黑殼楠染色體核型分析及基因組Survey預測

逯久幸, 劉燕, 許朵朵, 陳鵬, 李永華, 劉紅利

(1.河南農業大學風景園林與藝術學院,河南 鄭州 450002; 2.河南省優質花卉蔬菜種苗工程技術中心,河南 鄭州 450002)

黑殼楠(Linderamegaphylla)屬樟科山胡椒屬,是優良的常綠闊葉喬木。據中國植物志記載,黑殼楠為中國特有樹種,主要分布于陜西、甘肅、湖北、湖南、江西、福建、四川、貴州、云南、廣東等。黑殼楠耐陰,原生地主要為山坡、谷地等濕潤稍蔭蔽的地方。在北方的園林中,常綠闊葉類樹木極少,能適應城市綠地環境又具有高觀賞價值的常綠闊葉樹種更為稀缺,所以針對高觀賞價值的常綠闊葉類樹種的引種、育種和推廣非常有價值[1]。黑殼楠樹形優美、四季常青、樹干通直、青翠濃郁、抗性強且能分泌殺菌素起到凈化空氣的作用,又因其木材結構致密,紋理美觀也是重要的用材樹種[2]。黑殼楠以其優良的特性成為河南地區常綠闊葉類樹種推廣的重要候選樹種之一。河南伏牛山南坡、桐柏山和大別山等800 m以下的山坡或溝谷是黑殼楠自然分布的最北緣[3]。據《河南省重點保護植物名錄》記載,野生的黑殼楠已經屬于瀕危植物[4]。前人對黑殼楠的研究主要集中在分泌物的化學成分、栽培措施、繁育方法和栽培技術、群落結構、物種多樣性等方面[5-7],針對黑殼楠細胞遺傳學的研究較少。

熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)最早起源于20世紀80年代,起初是利用放射性元素(同位素)作為標記,后來逐漸發展為以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新型原位雜交技術。它的原理是將DNA(或RNA)探針用特定的核苷酸分子標記,然后將探針雜交到植物組織切片中,再通過熒光染料染色,使特定的核苷酸分子與熒光染料耦聯進而激發熒光,在顯微鏡下就可以觀測獲得目標DNA(或RNA)分子的定位和相對含量。植物中重要的管家基因之一就是核糖體基因,它包括5S rDAN和45S rDAN。45S rDNA基因包含18S-5.8S-26S rDNA基因,3者縱向排列在染色體上[8]。因此,可以通過定位其中1個基因來定位45S rDNA基因在染色體上的分布情況,本研究選用的是18S rDNA基因。這些基因的轉錄產物可以與核糖體蛋白結合組成核糖體。核糖體基因多由高度重復的序列組成,它們在植物中高度保守,并通過串聯重復的方式分布在染色體的某個或多個部位。利用5S rDAN和18S rDAN探針對植物染色體進行熒光原位雜交,可以定位5S rDNA和18S rDAN在染色體上的位置,進而確定植物染色體的倍性和基因組進化情況。

染色體是遺傳信息的載體,對染色體數目、形態和分子特征的分析稱為核型分析[9]。遺傳物質在細胞層面上的表型特征反應在核型上,能揭示物種在染色體層面上的所有特性,為研究物種起源、演化、親緣關系、遺傳進化等問題提供及其重要的細胞學依據[10]。本研究以端粒重復序列、5S rDNA和18S rDNA為探針,通過熒光原位雜交的方法對黑殼楠染色體進行了精細的核型分析,又通過高通量測序的方法對黑殼楠基因組進行了預測。染色體核型分析和基因組預測為黑殼楠染色體定位、物種起源等細胞遺傳學及表觀遺傳學研究奠定基礎,并為進一步良種選育等提供重要的細胞學數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自河南省南陽市西峽縣種苗試驗站野生黑殼楠種子。種子經過3個月沙藏,取露白的種子播種于穴盤中,待幼苗長至15 cm時,取生長旺盛的側根根尖制片。

1.2 染色體制備

剪取側根根尖2～3 cm。將剪好的根用蒸餾水沖洗干凈,放入0.5 mL特制離心管中。在離心管中沖入0.9～1.0 MPa的笑氣(N2O),靜置處理2 h。靜置后立即轉入冰浴,離心管中加入質量分數90%預冷冰乙酸,靜置固定。10 min后取出沖洗,并放入質量分數70%乙醇中保存。制片時先用酶液混合液37 ℃酶解1 h,后用質量分數70%乙醇清洗3次,再用解剖針破碎根尖,震蕩離心棄廢液。再次加入冰乙酸,充分震蕩混勻后,滴入載玻片中央,將染色體標本在普通光學顯微鏡下鏡檢。

