青蒿素及其衍生物對細胞自噬調控的研究進展

鄧海蓮，吳月瑩，沙文月，羅金花，楊宇，馮德輝

1 廣東醫科大學 第一臨床醫學院，廣東 湛江 524000；2 廣東醫科大學附屬醫院老年醫學科

青蒿素（ART）及其衍生物除具有抗瘧疾作用外，還能抑制腫瘤細胞生長、分裂、遷移［1］。另外，它們還具有抗纖維化、抗病毒、消除炎癥等作用［2-3］。ART 及其衍生物具有共同的基團：含有過氧化橋的倍半萜內酯，因此具有相似的藥理特性，包括下調氧化應激［4］、免疫抑制［5］、誘導細胞凋亡［6］、調控細胞自噬［7］等?，F就ART及其衍生物調控自噬治療疾病的研究進展及相關信號通路綜述如下。

1 青蒿素及其衍生物與自噬的關系

我國古代醫者在古籍中曾提及“青蒿一握，以水二升漬，絞取汁，盡服之”治療瘧疾?！扒噍铩笔禽锟撇荼局参?，具有涼血解毒、消除骨熱、避暑、防止瘧疾復發和消除黃疸的功效［8］。蒿科草本植物是我國民間俗稱的“甜艾草”，亦是傳統中藥常用的一味藥材，而ART 便是從蒿科草本植物中分離得到。因ART 溶解性差、生物利用度低，雙氫青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚等衍生物相繼問世。目前ART 及其衍生物是應用最廣泛、認可度最高的抗瘧疾藥物，它們具有共同的基團：含有過氧化橋的倍半萜內酯，決定了它們具有相似的作用機制。過氧化橋在ART 及其衍生物發揮抗瘧疾作用過程中至關重要［9］。近年來，ART及其衍生物被發現除了具有抗瘧疾作用外，還能抑制腫瘤細胞的增殖和分化［1］，并且與細胞周期阻滯、氧化應激［4］、細胞凋亡和自噬［7］等機制相關。

20世紀50年代，首次在酵母中發現了自噬體和自噬現象［10］，電鏡下觀察到胞質內自噬體的形成是一個連續性過程。自噬被激活后，首先在內質網出現隔離膜；隨后延伸雙層膜結構包裹受損的蛋白質或者細胞器，形成成熟自噬體，在一系列自噬蛋白協助下轉運至溶酶體；接著雙層膜結構與溶酶體膜相融合，包裹的蛋白質或者細胞器釋放入溶酶體，被溶酶體酶降解，完成自噬過程。根據降解的底物不同，自噬可分為非選擇性自噬和選擇性自噬，非選擇性自噬主要在饑餓環境下被激活，降解受損物質，形成代謝循環利用環，為細胞提供營養和能量；而非選擇性自噬主要與保護細胞結構相關，根據作用的對象不同，可分為線粒體自噬、過氧化物酶自噬、內質網和核糖體自噬等。同時，自噬也被認為是一種Ⅱ型程序性細胞死亡，過度的自噬不僅不能保護細胞，反而會導致細胞死亡。自噬對機體的雙刃劍作用讓其在人類腫瘤及代謝性疾病、神經系統疾病中發揮重要作用。

相關文獻報道，ART 及其衍生物除了抑制腫瘤細胞生長繁殖外［7］，還能通過調控自噬增加耐放化療腫瘤細胞對藥物的敏感性［11］。此外，ART 及其衍生物通過調控自噬降解肝硬化的細胞外基質沉積、改善肝細胞損傷、抑制甚至逆轉肝纖維化進程［3］。相關研究表明，ART 及其衍生物還能調控自噬，抑制滑膜的異常細胞增殖，修復軟骨細胞異常表達，具有改善骨關節炎的潛質［12］。血管細胞發生自噬是血管內各類細胞在缺氧、血流剪切力增強等應激環境下降解受損蛋白質、為細胞提供能量以及修復受損細胞的保護機制，ART 及其衍生物被發現能調控自噬、修復受損的血管細胞［13］。同時，研究表明ART及其衍生物對腎臟疾病尤其是足細胞相關性腎臟疾病，具有一定的治療潛力［14］?？偟膩碚f，ART 及其衍生物已批準用于臨床，其安全性、有效性已經在一定程度上得到保證，根據藥物特性和疾病特點，開發舊藥新功能一直是有吸引力的命題，因此ART 及其衍生物的臨床應用會受到越來越多的關注。

