分子對接闡明草甘膦與水稻醛酮還原酶（OsALR2）的作用及QsALR2的表達純化

孫躍 劉蓉 王思威 徐漢虹 吳鷹花

關鍵詞：水稻；草甘膦；分子對接；原核表達；包涵體變復性；酶活測定

草甘膦（glyphosate）是一種重要的除草劑，具有內吸傳導性強，廣譜，藥效好，靶向性高，環境兼容性高等優點。草甘膦以植物葉綠體中5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvate shikimate-3phosphate synthase，EPSPS）為靶標。EPSPS是莽草酸代謝途徑的第6個酶，負責催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和磷酸莽草酸（S3P）生成5一烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸（EPSP），這個步驟是進一步合成芳香族氨基酸、激素和次生代謝物的關鍵。草甘膦以競爭PEP和非競爭S3P的方式與植物體內EPSPS結合，形成結構穩定的EPSPS-S3P-草甘膦復合物，從而導致EPSPS活性喪失，進而使莽草酸在組織中大量積累。同時，蛋白質生物合成所需的芳香族氨基酸的合成嚴重受阻，最終導致植物死亡。此外，植物葉綠體的亞微結構、核糖體、RNA和色素的形成都受到草甘膦的影響。

醛酮還原酶（aldo-keto reductase，AKR）是一類結構和功能相似的依賴還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的氧化還原酶蛋白超家族，廣泛分布于原核生物、酵母、植物、動物和人類等所有生物中。研究發現，AKR可以催化多種羰基化合物，包括葡萄糖、小型羰基代謝物、谷胱甘肽結合物、脂質過氧化物等的氧化還原反應。AKR以NADPH作為輔酶，將醛和酮類物質還原成初級和次級的醇。除了這些主要功能外，研究發現AKR在植物體內過量表達后能緩解草甘膦的毒性，暗示植物體內的AKR可能具有降解草甘膦的作用。Pan等在澳大利亞的野生稗草Echinochloa Crus-galliP．Beauv.中過表達AKR基因使稗草獲得了草甘膦抗性。目前草甘膦在水稻中的作用機理尚不清楚，這使得草甘膦在水稻田的推廣使用受到了嚴重限制。本研究首先通過生物信息學軟件對水稻體內OsALR2蛋白的理化性質、亞細胞定位、跨膜特性，二硫鍵含量等生物學特性進行了系統分析。再通過結構預測軟件模擬了水稻OsALR2蛋白的三維結構，并通過Auto Dock Vina展示草甘膦與OsALR2分子對接的結果。最后，在原核系統中表達和純化OsALR2。本研究為OsALR2與草甘膦的共結晶奠定了基礎，同時為抗草甘膦水稻的商業化提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

大腸桿菌trans-T1感受態購自上海唯地生物技術有限公司。大腸桿菌C43（DE3）感受態購自安徽吐露港生物科技有限公司。pET-32a質粒為本實驗室保藏。氯化鈉、酵母提取物、蛋白胨、咪唑、丙三醇、Tris、SDS和IPTG等試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司；抗生素Ampicillin （Amp）購自Sigma; His（融合HRP）抗體購自北京聚合美生物科技有限公司。限制性內切酶Not、Xho和KOD高保真酶購自NEB。LxnaseⅡ重組酶購自諾唯贊生物科技有限公司。DNA marker、Protein marker購自大連寶生物，膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，質粒抽提試劑盒購自北京全式金公司。引物合成和常規測序分析由華大基因完成。質譜分析服務由北京生物物理所質譜平臺提供。

1.2試驗方法

1.2.1OsALR2蛋白生物信息學分析

利用TMHMM 2.0（https：∥servlces. health-tech. dtu. dk/service.php？ TMHMM-2.0）分析OsALR2蛋白的跨膜次數；利用DiANNA1.1webserver （http：∥clavius. bc. edu/Nclotelab/DiAN-NA/）分析OsALR2蛋白的二硫鍵數目；利用A1-phaFold（https：∥www. alphafold. ebi. ac. uk/search/text/OsOlg0847600）和UniProt（https：∥www. uniprot. org/）預測其三級結構。

