兩種康復訓練方案對組織工程腱-骨界面早期愈合的影響*

潘瑋敏，王 兵，劉 民，張明軍，王 剛

(1.西安體育學院 運動與健康科學學院,西安 710068;2.西安工業大學 基礎學院,西安 710021;3.空軍軍醫大學西京醫院骨科,西安 710032;4 體育智能裝備關鍵技術陜西省高校工程研究中心,西安 710068)

前交叉韌帶(Anterior Cruciate Ligamen,ACL)斷裂后關節鏡下采用自體腘繩肌肌腱進行移植重建已成為恢復膝關節穩定性和功能的主要治療方式,然而單純移植肌腱在預制骨隧道內的愈合,即腱-骨界面生物愈合則是制約手術成功重要因素[1-2]。由于骨隧道內骨髓基質干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSC)的存在,組織工程再生技術被應用于促進二者生物愈合。前期本研究小組應用磷酸鈣骨水泥與重組合異種骨粒以適宜比例結合構建了組織工程界面支架CPCXB并將其用于促進ACL重建術后腱-骨界面愈合,結果表明與單獨的磷酸鈣骨水泥相比,CPCXB可有效促進界面的生物愈合[2]。

然而,實踐中術后康復訓練決定了年輕患者,尤其是運動愛好者運動功能恢復的程度?，F階段對于ACL重建術后的康復訓練方案提倡早期進行給予過激康復訓練,避免傳統術后保守制動導致并發癥的產生。但是,不同學者對于早期術后過激訓練方案對于腱-骨界面愈合的影響仍存在爭議[3-5],有研究發現自體腘繩肌肌腱重建術后早期過激的康復訓練會對尚未愈合的腱-骨界面造成不同程度微動,這種微動有可能導致腱-骨界面愈合延遲,影響ACL術后運動功能的恢復[6-9]。本研究設想通過前期構建的組織工程功能界面CPCBX的介入應用使腱-骨間結合更為緊密,有可能降低康復訓練刺激帶來的腱-骨微動發生,從而增強組織工程界面愈合的生物學過程,為組織工程界面的進一步應用奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 組織工程界面生物支架CPCXB的構建

磷酸鈣骨水泥(Calcium Phosphate Cement,CPC)購自上海瑞邦生物材料有限公司,由固相粉末和液相固化液兩部分組成。重組合異種骨粒(Reconstituted Bone Xenograft,RBX)由空軍軍醫大學全軍骨科研究所綜合骨庫提供,主要由經脫脂、脫蛋白的小牛松質骨粒與同源皮質骨中提取的骨形態發生蛋白(Bone Morphological Proteins,BMP)合成。首先將3 mg BMP粉末與直徑大小300 μm左右的松質骨骨粒60 mg復合構建RBX。隨后將RBX骨粒與CPC固態粉末混合后,裝入無菌5 mL注射器中與固化液混合后手動抽吸攪拌均勻后即得糊狀可注射生物界面支架CPCBX[6]。

1.2 實驗動物ACL重建模型構建

選取23只健康成年雄性新西蘭大白兔,體重2.0～2.5 kg,購自空軍軍醫大學實驗動物中心。兔雙側ACL重建懸吊固定模型同前[2],實驗兔采用846復合麻醉劑肌注麻醉(0.3 ml·kg-1體重)后仰位固定消毒后,雙側膝關節前內側縱切口分離,將髕骨向外側脫位切斷翼狀皺襞,屈曲膝關節完全顯露ACL并從兩止點完整切除。在股骨外側髁趾長伸肌肌腱止點處將其截取并剔除肌性部分后作為肌腱移植物,移植物長約3.0～3.5 cm。肌腱兩端應用不可吸收縫線編織縫后留長約10 cm作為牽引線。隨后建立移植骨隧道:脛骨側自脛骨隆突向ACL脛骨原止點打一條直徑2.5 mm骨隧道,通過該骨道再向上、向外、向后至髁間窩外側壁后部;靠近股骨原ACL止點向股骨外髁外側打一條直徑相同的骨隧道。移植肌腱用18G針頭通過牽引線引導通過脛骨及股骨兩隧道,先于股骨隧道外出口縫合、打結、嵌壓于股骨隧道皮質外,于屈膝位30°拉緊,然后自關節腔內的兩個骨道口注入CPCBX生物支架0.5 ml,再在脛骨側縫線縫合收緊在脛骨隧道外口打結嵌壓于脛骨隧道皮質外,待材料凝固后,逐層關閉切口,消毒。術后實驗兔膝關節外不施加固定,自由籠養。