2 青蒿素及其衍生物對自噬調控的相關信號通路

2.1 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路mTOR 是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，ART及其衍生物被發現能通過調節mTOR 表達調控自噬，影響生長因子、氧化應激因子等分泌，從而調控能量代謝、調節蛋白質合成和分解。mTOR 是信號通路中間站，與自噬調節相關的上游通路包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路和腺苷單磷酸激活的蛋白激酶信號通路（AMPK）。上游信號通路激活后促進mTOR 磷酸化使其活化，活化的mTOR 誘導下游信號因子Unc-51 樣自噬激活激酶（Ulk）磷酸化而失活，從而抑制自噬的發生［15］。

2.1.1 PI3K/Akt/mTOR 信號通路 PI3K/Akt/mTOR 信號通路是一條經典的自噬信號通路，與細胞的生長代謝、周期調節有密切關系。在營養充足情況下，PI3K/Akt/mTOR信號通路激活，mTOR活化促使Ulk 637 號位和757 號位的絲氨酸（Ser308 和Ser757）磷酸化而失活，進而抑制Ulk復合物的活性，抑制自噬啟動。在饑餓或者細胞應激期間，mTOR活性受到抑制，Ulk 特定位點的磷酸化被解除，活化的Ulk 復合物隨后轉移到內質網的隔離膜上，啟動自噬。研究表明，ART 及其衍生物能影響這條通路的上中下游其中一兩個環節從而調控自噬。LIU等［13］在人臍靜脈內皮細胞模型中發現，相比對照組，雙氫青蒿素組微管相關蛋白1 輕鏈3（LC3-Ⅱ）表達水平更高，Akt、mTOR、核糖體S6蛋白激酶（p70S6K）磷酸化水平更低。通過siRNA 干擾沉默自噬相關蛋白ATG5 能減弱雙氫青蒿素組LC3-Ⅱ水平的高值，而使用mTOR 抑制劑雷帕霉素預處理后，雙氫青蒿素組未出現LC3-Ⅱ表達進一步升高，上述結果表明Akt/mTOR 通路活性下調是雙氫青蒿素誘導血管內皮細胞發生自噬的機制。姜廣利等［16］將宮頸癌HeLa 細胞作為研究對象，隨機設置對照組、雙氫青蒿素組、順鉑組及雙氫青蒿素加順鉑組，實驗結果發現，雙氫青蒿素加順鉑組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達低，而p-mTOR/mTOR 和 p-Ulk /Ulk 表達升高，提示雙氫青蒿素可能通過激活mTOR/Ulk 信號途徑抑制自噬，從而提高宮頸癌的化療敏感性。在順鉑耐藥胃癌細胞SGC7901/DDP 體外模型中，ZHANG 等［11］研究發現，雙氫青蒿素干預后，使用mRFP-GFP-LC3腺病毒轉染和透射電子顯微鏡發現細胞內自噬增強，蛋白質印跡檢測發現PI3K、Akt 和mTOR 磷酸化水平降低，表明雙氫青蒿素通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路誘導自噬，克服了癌細胞耐藥特性引發細胞死亡，可作為治療耐藥性胃癌的潛在藥物。

2.1.2 AMPK/mTOR 信號通路 AMPK 是一種能量感應蛋白，維持能量代謝平衡，當機體AMP/ATP值上調或者下調時，AMPK 啟動相關信號通路干預能量流動，同時調節能量產生和能量消耗途徑來儲存機體內能量。在能量充足情況下，活化的mTOR除了直接磷酸化Ulk 使其失活外，還能通過破壞AMPK 與Ulk 之間相互作用來阻止Ulk 活化，抑制自噬啟動。而能量缺乏時，AMPK 被激活，活化的AMPK 抑制mTOR 的磷酸化，其對Ulk 的抑制被解除，啟動自噬。DU等［17］探究雙氫青蒿素干預白血病細胞株的實驗中觀察到，雙氫青蒿素能上調LC3-Ⅱ、ATG5、ATG7、Beclin1等自噬相關蛋白表達，同時p-AMPK/AMPK 表達水平升高，而mTOR 磷酸化被抑制，下游蛋白p70S6K 表達增加，表明雙氫青蒿素通過調節AMPK/mTOR 信號通路激活自噬，誘導細胞死亡。在此基礎上，敲除ATG7 基因或者使用自噬抑制劑（3-MA 或BafA1）后，自噬相關蛋白表達明顯下降，自噬被抑制，雙氫青蒿素對白血病細胞株的毒性變小，而使用雷帕霉素對mTOR 活性抑制后加劇了雙氫青蒿素激發的細胞死亡。此外，研究還發現雙氫青蒿素誘導的自噬能增加細胞內鐵蛋白及過氧化物表達，誘導缺鐵性貧血，導致白血病細胞株死亡，表明雙氫青蒿素可能是治療白血病的有效藥物。