1.2.20sALR2蛋白與小分子草甘膦的分子對接及對接結果分析

檢索PubChem數據庫（https：∥pubchem. nc-bi. nlm．nih. gov/）獲得草甘膦的分子結構式。在Auto Dock中對小分子進行加氫和加電荷處理，再定義tortion確定小分子哪些鍵可旋轉。通過Al-phaFold和UniProt數據庫下載OsALR2蛋白三級結構的pdb格式文件，用PyMOL刪去其多余水分子，然后用在線網站Prepare PDB file for dockingprograms （https：∥swift. cmbi. umcn. nl/servers/html/prepdock. html）對蛋白進行修復。將OS-ALR2蛋白和草甘膦在Auto Dock中打開，通過查詢文獻確定蛋白受體的結合位點坐標，輸入坐標生成對接盒子，進行對接。選取對接結果中結合能較低且構象較好的，對蛋白和小分子相互作用位點的氨基酸和作用力進行可視化展示。將ADT生成的分子對接結果分別上傳到PDBsum Generate（http：∥WWW.ebi. ac. uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html）和https：∥saves．mbi．ucla．edu/在線網站中，評價對接獲得的三維結構的可靠性。

1.2.3原核表達載體的構建

提取水稻‘中花11'總RNA，反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板，以5，-ATGGCGAGTGC_CAAGGCGAT-3為正向引物，5，-TTAGAC-CTCGTTATCCCAGACC-3為反向引物，擴增出水稻編碼AKR的基因Os-ALR9，并將其克隆至T載體。利用同源重組的方法構建原核表達載體：以含有水稻OsA/R2的T載體為模板，用KOD高保真酶擴增水稻OsALR2?；厥誔CR產物并測定濃度，分別用內切酶Not工和Xho工對OsALR7基因和pET32a質粒在37℃下雙酶切3h，利用ExnaseⅡ重組酶將酶切后的OsALR9和pET-32a產物按照2：1的摩爾比在37℃連接30min。取5uL連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞trans-T1進行菌落PCR鑒定，挑取陽性克隆送華大基因進行序列測定，選取序列完全正確的克隆，提取質粒，即為原核表達載體pET32a-His-OsALR2，-20℃保存。

1.2.40sALR2蛋白的誘導表達

將pET32a-His-OsALR2質粒轉化大腸桿菌表達菌株C43 （DE3）。先進行小量誘導：挑取4個單克隆分別接種于3mL LB培養液中，37℃、200r/min培養至菌液OD600為0.6～0.8，在4管菌液中分別加人終濃度為0、0. 25、0.5、1mmol/L的IPTG。在16℃、120r/min條件下誘導12h。取2ml。菌液25℃、2500r/min離心10min，棄上清，加入40uL的2×SDSloading buffer，煮沸5～10min，13000 r/rmn離心5min，取20ul-上清進行SDS-PAGE凝膠電泳。通過考馬斯亮藍（CBB）染色和Western blot檢測蛋白是否表達，并確定最適IPTG濃度。大量誘導表達：將小量誘導已確認表達的新鮮菌液按1：500的體積比加入到2L的LB液體培養基中，加入抗生素Amp至終濃度50ug/mL37℃、200r/min培養至菌液OD600為1．0～1.2，加入終濃度為0.25mmol/L的IPTG，16℃、120r/min誘導12h，25℃、2500r/min離心10min，收集菌體。

1.2.5OsALR2蛋白的純化

His標簽的OsALR2蛋白純化：將4L誘導表達的菌體（10g左右）重懸于100mL裂解液（25mmol/L pH 8.0Tris， 300mmol/L NaCI， 5%甘油）中高壓（1500psi）破碎2次。細胞破碎液18000r/min離心30min，取上清液在Ni-NTA重力層析柱中進行親和層析。使用5個柱體積的洗滌緩沖液（25mmol/L pH 8.0Tris，300mmol/LNaCI，40mmol/l。咪唑）洗滌Ni-NTA中的雜蛋白，用洗脫緩沖液（2 mmol/l。pH 8．0Tris，300mmol/l。NaCI，300mmol/L咪唑）洗脫并收集目的蛋白。

采用UNICORN 6.3控制的AKTA avant色譜系統，通過陰離子交換柱（HiTrap，HP5 mL，Cyti-va）和分子篩進一步純化OsALR2蛋白。AKTAavant純化步驟均在16℃下進行。用2個柱體積的經0. 22um濾膜過濾的超純水清洗陰離子交換柱，再用5個柱體積的平衡緩沖液（20mmol/LpH 8．0Tris-HC1，0.1 mol/L NaC1）平衡陰離子交換柱。用注射器將蛋白質混合物加載到預平衡的陰離子交換柱上。用5個柱體積的洗滌緩沖液（20mmol/L pH8．0Tris-HC1，0.1mol/l NaCI）洗滌陰離子交換柱。在AKTA上設置洗脫程序：洗脫時將低鹽緩沖液（20mmol/LpH 8.0Tris-HC1，0.1mol/IJ NaCI）和高鹽緩沖液（20mmol/L pH 8．0Tris-HC1，1mol/LNaCI）由AKTA混合配置洗脫緩沖液，洗脫時NaCI的濃度線性上升，高鹽緩沖液占比從10%線性上升到70%。再用5個柱體積的過濾超純水和5個柱體積的20%乙醇分別清洗陰離子交換柱。收集紫外信號UV280出峰位置所對應的蛋白，即為目標蛋白。