1.3 實驗動物術后分組及康復訓練策略

依據康復訓練刺激方式,術后將實驗兔隨機分為3組:對照組(CON;n=7),持續被動訓練組(CPM;n=8)和CPM+跑臺訓練組(CPM+TD;n=8)。其中CON組實驗期內籠內自由活動,CPM組及CPM+TD組術后第2天分別應用CPM裝置及兔子跑臺(杭州市段公司,中國)進行康復訓練,持續8周,其中CPM裝置參照以往研究制作[7](圖1)。CPM及跑臺訓練各項參數參照以往實驗制定[8-11]。

圖1 兔CPM裝置示意圖

1.4 Micro-CT檢測

訓練刺激持續8周后注射過量麻醉藥(3%戊巴比妥鈉溶液)安樂死處死動物,采集膝關節樣本。組織學分析前置于三維Micro-CT掃描儀(Explore-Loce SP,GE,USA)中檢測,掃描應用largetube_14um_150min_ss規定條件,選擇直徑為3 mm的圓形感興趣區域(ROI)進行三維重建。采用系統自帶軟件(Microview ABA2.1.2,GE)分析、計算ROI腱-骨界面內礦化組織含量(TMC)、骨體積分數(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數量(Tb.N)和骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.5 組織學分析

樣本10%中性福爾馬林液固定3天后,梯度酒精(70%,90%,100%)脫水,聚丙烯酸甲酯(polymethyl metacrylate,PMMA)包埋,Lieca SP 1600硬組織切片機垂直方向連續切片(厚度 150～200 μm),研磨拋光至50±10 μm后作Van-Gieson(V-G)染色,隨后光學顯微鏡(DMLA,Leica)下觀察分析腱-骨界面處愈合情況。

1.6 生物力學測試

去除8個膝關節樣本上所有組織連接,僅保留重建的ACL,使用特殊設計夾具將股骨-移植物-脛骨復合體兩端分別固定于AGS型(Shimadzu Corporation,JAPAN)生物力學檢測儀兩端,以1 N的預載和50 mm·min-1的垂直拉力進行牽拉試驗至肌腱從骨隧道中脫出,此時的牽拉力為腱-骨界面所能承受的最大牽拉力(N)。

1.7 統計學處理

采用SPSS21.0進行統計學處理,定量資料采用均數±標準差(±SD)表示。定量數據采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD法。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 實驗動物整體情況及康復訓練實施

康復訓練被廣泛用于ACL重建術后的治療過程,但是其對組織工程腱-骨界面早期愈合的影響卻少有報道,因此本研究在實驗兔ACL重建術后施加可控且標準化的兩種康復訓練方案觀察其對組織工程腱-骨界面早期愈合的影響(表1)。術后各組實驗兔飲食及籠內活動正常,傷口愈合良好,無動物出現異常死亡。所有動物膝關節術后沒有半脫位、感染或強直情況發生。依據臨床實踐ACL術后康復CPM機(Continuous Passive Motion,CPM)的應用,本研究中CPM組使用CPM訓練器進行8周的膝關節持續被動訓練,訓練的速度從持續2周的3°·s-1到后期調整為10°·s-1,而膝關節屈伸活動度從15°到130°之間逐漸增加,每天治療時間從 10 min遞增至120 min。CPM+TD組則首先應用CPM訓練器進行4周的膝關節持續被動訓練,關節活動范圍經評估達到正常后即開始進行4周遞增跑速的跑臺訓練,依據Meng和Pierce等研究將運動強度設置為低強度范圍(8～10 m·min-1)[12-16]。參與訓練的兩組實驗兔,尤其是CPM+TD組的實驗兔進行跑臺訓練時,均有實驗人員在旁進行監測、輔助及推動鼓勵。8周干預結束后,所有實驗兔的整體狀況良好且膝關節正常。

表1 術后不同訓練刺激方案Tab.1 Different training programs after operation

2.2 Micro-CT檢測及組織學結果

術后通過Micro-CT檢測腱-骨界面新生骨生成及形態結構。實驗結果顯示各組實驗動物膝關節樣本界面間反映新生骨生成的TMC量及BV/TV分數值比較差異具有統計學差異(F=4.458,P=0.022;F=6.703,P=0.005),其中CPM+TD組的TMC及BV/TV值則明顯低于CON組和CPM組(P<0.05),CPM組TMC及BV/TV值則高于CON組(P>0.05)。術后各組樣本腱-骨界面間反映新生骨骨小梁空間形態結構的Tb.Th及Tb.N值比較差異有統計學差異(F=4.458,P=0.022;F=6.703,PV=0.005),其中CPM+TD組的Tb.Th及Tb.N值均明顯低于CON組和CPM組(P<0.05),CPM組Tb.Th及Tb.N值均高于CON組(P>0.05)。而Tb.Sp 值各組之間比較差異則無統計學差異(F=1.383,P=0.269),其中CPM+TD組Tb.Sp 值高于其他兩組(P>0.05)。見表2。

