維素薄膜，置于預冷的TBS 緩沖液中洗滌后，轉移至含有1% (w) 牛血清白蛋白 (BSA) 的TBST 緩沖液中，于4 ℃冰箱孵育過夜。用TBST 緩沖液洗滌過夜孵育后的硝酸纖維素薄膜3 次，加入兔抗人FUT5 單克隆抗體 (ABnova，中國) (使用TBST 緩沖液稀釋2 000 倍)，同時在另一組加入鼠抗6×His 標簽單抗體(Abcam，中國) (使用TBST 緩沖液稀釋3 000 倍)，室溫孵育2 h。孵育結束后使用TBST 緩沖液洗滌薄膜3 次，加入對應的二抗 (使用含1% BSA 的TBST 緩沖液稀釋3 000 倍)室溫孵育1 h，用TBST 緩沖液洗滌薄膜3 次。按照HRPDAB 底物顯色試劑盒 (天根生化科技有限公司，中國) 說明書配制顯色液，將顯色液滴加于洗滌后的硝酸纖維素薄膜表面，避光放置5 min 顯色。

2 結果

2.1 CgFUT5 基因全長序列

根據設計的中間片段引物FT5-1/RT5-1，擴增得到932 bp 的cDNA 片段；利用3'RACE 克隆擴增得到322 bp 的片段，利用5'RACE 克隆擴增得到417 bp 的片段；將序列拼接，得到一個具有1 173 bp 翻譯區的完整CgFUT5基因序列，包括一個起始密碼子 (ATG) 和一個終止密碼子(TAA)、一個加尾信號 (AATAAA) 以及一段由34 個腺嘌呤核苷酸組成的poly(A) 結構 (圖1)。

2.2 CgFUT5 基因序列分析

對CgFUT5基因序列推導出的氨基酸序列進行分析，序列由396 個氨基酸組成，經ExPASy-Compute pI-Mw tool 在線預測顯示該蛋白相對分子質量為46.0 kD，理論等電點為9.65，屬于堿性蛋白質。利用TMHMM 推算其跨膜結構域，結果顯示，CgFUT5 具有一個跨膜結構域，由位于7—24 的18 個氨基酸組成 (圖2)。

圖2 CgFUT5 蛋白跨膜結構分析Fig.2 Transmembrane structure analysis of CgFUT5 protein

從NCBI 網站下載多個物種巖藻糖基轉移酶蛋白質序列，構建CgFUT5基因進化樹，結果顯示，CgFUT5基因與秀麗隱桿線蟲 (Caenorhabditiselegans)FUT5(NC_003280.10)等具有合成Lewis 抗原功能的基因聚為一類 (圖3)。

圖3 FUTs 家族系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of FUTs family

2.3 CgFUT5 基因在太平洋牡蠣中的組織分布

通過RT-qPCR 分析了牡蠣5 種組織中的CgFUT5基因表達量，結果表明，CgFUT5基因在各組織中的表達量差異較大，以閉殼肌中的表達量為基準，在鰓、外套膜和唇瓣中的表達量分別為44、7 和3 倍，而消化腺中的表達量則很低 (圖4)。

圖4 CgFUT5 基因在太平洋牡蠣 5 種組織中的相對表達量注：不同字母代表組間極顯著性差異 (P<0.01)。Fig.4 Relative expression of CgFUT5 gene in five tissues of C.gigasNote: Different letters represent extremely significant differences among the groups (P<0.01).

2.4 CgFUT5 重組蛋白的原核表達

使用SDS-PAGE 電泳分析經IPTG 誘導后的大腸桿菌總蛋白，結果顯示，轉化pET-CgFUT5 質粒的重組大腸桿菌總蛋白在46 kD 標準分子量大小處出現了蛋白條帶，且陰性對照中無此條帶，表明CgFUT5 蛋白在大腸桿菌表達系統中成功表達；而轉化pET-His-Δ59-CgFUT5 質粒的大腸桿菌總蛋白在40 kD 標準分子量處出現了蛋白條帶，表明截斷部分N 端氨基酸序列的CgFUT5 蛋白也在大腸桿菌中成功表達，且表達量明顯高于未截斷序列質粒的蛋白 (圖5)。

圖5 CgFUT5 重組蛋白的 SDS-PAGE 電泳分析Fig.5 Analysis of recombinant protein CgFUT5 by SDS-PAGE electrophoresis

2.5 CgFUT5 重組蛋白免疫印跡分析

使用鼠抗6×His 標簽單克隆抗體 (圖6) 和兔抗人FUT5 蛋白多克隆抗體 (圖7) 的免疫印跡分析結果顯示，在泳道2 中 (目的蛋白組) 有一個約為46.0 kD 的條帶，而泳道1 中 (pET28a 空載對照組) 沒有出現類似大小的條帶。這一結果證實轉化后的CgFUT5 蛋白成功表達并被轉移至硝酸纖維素薄膜，且重組CgFUT5 蛋白具有與人FUT5 蛋白相似的免疫原性。

圖6 以鼠抗 6×His 標簽單克隆抗體為一抗分析CgFUT5 表達蛋白Fig.6 Expression of CgFUT5 protein analyzed by mouse anti-6×His labelled monoclonal antibody as primary antibody