分子篩純化使用凝膠層析柱superdex 10/300lncrease （24.7mL） （Cytiva）。先用2個柱體積的過濾超純水清洗凝膠層析柱，再用2個柱體積的平衡緩沖液（20mmol/L pH 8．0Tris-HC1，0.1mol/LNaC1）平衡凝膠層析柱。平衡后，通過注射器將600uL經陰離子交換柱洗脫的OsALR2蛋白注入到500uL的上樣環中。再用平衡緩沖液洗脫目的蛋白，收集紫外信號UV280出峰位置所對應的蛋白。

1.2.6包涵體蛋白的變復性

按照1.2.4的方法表達蛋白質。收集菌體，高壓破碎（1500psi）裂解菌液2次后將細胞破碎液18000r/min離心30min，收集沉淀，得到粗制包涵體。使用含有低濃度變性劑的洗滌液[2mol/L尿素，50mmol/IJ，pH8.0Tris， 50 mmol/IJ NaCI，1mmol/L EDTA，0.5% （V/V） Triton X-IOO]重懸包涵體，12000r/min離心10min，重復此清洗步驟3次，去除雜蛋白獲得精制包涵體。使用含有高濃度變性劑的變性液（6 mol/L尿素，20 mmol/L pH8.0Tris， 500 mmol/lJ， NaC1，5mmol/l。咪唑，1mmol/L）對精制包涵體進行溶解變性：用變性液將包涵體重懸混勻，室溫振蕩溶解2h。將溶解變性后的包涵體蛋白溶液加載到預先用變性液平衡的Ni-NTA重力層析柱中，再用復性液（20 mmol/LpH 8.0 Tris， 500 mmol/L，NaCI，5 mmol/l．咪唑，1mmol/L）洗滌層析柱，使包涵體蛋白逐漸復性。最后用洗脫液（20mmol/L pH 8．0Tris，500mmol/L NaCI， 500mmol/L咪唑，1mmol/L）洗脫復性后的蛋白，并用Nanodrop測定蛋白濃度。

1.2.7蛋白活性測定

OsALR2蛋白以NADPH為輔酶，將醛和酮類物質還原成初級和次級醇。通過分光光度計檢測產物吸光度的變化即可分析OsALR2蛋白是否具有酶活性。如果OsALR2蛋白具有酶活性，隨著時間延長吸光度會不斷升高，直至反應完全，吸光度不再變化。如果將OsALR2蛋白加入反應體系后，吸光度無變化，說明OsALR2蛋白無酶活性。OsALR2蛋白酶活性測定反應體系：1mL的反應液[50mmol/L，pH 7.4的K3PO40.1 mmol/L，NADPH，10mmol/L，苯甲醛（濃度分別設置為2.5、5．0、7.5、10、15、20mmol/L）]和100ug的OsALR2蛋白。測定OsALR2以草甘膦為底物的作用活性時，作為初始值，加入OsALR2后每隔30 s測定并記錄OD340，共測定3min。所有測量重復3次，陰性對照中用緩沖液75 mmol/L Tris-HCl（pH 8.6）取代OsALR2蛋白。

2結果與分析

2.10sALR2蛋白的理化性質分析

水稻OsALR2蛋白由311個氨基酸組成。OsALR2分子量為35kD，理論等電點為5.89。TMHMM預測結果顯示，OsALR2蛋白不具有跨膜螺旋區，不是膜蛋白。DiANNA 1.1 web server分析表明，OsALR2蛋白含有3組二硫鍵，說明該蛋白較易形成包涵體。