1.3 探針制備

端粒探針為末端(TTTAGGG)6探針,5S rDNA和18S rDNA探針分別為標記好的pTa794和pTa71質粒DNA。

1.4 熒光原位雜交

將制好的根尖玻片加入標記好的探針溶液,蓋上蓋玻片,80 ℃熱變性5 min,放入雜交盒中,后放入原位雜交箱,在37 ℃的條件下雜交過夜。室溫清洗玻片2～3次,將玻片吹干。最后加上8 μL DAPI染液,利用熒光顯微鏡觀察拍照。

1.5 染色體核型分析

染色體核型分析依據李懋學等[11]提出的標準進行,以30個中期分裂相的細胞為對象,統計黑殼楠植物染色體數目。選取5個分散良好、圖片清晰的染色體細胞,使用Photoshop圖像處理器統計染色體的長度數據。染色體形態判斷依據LEVAN等[12]的方法,核型對稱性分析依據STEBBINS[13]的標準進行劃分。

1.6 基因組survey測序

基因組survey測序由武漢菲沙基因信息有限公司測序完成。

2 結果與分析

2.1 黑殼楠染色體的核型分析

通過對黑殼楠處于細胞中期分裂相的細胞進行觀察統計,結果發現,黑殼楠染色體數目為2n=2X=24,其染色體核型參數見表1,染色體核型圖見圖1-A,染色體核型模式圖見1-B。對染色體的長度進行統計測量發現,染色體組絕對長度變異范圍為2.92～5.83,相對長度的變化范圍為5.33%～11.11%,相對長度組成的最長染色體與最短染色體的比值為2.09。通過相對長度系數計算獲得黑殼楠相對長度組成(IRL)為2n=6L+6M2+10M1+2S。通過對長短臂的分析發現,黑殼楠的臂比變化范圍為1.08～2.16,臂比大于2的染色體數量百分比為17%,屬于2B型染色體。通過每條染色體臂比的分析最終確定黑殼楠的核型公式為:2n=2X=24=18m(2 SAT)+6sm。其中9號染色體存在1對隨體。

紅色信號為5S rDNA熒光雜交信號位置,綠色信號為18S rDNA熒光雜交信號位置。

表1 黑殼楠染色體核型參數Table 1 Chromosome karyotype parameters of Lindera megaphylla

從黑殼楠的核型模式圖中發現,黑殼楠染色體組共有12對染色體,黑殼楠的組成類型為:9對染色體(1/2/3/5/6/7/8/9/12號染色體)為中部著絲點染色體(m),3對染色體(4/10/11號染色體)為近端部著絲點染色體(sm),通過計算獲得黑殼楠核型不對稱系數(As.K%)為59.49%,染色體整體較為對稱。

2.2 黑殼楠端粒保守序列、5S rDNA和18S rDNA-FISH的定位分析

為進一步確定染色體條數和5S rDNA和18S rDNA在染色體上的分布,以端粒重復序列、5S rDNA和18S rDNA為探針與黑殼楠細胞中期染色體進行雜交。端粒保守重復序列的DAPI染色結果表明,細胞染色體數目為24條,端粒序列位于染色體兩端,未發現染色體異常的細胞(圖2-A)。黑殼楠5S rDNA和18S rDNA定位結果表明,黑殼楠染色體上具有1對5S rDNA雜交位點(紅色信號)和1對18S rDNA雜交位點(綠色信號),4個染色體信號均較強(圖2-B)。5S rDNA雜交位點位于第5號染色體的近中心粒區域,而18S rDNA雜交位點位于第9號染色體的短臂近端粒區域,2對雜交信號的位置接近,這也證明黑殼楠為二倍體的結論,且在9號染色體短臂存在1對隨體。

紅色信號為5S rDNA熒光雜交信號,綠色信號為18S rDNA熒光雜交信號。

2.3 黑殼楠的基因組預測

基于小片段文庫的深度測序,通過K-mer分析,獲取了黑殼楠基因組的基本信息(圖3、表2、表3)。結果顯示,測序共獲得50 201 264 Gb的clean data。通過測序質量評估發現,Q30大于93%,測序錯誤率分布合理,C和G的比例接近,說明測序質量優,符合進一步分析要求。CG含量呈現單峰趨勢(圖3),NT庫對比到黑殼楠的近緣物種DNA上說明取材未有明顯的外源污染(表3)。

圖3 黑殼楠基因組Survey測序數據GC分布圖

表2 黑殼楠基因組Survey測序數據統計Table 2 The genome sequencing data of Lindera megaphylla

表3 質控后數據NT庫對比結果Table 3 Blast results in NT database of row data

基因組survey結果顯示,黑殼楠預估基因組大小為1.38 Gb,測序深度為30倍,雜合率為0.8%,重復序列比例為70%。所以黑殼楠為大基因組,雜合率較高,重復序列多的物種。