2.2 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路MAPK 是一組真核保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過調節自噬參與細胞分化、增殖等生理活動，與自噬相關的亞基主要包括c-jun N 端激酶（JNK）、細胞外信號調節激酶（ERK1/2）及p38 三種亞基。MAPK 亞基調節自噬的機制錯綜復雜，有時甚至截然相反，尤其是在ATR 及其衍生物等藥物特定的處理條件下如何精細調控細胞自噬仍未被闡明。研究表明，MAPK/JNK激活后可以促使Bcl-2家族蛋白磷酸化，從而將Beclin1 從復合體中游離出來，與自噬相關蛋白Vps34結合，促進自噬體成核，同時JNK 還可以直接激活相關自噬基因ATG 促進自噬。JIA等［18］在研究雙氫青蒿素對胰腺癌細胞株作用時發現，相比對照組，雙氫青蒿素組LC3-Ⅱ、JNK、Beclin1表達增強，mTOR 表達減弱，使用JNK 抑制劑或者siRNA 干擾沉默JNK 后，雙氫青蒿素組Beclin1 水平下調，自噬表達減弱，細胞死亡率升高，表明雙氫青蒿素通過MAPK/JNK 信號通路誘導了胰腺癌細胞株發生保護性自噬，抑制JNK 表達有可能增強雙氫青蒿素的治療功效，JNK 基因沉默有可能成為治療胰腺癌的手段。然而，YAO 等［19］發現MAPK/JNK 信號通路在調節雙氫青蒿素衍生物L-A03誘導人乳腺癌癥細胞發生自噬時起著相反的結果。實驗結果顯示，處理乳腺癌細胞株MCF-7 時，L-A03 組自噬相關蛋白LC3-II表達增強，但JNK磷酸化水平降低，而使用JNK 特異性抑制劑SP600125 后，L-A03 組自噬表達進一步增強，乳腺癌細胞株死亡率更高，類似的結果在另外一種乳腺癌細胞株MDA-MB-231中得到印證，表明雙氫青蒿素衍生物L-A03 誘導乳腺癌細胞發生自噬可能與MAPK/JNK 信號通路受抑制相關，JNK 基因失活有可能成為治療乳腺癌的靶點。MAPK/JNK 信號通路在自噬調節中極其復雜，有時甚至互相矛盾，這一現象在其他研究中亦有體現［20］，考慮與藥物激活其他的細胞活動如凋亡、炎癥、氧化應激等間接影響了自噬調節的方向有關，仍需設計更多實驗進一步明確其中機制。LIU 等［21］采用雙氫青蒿素另外一種衍生物DHA-37 處理非小細胞肺癌體外模型時發現，DHA-37 組自噬表達增強，同時ERK1/2、p38 以及高遷移率族蛋白B1（HMGB1）表達明顯升高，而JNK1表達和對照組差異無統計學意義，使用ERK1/2 抑制劑PD98059 逆轉了LC3-Ⅱ/LC3-I 上調，并阻止了DHA-37 誘導的HMGB1 增加，阻止了DHA-37誘導的細胞死亡，而使用p38抑制劑SB203580 也出現了相似的實驗結果，表明DHA-37誘導的自噬增強導致肺癌細胞株死亡可能與MAPK/ERK和p38信號通路相關。該實驗還設計了肺癌異種移植裸鼠體內模型，發現p-ERK、p-p38、HMGB1、LC3-Ⅱ水平升高，進一步印證了上述結論。上述研究表明，MAPK 信號通路在ART 及其衍生物調控自噬治療相關疾病的發展過程中起著舉足輕重的作用。