表2 術后各組腱-骨界面Micro-CT檢測結果Tab.2 Results of Micro-CT examination of the tendon-bone interface in each group after operation

術后應用V-G染色觀察界面間隙及界面生成物的情況,進一步對Micro-CT影像學數據進行驗證。如圖2所示,CON組腱-骨界面被新生骨、新生軟骨及形狀不規則的軟骨細胞填充,部分區域仍有CPCBX殘存(圖2(a));CPM組界面間隙較CON組縮小,界面充滿更多新生骨,伴少量CPCBX碎片。界面部分狹窄間隙可發現垂直的膠原纖維(類似Sharpey’s纖維)連接(圖2(b));CPM+TD組中界面盡管也被新生骨、新生軟骨及材料碎片填充,但界面間隙較CON組及CPM組明顯加大,且膠原纖維的方向不一(圖2(c))。

圖2 術后各組腱-骨界面組織光鏡下觀察結果(b:骨隧道;if:腱-骨界面;t:移植肌腱;Von-Gieson 染色,光鏡 ×100)

盡管ACL術后康復訓練方案尚無統一標準,然而研究已證實術后早期啟動適宜康復訓練所帶來的機械應力刺激對于腱-骨界面的早期愈合具有積極作用[17-19]。關節持續被動活動(Continuous Passive Motion,CPM)由于可以緩解疼痛、盡快恢復關節ROM,且有利于移植肌腱再血管化及力學重塑而被廣泛應用于ACL重建術后訓練。研究發現CPM訓練通過膝關節被動屈伸活動產生的移植肌腱與骨隧道壁之間周期性機械應力對ACL 重建術后腱-骨界面愈合有促進作用[10],本研究實驗結果進一步證實CPM訓練刺激對于組織工程界面的早期生物愈合也具有積極作用。訓練8周后CPM組腱-骨界面新生骨量,包括TMC值及BV/TV分數值均高于CON組,同時Tb.Th及Tb.N值也均高于CON組,提示CPM組腱-骨界面新生骨空間結構也優于CON組,這一點組織學結果中也得到驗證,不僅界面間隙較CON組縮小,而且界面充滿更多新生骨。研究已證實適宜機械應力刺激可增強 BMSC的增殖及分化能力[11],本研究術后施加的CPM訓練刺激產生的周期性機械應力一方面可能刺激了骨隧道內BMSC的增殖、分化,另一方面協助了RBX顆粒中BMP的骨誘導作用,進一步促進界面新生骨形成及結構的優化,提高了腱-骨界面的生物愈合。有研究提出CPM產生的周期性適宜機械應力還可幫助骨隧道內更多的BMSC逸出,這一點可能也有助于組織工程界面的再生過程[12]。CPM組雖然組織學結果整體顯示優于CON組,但是Mirco-CT測量的各項結果與未施加訓練刺激的CON組之間差異卻均無統計學意義。分析一方面由于本研究主要關注腱-骨界面的早期愈合,訓練刺激僅持續8周導致,其次CON組雖然沒有施加可控的術后訓練刺激,但是術后實驗兔籠內可進行一定的自由活動,自身體重負重活動造成的機械應力刺激可能對于早期組織工程界面生物愈合也有一定的促進作用。但是組織學結果顯示,CPM組界面間隙不僅較CON組縮小,而且界面充滿更多新生骨,這一點證實適宜的訓練刺激對于組織工程界面的愈合更具促進作用。

