忍冬愈傷組織形成過程轉錄組分析*

陳宏宇,楊 燁,于 瑩,黃 園,孫慶文,冉 飛

(1貴州中醫藥大學藥學院,貴州 貴陽 550025;2貴州中醫藥大學基礎醫學院,貴州 貴陽 550025)

忍冬LonicerajaponicaThunb.是常用的藥用植物,其干燥花蕾或帶初開的花即金銀花,具有清熱解毒、疏散風熱等功效。臨床上用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發熱等癥?，F代藥理學研究表明,金銀花具有抗炎、抗病毒、降血糖、抗氧化、保肝利膽、增強免疫、抗腫瘤細胞、神經保護等功能[1-2]。

組織培養技術在藥用植物資源保護、快速繁殖、遺傳改良和藥效物質提取等方面有廣泛、深入的研究,可用于解決諸如品質退化、種子病菌污染及農藥殘留等問題[3-4]。高通量測序技術用于大規模分析基因表達并識別基因調控通路[5-6]。利用轉錄組測序中的數字表達譜技術,對玉米幼胚胚性愈傷組織誘導過程中3個典型階段樣本進行了分析,識別了大量愈傷組織形成相關基因[7]。通過比較玉米幼胚胚性愈傷組織誘導過程中4個時期樣本轉錄組,并識別microRNA,預測了靶基因與miRNA關系[8]。在小麥胚性愈傷組織形成的3個重要時期取樣,構建轉錄組測序和miRNA測序文庫,篩選了差異表達基因和差異表達miRNA[9]。

植物愈傷組織形成與很多類型的基因有關。利用分子生物學方法,發現ARF10基因的互作蛋白HBI1能促進愈傷組織起始及形成過程,并揭示其與WOX12、TIR1和AXR2等基因的調控關系[10]。利用基因工程驗證了基因改變植物再生和轉化效率[11]。這些研究為揭示植物組織培養技術中愈傷組織形成過程機制提供了重要基礎。

忍冬分子生物學研究取得了較大進展[12],但是忍冬愈傷組織形成過程的分子機制研究相對較少。本實驗對忍冬愈傷組織形成的3個時期分別進行轉錄組測序并比較分析,識別愈傷組織形成相關重要基因,分析調控通路,為進一步研究忍冬愈傷組織形成分子機制提供基礎和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

忍冬6年樹苗購買于山東平邑,經貴州中醫藥大學楊燁鑒定為忍冬(LonicerajaponicaThunb.),取新生莖作為外植體。外植體用75%乙醇消毒30 s,10%次氯酸鈉消毒15 min,無菌水沖洗3次,切成1 cm小段放入培養基(MS+0.5 mg/L 6BA+0.1 mg/L IAA),在恒溫光照培養箱(25 ℃,14 h光照/天)中培養。從出現愈傷組織開始,至第5天(5d)、第10天(10d)和第15天(15d),分別取愈傷組織(圖1),稱取相同的質量,混樣后經液氮冷凍提取總RNA。

圖1 忍冬愈傷組織

1.2 RNA提取與測序

利用Trizol提取RNA,去除DNA,檢查RNA質量和純度后反轉錄,利用Illumina平臺進行測序。原始測序數據利用軟件SOAPnuke[13]去除接頭序列(即接頭污染)、含N堿基大于5%以及低質量讀序(reads)(即質量值低于15的堿基占該reads總堿基數比例大于20%)。利用Trinity程序(v2.0.6)[14]從頭拼接組裝,聚類、拼接和去冗余處理后,得到非冗余單基因(unigene)序列。利用Nr(Non-Redundant Protein Database)、Nt、SwissProt、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)、COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins)、Pfam和GO(Gene Ontology)等數據庫進行基因注釋。

1.3 基因表達與調控通路分析

利用RSEM程序(v1.2.8)[15]的FPKM(Fragment Per Kilo Bases per Million Reads)方法計算基因表達量。利用DESeq[16]計算差異基因,以2個樣本間基因表達差異log2FC大于2倍,且FDR≤0.001定義為顯著差異表達基因(DEG)。利用GO數據庫(Gene Ontology)對差異表達基因進行聚類分析,Qvalue ≤0.05定義為顯著富集。利用KEGG數據庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)對基因進行調控通路注釋,推測基因的生物功能。

2 結果

2.1 測序與注釋

對忍冬3個樣本測序,去除低質量數據后,分別獲得6.29Gb、6.40Gb和6.34Gb的clean data數據,所有樣本Q20均大于97.98%,Q30均大于93.05%。從頭組裝后在3個組織共獲得83 120條長的、非冗余單基因(unigene),其中長度為200～300 bp的單基因數量最多,有14 639個(圖2)。在單基因中識別編碼區,共得到47 263個CDS序列,長度分布在297～13 122 bp之間。利用Nr、Nt、SwissProt、KEGG、COG、Pfam和GO數據庫分別注釋了56 145、46 550、42 628、43 695、44 129、43 410和44 057條單基因,共58 668條單基因,其中7個數據庫均能注釋的基因有23 638個。