3 結論與討論

不同種源染色體存在多態性。本研究結果顯示,南陽西峽的野生黑殼楠的染色體核型為2n=2X=24=18m(2SAT)+6sm,除4/10/11號染色體為近端部著絲點染色體(sm)外,其他均為中部著絲點染色體(m),9號染色體短臂端粒處含1對隨體,未觀測到異性染色體細胞。這個核型結果與采自都江堰的黑殼楠核型一致,但與采自南充的黑殼楠存在差異[14]。陳成斌等[14]研究發現,采自南充的黑殼楠的染色體核型為2n=18m+6sm+3B,含有3～6個不等的B染色體細胞,這種差異的出現可能是由于不同的種源地黑殼楠B染色體存在多態性。盡管如此,3者染色體核型相同,均屬于2B型染色體。根據相對長度系數進行的染色分類,3者存在一定差異。西峽黑殼楠染色體相對長度組成為2n=6M+6M2+10M1+2S,而南充黑殼楠為2n=6M+4M2+8M1+6S,都江堰黑殼楠為2n=6M+4M2+10M1+4S。這種差異的存在可能是由于染色體制片方法的不同而產生的。本研究采用的是酶解去壁滴片法制片,后2者采用的是卡寶品紅壓片法制片。與傳統的壓片法相比,酶解去壁滴片法呈現的染色更加清晰,染色體形態也更加優質。這種方法也廣泛應用在向日葵、薔薇、毛竹等物種上,是更利于熒光定位分析的方法[15-21]。另外,在取樣時間和處理上與3者均不同?？赡芘恼諘r所選擇的細胞染色體回縮的程度存在差異,從而展現在長度上就會不同。另外,后兩者在計算染色體長度時使用的是裁剪法,顯微鏡清晰度較差,精度相對較低;而前者采用的是軟件繪制,高清晰度顯微攝像,精度較高。雖然3者相對長度存在差異,但最終計算獲得的染色體核型不對稱系數卻十分接近,西峽、南充和都江堰黑殼楠分別為59.49%、59.36%和60.35%[14],數值接近50%為較對稱染色體,這也標志著在樟科的進化中,黑殼楠為較為原始的物種。

熒光原位雜交技術以其快速、穩定、特異度高的優點廣泛應用于植物細胞遺傳學研究中。它可以用來構建物種的物理圖譜,鑒定轉基因植株、闡明基因組的結構和進化過程或分析物種親緣關系[22-25]。rDNA是一種精準的分子遺傳學標記,常作為探針應用于熒光原位雜交中。利用rDNA為標記多用于研究植物多拷貝基因的形成和演化、鑒定植物染色體組型、多倍體的起源與非整倍體,還可以研究基因組的進化等問題[26-28]。常見的rDNA有5S rDNA和45S rDNA。45S rDNA與核仁相連,伴隨著隨體的出現,所以其位點的個數也代表了隨體的個數[29]。45S rDNA雜交信號的強度可以間接反應基因拷貝數的多少。5S rDNA標記往往用來鑒定植物的倍性情況[30]。本研究發現,黑殼楠在9號染色體短臂端粒含有1對45S rDNA強雜交信號,位置相同,強度相近。在5號染色體含有1對5S rDNA雜交信號,這也說明黑殼楠45S rDNA在9號染色體上存在1對隨體,基因的拷貝數相近,且染色體未發生重組、變異或者種內雜交等現象,且所檢測野生黑殼楠為二倍體。

基因組survey是在高通量測序的基礎上預測基因組的手段。對基因組的大小、雜合度和重復序列預測對精確的植物基因組測序有重要的指導意義,這種手段已經廣泛應用在樟、四合木、西番蓮等多種植物基因組測序中[31-32]。目前所報道的植物基因組的大小約為63 Mb～127 Gb[33]。在已報道的樟科植物中,樟屬樟樹基因組大小為723.12 Mb,牛樟732.7 Mb,樟科山胡椒屬木姜子1.3 Gb,樟科鱷梨屬為2.24～2.46 Gb[34-37]?；蚪M最大是鱷梨屬植物,最小是樟屬植物。本研究發現,黑殼楠屬山胡椒屬,基因組大小為1.38 Gb,基本與同屬木姜子基因組大小相同,屬較大基因組。黑殼楠基因組的雜合率為0.8%,重復序列比例為70%。說明其屬于高雜合率和高重復率的基因組,這也為下一步基因組測序指明了方向。