2.3 活性氧（ROS）信號通路 ROS 是一組化學性質活潑、氧化性強的物質，包括羥自由基、雙氧水、超氧陰離子、一氧化氮等。體內的ROS 水平往往維持在極低狀態，當機體受到刺激時會產生大量的ROS，引發細胞氧化應激，進而誘導細胞炎癥、凋亡、自噬等。相關研究發現，在ART及其衍生物實驗中，ROS能通過多種細胞信號通路調控自噬，促進細胞發生自噬性死亡或自噬性保護，同時自噬亦能逆反饋調節ROS 水平。DU 等［22］在食管癌細胞系中發現雙氫青蒿素誘導細胞自噬。MA 等［23］在此基礎上進一步研究了其中機制，發現細胞內的ROS 水平明顯上調，而使用抗氧化劑NAC 阻斷ROS 后，觀察到雙氫青蒿素組自噬水平較前明顯下降，細胞活性抑制明顯減弱。HU 等［24］通過對骨髓瘤、白血病、直腸癌、宮頸癌等多種細胞株的研究發現，雙氫青蒿素通過抑制各細胞株鐵蛋白重鏈（FHC）和錳超氧化物歧化酶（MnSOD）表達，引起ROS 累積，誘導細胞自噬，實驗發現，抗氧化劑阻斷ROS 可抑制雙氫青蒿素誘導細胞自噬。上述研究表明，雙氫青蒿素誘導細胞自噬可能與ROS水平相關。SHEN等［25］研究發現，雙氫青蒿素抑制骨肉瘤細胞增殖，對骨肉瘤有潛在治療價值，其作用機制主要與鐵依賴的ROS水平上調、激活上游自噬過程、阻斷后期自噬降解相關。

2.4 核因子-κB（NF-κB）信號通路 NF-κB 是一組調控細胞分化、增殖的轉錄因子家族，主要有Rel-A（p65）、Rel-B、c-Rel（Rel）、NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52）等5 種亞型。一般情況下，NF-κB 的轉錄并不活躍，其與IκB 家族抑制蛋白結合形成無活性復合體，當受到外界刺激時，IκB發生磷酸化，NF-κB被激活，向細胞核轉移，NF-κB活化，進而調節下游因子。NF-κB 參與了細胞凋亡、壞死、炎癥、自噬等過程。研究發現自噬與NF-κB 信號通路有相互交叉作用，NF-κB信號通路受抑制，自噬激活，機體產生保護或者損傷作用，反之亦然。HU 等［24］研究發現，雙氫青蒿素通過抑制NF-κB核轉位來調控各種癌細胞株發生自噬。許浩等［26］在宮頸癌細胞株體外模型中觀察發現，相比對照組，雙氫青蒿素組自噬表達增強、NF-κB表達被抑制，并且細胞增殖抑制明顯，雙氫青蒿素誘導自噬抑制宮頸癌細胞株活性的機制有可能與阻斷NF-κB 信號通路相關，但該實驗并未設計NF-κB 通路激活劑或抑制劑進一步印證。JIANG等［12］將軟骨細胞作為研究對象，隨機設置對照組、腫瘤壞死因子（TNF-α）組、雙氫青蒿素組和TNF-α+雙氫青蒿素組，結果發現TNF-α+雙氫青蒿素組自噬水平較雙氫青蒿素組明顯升高，此外TNF-α 組p65 表達增強并且出現核轉位、IκB 表達降低，但用雙氫青蒿素預處理后降低了p65 表達，并且誘導了軟骨細胞中IκB 的積累，說明雙氫青蒿素抑制了TNF-α 刺激的NF-κB信號傳導。該實驗還使用了NF-κB抑制劑SM7368，觀察到IκB的表達增強，NF-κB途徑受到抑制，但軟骨細胞中LC3-Ⅱ水平升高，驗證了NF-κB通路在雙氫青蒿素誘導軟骨細胞發生自噬的作用。LI 等［27］研究卵巢癌細胞系發現，青蒿琥酯和雙氫青蒿素誘導的自噬可能抑制了卵巢癌細胞系的NF-κB信號通路。相關研究表明，NF-κB 信號通路影響mTOR 蛋白的磷酸化從而調節細胞自噬［28］，但并未有研究直接表明ART 及其衍生物處理時，NF-κB 信號通路能調節mTOR蛋白的磷酸化。

綜上所述，青蒿素及其衍生物可通過mTOR、MAPK、ROS、NF-κB等信號通路調控自噬，對多種疾病起到緩解作用。