2.20sALR2蛋白與草甘膦的分子對接

通過AlphaFold預測得到的水稻OsALR2蛋白的三維結構見圖1a。在NCBI數據庫中檢索，獲得與水稻OsALR2蛋白氨基酸序列一致性最高的蛋白AKR4C9，其PDB ID為6kb1。通過查詢文獻，確定6kbl的小分子配體結合位點的坐標為：AKR4C9（center_x=18.8，center y=13.6，center-Z=34.2），參照該坐標設置OsALR2的對接盒子的位置。對接結果顯示草甘膦配體與AKR蛋白受體對接結果中結合能最低的為-13.4 kcal/mol。草甘膦與OsALR2主要通過氫鍵作用連接：草甘膦磷酸基團的2個羥基分別與Lys253的氨基相互作用，草甘膦磷酸基團的羰基和草甘膦中間的氨基分別與Ser208的氨基和羥基相互作用，草甘膦另一側的羰基分別與Ser204的氨基和羥基相互作用（圖lc）。蛋白與小分子2D相互作用結果進一步證實了小分子與蛋白發生相互作用的氨基酸位點（圖1b）。OsALR2與草甘膦對接結果的可靠性用Ramachandran圖評價，結果顯示93.3%的氨基酸落在允許區域，大于90%，衡量對接復合體中各二面角和主鏈共價鍵作用力等參數的合理性的GFactors各指數均大于-0.5（圖1d），表明對接結果是合理的。ERRAT評價對接結果表明，ERRAT中overall quality factor值為97.03%，大于95%，即對接獲得的結構是高分辨率的（圖le）。用Veri-fy 3D分析對接結果，其中94.53%的殘基對應的3D/ID的平均得分大于等于0.2，殘基比例大于等于80%（圖1f）。綜上表明分子對接獲得的三維結構是合理的。

2.30sALR2蛋白表達與純化

將pET32a-His-OsALR2質粒轉化至表達菌株C43 （DE3）中進行表達。對小量誘導表達的蛋白樣品分別進行Western blot和SDS-PAGE分析檢測。結果顯示：不加IPTG時蛋白表達量極低；在IPTG終濃度分別為0.25、0.5mmol/L和1．0mmol/L時，OsALR2都有表達。后續大量誘導表達試驗使用IPTG的終濃度為0.25mmol/l（圖2a，b）。使用Ni-NTA親和層析柱初步純化His-osALR2蛋白，純化過程的各步驟分別取樣進行SDS-PAGE電泳，結果顯示，細菌裂解液離心后的上清中His-Os-ALR2蛋白較少，且含有較多雜質；而離心后的沉淀中含有較多的OsALR2蛋白（圖2c），說明osALR2蛋白主要以包涵體的形式表達。為了降低上清中可溶性OsALR2蛋白的雜質含量，先后使用陰離子交換柱和凝膠過濾層析柱純化OsALR2蛋白。SDS-PAGE結果顯示OsALR2蛋白經過陰離子交換柱和分子篩純化后雜質含量有所降低（圖2d），但是其純度仍然不足90%，不能滿足后續結晶試驗的要求。

2.4包涵體蛋白的變性，復性及純化

由于破菌離心后的上清中OsALR2蛋白雜質含量高，純度不符合后續試驗要求，而沉淀中含有大量的OsALR2蛋白，我們嘗試將沉淀中的包涵體進行變復性，以獲得大量的有活性的OsALR2蛋白。通過SDS-PAGE分析變復性后獲得的蛋白，結果顯示包涵體變復性后的蛋白與上清中所表達的OS-ALR2分子量大小一致，均為50kD，且蛋白含量較高，雜質較少（圖3a）。根據OsALR2蛋白氨基酸序列預測得到的理論分子量為35kD，表達得到的蛋白分子量與理論值差距較大，這是因為在OsALR2蛋白表達載體pET32a的多克隆位點（即Os-ALR2基因的插入位點）的上游有一個TrxA tag。TrxA tag與下游目標蛋白融合表達，且其分子量為20.4kD左右，所以OsALR2蛋白在SDS-PAGE上的表觀分子量為TrxA與OsALR2融合蛋白的分子量總和。為了檢驗包涵體復性后所得到蛋白的結構均一性，我們使用分子篩對復性后的蛋白進行純化。分子篩結果顯示在洗脫體積62mL處出現單一的尖銳的峰，說明包涵體變復性后的蛋白的寡聚狀態較均一（圖3b）。切割SDS-PAGE膠中變復性后的OS-ALR2蛋白對應的條帶，送質譜平臺運用MALDI-TOF/TOF UltraflextremeTM進行分析，根據酶解后所產生的肽段的一級質譜數據，搜索水稻數據庫Swissprot并進行比對，結果證明檢測樣品對應的條帶確實為水稻OsALR2蛋白（圖3c）。