圖7 以兔抗人 FUT5 單克隆抗體為一抗分析CgFUT5 表達蛋白Fig.7 Expression protein of CgFUT5 analyzed by rabbit antihuman FUT5 monoclonal antibody as primary antibody

3 討論

諾如病毒與牡蠣HBGAs 的相互作用及結合機制是目前研究的熱點[9,11]，關于牡蠣組織血型抗原的合成方式和來源的研究尚處于起步階段。通過類比人類HBGAs 的合成途徑，可以假設牡蠣通過與人類相似的途徑合成類HBGAs，因此逐一克隆牡蠣中的關鍵糖基轉移酶基因是驗證上述假設的必要手段。

在前期的研究中筆者團隊已克隆了2 個太平洋牡蠣類HBGAs 合成相關的糖基轉移酶基因[25,28]，其中牡蠣類FUT10基因與CgFUT5基因所預測的功能類似，但是二者在牡蠣中的組織分布規律卻差異明顯，類FUT10基因在消化腺組織中高表達而CgFUT5基因則幾乎不表達，在鰓中類FUT10基因的表達量最低而CgFUT5基因卻有極高的表達量。目前在人體中已經發現13 種巖藻糖基轉移酶，其中FUT3、FUT4、FUT5、FUT6、FUT7、FUT9、FUT10 和FUT11 均屬于α-1,3/4-巖藻糖基轉移酶，均具有合成Lewis 血型的功能[29-30]，部分巖藻糖基轉移酶具有相同的底物特異性，但未見關于巖藻糖基轉移酶的組織特異性報道，在其他哺乳動物中也未見報道。Kiem 等[31]在秀麗隱桿線蟲α-1,3-巖藻糖基轉移酶的研究中發現存在多種相同功能的巖藻糖基轉移酶基因，其中的CEFT-1(Caenorhabditiselegansfucosyl transferases 1) 基因也只在特定的組織或細胞內表達，推測這種表達模式或許是秀麗隱桿線蟲存在多種具有相似功能的巖藻糖基轉移酶基因的原因。鑒于牡蠣與秀麗隱桿線蟲同屬于無脊椎動物，筆者推測太平洋牡蠣中同樣具有多種功能相似且底物特異性不同的巖藻糖基轉移酶基因，還進化出了復雜的組織特異性表達模式。有研究表明，不同基因型的諾如病毒在牡蠣中的富集具有組織特異性，如GI 型主要分布于牡蠣消化腺，GII 型主要分布于鰓和外套膜，而GIII 型均勻分布于牡蠣各組織中[32]。雖然諾如病毒疫情在我國未大規模暴發，但諾如病毒的區域性感染案例屢見不鮮，其中GII 型諾如病毒是引發我國諾如病毒感染的優勢毒株[33-36]。牡蠣消化腺組織是目前研究諾如病毒特異性富集的主要靶點，但鰓作為牡蠣的濾食器官是牡蠣接觸諾如病毒的第一道屏障，同樣具有富集GII 型諾如病毒的特點。據此，提出了牡蠣CgFUT5基因在鰓中特異性表達并產生Lewis 抗原可能與牡蠣鰓組織特異性富集GII 型諾如病毒有關的假設。挖掘牡蠣類HBGAs 合成路徑中的糖基轉移酶基因，進一步了解牡蠣類HBGAs的合成機理，將能驗證這一假設，從而為食源性諾如病毒疫情防控提供新的解決方案。

巖藻糖基轉移酶廣泛存在于多種動植物及細菌中，種類豐富且應用價值大，但目前成功表征的真核生物來源的巖藻糖基轉移酶只有較少的一部分。真核巖藻糖基轉移酶屬于II 型跨膜蛋白，它們具有共同的結構域特征，即具有一個跨膜結構域，其側翼是一個短的氨基端結構域和一個大的羧基端催化結構域[37]，這種特殊結構制約著巖藻糖基轉移酶的異源表達與酶活表征。已有研究表明，跨膜結構域對糖基轉移酶蛋白在原核或真核系統中的表達有直接影響，如可影響蛋白的可溶性、分泌性及表達量等[38-40]。母乳低聚糖的體外合成中所使用的糖基轉移酶通常來自于細菌，這是因為細菌巖藻糖基轉移酶不具有跨膜結構域，更容易進行大規模制備[41]。本文構建了截斷跨膜域結構的CgFUT5基因原核表達質粒，證明截斷后的質粒在大腸桿菌中實現了更高的表達量，不僅為CgFUT5 蛋白的提純及功能驗證奠定了基礎，也可為牡蠣HBGAs 合成路徑中的其他糖基轉移酶基因的克隆表達研究提供參考。

4 結論

本研究主要對太平洋牡蠣FUT5基因進行了克隆，通過對CgFUT5 重組蛋白進行免疫印跡分析，證實其具有與人FUT5 蛋白相似的免疫原性，表明牡蠣中類HBGAs 的合成與人HBGAs 的合成路徑具有相似之處，為進一步解析牡蠣特異性富集諾如病毒機理研究提供了新的證據。