ACL術后應用過激康復訓練模式盡管現階段仍有一定爭議,但是大多研究提出ACL術后CPM的被動關節運動可以通過“泵送效應”協助清除關節腔中的炎性介質,而且幫助關節滑液的分泌,促進營養供應[19-20]。而術后主動跑臺訓練是通過關節負重運動中載荷產生的機械生物學刺激,進一步促進關節腔內代謝物和營養物質的運輸,因而ACL術后非負重的CPM訓練結合負重的跑臺訓練對早期腱-骨界面愈合是有益處的[21-22]。本研究依據以往研究設計對CPM+TD組實驗動物術后進行持續4周的CPM訓練后,第5周啟動了漸進性低強度跑臺訓練。但是Micro-CT結果顯示CPM+TD組的TMC及BV/TV值明顯低于CON組和CPM組,而且反映新生骨骨小梁空間形態結構的Tb.Th及Tb.N值均明顯低于CON組和CPM組,而骨小梁分離度Tb.Sp 值雖然與其他兩組之間比較差異無統計學差異,但其值高于其他兩組,提示CPM+TD組界面新生骨量及結構均劣于CON組及CPM組。而組織學結果發現CPM+TD組界面不僅界面間隙較大,而且新生骨也少于其他兩組,且膠原纖維較為雜亂,提示CPM+TD組腱-骨界面的愈合相較CON組及CPM組均呈現一定的延遲。ACL重建術中單純肌腱移植物是以懸吊方式固定于骨隧道出口兩側,且未在ACL本身止點位置,易導致腱-骨界面微動的產生,影響界面愈合。前期我們應用生物支架CPCBX構建組織工程腱-骨界面,術后結果顯示其不僅可增強移植肌腱與骨隧道之間初始生物力學強度,最重要的是作為干細胞黏附載體及其內含生長因子可更有效促進界面新生骨形成,有利于界面的早期生物愈合[2]。在此基礎上我們設想CPCBX可協助減少初始康復訓練刺激產生的微動,促進界面的愈合。然而影像學及組織學結果均提示過早的主動運動介入對于組織工程界面的生物愈合有一定負性作用,分析與過早主動運動介入仍可能增加早期腱-骨界面微動,提高破骨細胞活性,降低界面骨小梁的厚度,不利于界面早期愈合[13-14],因此組織工程界面的運動康復計劃制定仍需進一步研究探索。

2.3 生物力學分析

術后各組膝關節樣本腱-界面間最大牽拉力比較差異(見表3)具有統計學差異(F=4.850,P=0.019),其中CPM+TD組最大牽拉力明顯低于CON組及CPM組(P<0.05),CPM組最大牽拉力則高于CON組(P>0.05)。

表3 術后各組腱-骨界面最大牽拉力

既往研究表明骨形態結構的變化與界面愈合質量呈正相關,而生物力學評估則被認為是界面愈合的重要指標[15]。本實驗應用生物力學測試中的最大牽拉力檢測移植肌腱與骨隧道之間的愈合,可以更客觀的觀察腱-骨界面的愈合,直接反映腱-骨愈合過程。前期我們的實驗結果證實CPCBX構建組織工程腱-骨界面術后6-8周的最大牽拉力均明顯高于空白對照組,提示CPCBX構建的組織工程界面可明顯促進腱-骨間的愈合。本研究最大牽拉力測試結果發現CPM+TD組最大牽拉力明顯低于CON組及CPM組,而CPM組最大牽拉負荷雖然高于CON組,但兩組之間未顯示統計學差異,這與Micro-CT骨量、骨結構指標以及組織學的變化一致,最大牽拉力的增加意味著界面更多的骨生長,移植肌腱與骨隧道之間具有更好的愈合,說明CPM訓練促進界面早期愈合的效果優于CON組與CPM+TD訓練,進一步證實術后不進行康復訓練和過早的主動運動均不利于腱-骨組織工程界面的愈合,尤其是過早主動運動介入訓練策略可能導致組織工程界面愈合不良。

3 結 論

通過持續8周的兩種康復訓練方案,ACL術后組織工程腱-骨界面呈現不同的愈合效果。與不進行康復訓練相比,漸進CPM康復訓練可明顯增加腱-骨界面間的礦化組織含量和骨體積分數,骨小梁形態結構的Tb.Th及Tb.N值也有增高。而與漸進CPM康復訓練相比,4周CPM聯合4周低負荷跑臺康復訓練后組織工程腱-骨界面的礦化組織含量、骨體積分數以及Tb.Th及Tb.N值明顯降低,而且骨小梁分離度Tb.Sp 值則明顯增高。組織學結果則發現漸進CPM康復訓練后組織工程腱-骨界面間隙明顯小于其他康復形式,而且腱-骨界面充滿更多新生骨。生物力學結果進一步驗證了漸進CPM康復訓練后組織工程腱-骨界面最大牽拉力明顯高于其他兩組,提示漸進CPM康復訓練可有效促進界面的早期生物愈合,而術后不進行康復訓練和過早的主動運動均不利于腱-骨組織工程界面的愈合,尤其是過早主動運動介入康復訓練策略可能導致組織工程界面愈合不良。雖然本研究使用的實驗兔康復訓練模型并不完全適用于人類,而且僅對組織工程界面早期愈合進行了觀察,長期影響還有待進一步研究,但是通過兩種康復訓練對已構建的組織工程腱-骨界面的早期愈合影響進行的觀察,進一步為組織工程功能界面在臨床的應用提供了理論依據。