2.5酶活測定

為了測定包涵體變復性后得到的OsALR2蛋白是否具有降解草甘膦的活性。我們首先分析水稻OsALR2蛋白與醛類底物的結合活性，分別在2.5、5.0、7.5、10、15mmol/L和20 mmol/l。等6個不同苯甲醛濃度下測定340 nm處吸光度在3min內的變化，將結果擬合成相應曲線。結果（圖4a）表明，OsALR2蛋白具有醛酮還原酶的活性，能在NADPH作為輔酶的條件下將苯甲醛還原成苯甲醇。為了測定OsALR2蛋白降解草甘膦的活性，在含OS-ALR2蛋白的反應體系中加入0.5mmol/L的草甘膦并測定30min內OD340變化值。結果顯示，隨時間延長OD340值增加，這說明OsALR2蛋白可以在NADPH作為輔酶的條件下與草甘膦發生反應，使OD340升高，即以草甘膦為底物時OsALR2具有酶活性（圖4b）。

3結論與討論

草甘膦是農業生產上應用廣泛的高效廣譜除草劑，但是草甘膦與水稻OsALR2蛋白的相互作用機理尚不清楚。本文通過生物信息學分析研究了水稻與草甘膦的作用方式。結果顯示，OsALR2理論等電點為5.89，為后期純化蛋白時選擇陰離子交換柱還是陽離子交換柱提供了理論依據；消光系數為1.859，結合蛋白在280nm處的吸光度（OD280）利用公式OD280/消光系數計算蛋白的實際濃度；不穩定因子為42.75，說明蛋白較不穩定，在菌體破碎過程中可加入適量的甘油和合適的還原劑以減少蛋白的降解。OsALR2蛋白含有3組二硫鍵，推測其很大程度上會形成包涵體。

純化水稻OsALR2蛋白遇到的難題是OsALR2以包涵體形式表達。重組蛋白在大腸桿菌中異源表達時經常生成不可溶的和沒有活性的蛋白聚集體，通常稱作包涵體。當蛋白表達量超過細胞蛋白質總數的2%時，易導致包涵體的形成。另外，目的基因的高拷貝、強啟動子和高濃度誘導劑都有利于包涵體的形成。目的基因拷貝數過高會使細胞損耗過高，當細胞有一個強大的啟動子系統時，重組蛋白的產生會使細胞代謝負荷水平提高，從而聚集成包涵體。包涵體的形成也依賴于蛋白質的氨基酸序列，疏水性氨基酸較多也會形成包涵體。此外，胞質伴侶ClpB的缺失也會導致蛋白的不溶性表達。常通過以下方法從包涵體中獲得有活性的蛋白：1）裂解細胞；2）去除細胞壁和膜組分；3）使用強變性劑溶解蛋白聚集體；4）伴隨著還原型的半胱氨酸殘基氧化成正確的二硫鍵，變性的蛋白正確折疊成天然構象。包涵體變性再復性后是否具有活性還受以下因素的影響：首先是變性劑的選擇，常用的變性劑有尿素和鹽酸胍，尿素有使用范圍廣，溶解力較溫和，成本低，可用于多種色譜法純化等優點；鹽酸胍作為強變性劑，溶解時間短，但是不利于蛋白的共價修飾，且成本高，在酸性條件下易沉淀，對蛋白的離子交換色譜有干擾。所以本文選用尿素作為OsALR2包涵體的變性劑。此外，大腸桿菌的外膜蛋白OmpT具有蛋白水解酶的活性，在包涵體變復性中可能引起重組蛋白的降解，所以必須經過低濃度尿素重復洗滌以清除包涵體蛋白的膜組分。試驗證明OsALR2包涵體蛋白復性后具有醛酮還原酶活性和降解草甘膦的活性，且分子篩凝膠過濾層析結果顯示蛋白的寡聚狀態均一，這使得我們得到了較高純度和濃度的OsALR2蛋白，有利于后續蛋白結晶。

綜上，本研究首先通過生物信息學分析，分子對接表明了OsALR2的基本理化性質及OsALR2與小分子的作用位點，為試驗設計提供方向；其次成功對OsALR2包涵體進行變復性，并證實了包涵體復性后的OsALR2具有降解草甘膦的酶活性，為后續蛋白與小分子的共結晶和闡明草甘膦的作用機理奠定了基礎。但是驗證包涵體變復性后的蛋白折疊的結構和寡聚狀態的均一性時，僅用分子篩的峰圖這一種方法判斷是不夠的，如果結合動態光散射，交聯后跑蛋白膠以及分析超離等多種方法加以論證會更加可信。