圖2 組裝基因長度分布

2.2 差異表達基因分析

由于發育程度不同,愈傷組織形成過程中3個階段樣本的基因表達預計有一定差異。經過計算,與5d樣本相比,10d樣本共有差異表達基因7 026個,其中上調表達3 829個基因,下調表達3 197個基因。類似的,與5d樣本相比,15d樣本共有差異表達基因12 218個,其中上調表達4 726個基因,下調表達7 492個基因。結果說明,隨著忍冬愈傷組織的形成,基因表達模式發生較大變化,而且隨著發育時間的延長,下調基因的數量明顯較多。SERK、LEC2、WUS、AGL15和HBI1等基因與植物愈傷組織形成有關,基因表達量變化見表1。

表1 忍冬愈傷組織形成相關基因的表達量

2.3 基因調控通路分析

利用GO聚類分析對顯著差異表達基因進行功能分類,研究具有相同代謝過程或細胞途徑的基因類群。結果表明,5d樣本和10d樣本之間差異表達基因有39個顯著富集功能聚類,分為3大類:生物過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function),分別有22、2和15個功能聚類。如生物過程中的生物調控有包括GTPase活性激活、生長素分解代謝過程、生長素內穩態、碳水化合物穩態和細胞氧化還原穩態等差異表達基因614個。5d樣本和15d樣本之間差異表達基因有42個顯著富集功能聚類,3大類分別為23、2和17個。如分子功能中的催化活性有包括酯鍵水解酶活性、鳥氨酸氨甲酰轉移酶活性、β-葡萄糖苷酶活性、谷胱甘肽水解酶活性和核苷二磷酸酶活性等差異表達基因4427個。表2列舉了每個類別顯著富集程度最高的5個組。

表2 忍冬愈傷組織形成過程GO聚類分析

利用KEGG數據庫對差異表達基因進行生物學功能分析,推測參與生化代謝或信號轉導途徑基因的相互協調特征。結果表明,5d樣本和10d樣本之間差異表達基因歸屬通路分為5大類:細胞過程、環境信息過程、遺傳信息過程、代謝和生物系統分別有1、2、4、11和1個通路。如“轉運和分解代謝”“信號轉導”“折疊、分類和降解”“定位”“碳水化合物代謝”和“環境適應”等通路富集程度較高。5d樣本和15d樣本之間差異表達基因與前者差異程度類似,基因總數更多。表3為顯著富集的KEGG通路。

表3 忍冬愈傷組織形成過程KEGG通路分析

3 討論

體細胞胚性愈傷組織的形成與發育是一個復雜的過程,包括誘導細胞分裂、胚性潛力誘導和重組體細胞等,其過程可能涉及很多類型的基因表達或抑制。隨著分子生物學快速發展,很多基因的結構和功能逐漸被揭示出來。體細胞胚胎發生受體激酶(Somatic embryogenesis receptor kinase,SERK),富含亮氨酸重復序列,是體細胞胚發生相關類受體蛋白激酶基因。SERK基因最早在胡蘿卜中發現,在胚性愈傷組織感受態階段到胚性愈傷組織球形胚階段均有較高表達,而在非胚性愈傷組織中表達量較低。擬南芥過表達SERK基因明顯提高了胚性愈傷組織的誘導能力。趙玲玲等人克隆了芒屬植物南獲的SERK基因,利用熒光定量PCR證明基因在胚性愈傷組織中的表達量更高,并且隨著愈傷組織的發育過程,其表達量先升高后下降[17]。本實驗利用轉錄組分析了忍冬愈傷組織形成過程的基因表達信息,3個樣本中共識別了4個可能的SERK基因,其中Unigene5295_All在3個樣本中表達量均較高,但在樣本之間差異較小(表1)。LEC基因(Leafy Cotyledon),包括LEC1和LEC2,最早發現于擬南芥。研究表明,當LEC基因發生突變時,擬南芥胚胎無法形成。本實驗識別了7個可能的LEC基因,但表達量均相對較低(表1)。WUS基因(WUSCHEL)也與植物愈傷組織形成有關,研究表明WUS功能獲得性突變能促進擬南芥體細胞轉變為胚性細胞。本實驗識別了7個可能的WUS基因,Unigene1500_All和CL5416.Contig1_All表達量相對較高,CL5416.Contig2_All在愈傷組織形成第3個時期表達量下降(表1)。AGL15基因(AGAMOUS-LIKE15),最初是在擬南芥用于鑒定胚發育的表達基因,在胚發育中表達且蛋白積累達很高,發芽后表達降低。本實驗識別了5個可能的AGL15基因,但表達量均相對較低(表1)。HBI1基因(HOMOLOG OF BEE2 INTERACTING WITH IBH1)與愈傷組織起始有關。王龍等發現HBI1可以調控WOX12等基因,能促進愈傷組織起始及形成過程[10]。本實驗識別了1個可能的HBI1基因,但表達量均相對較低,且在樣本之間差異較小(表1)。

基于高通量測序技術的轉錄組分析在植物愈傷組織形成機制研究中有一定基礎。羅旭等對玉米幼胚胚性愈傷組織誘導過程中3個典型階段樣本進行了分析,與幼胚對照相比,分別識別了4 825、5 119和5 463個差異表達基因,根據KEGG分析,玉米愈傷組織誘導相關基因可能分別集中在脂肪酸生物合成、細胞色素代謝外源性物質等途徑[7]。江舟等比較了玉米幼胚胚性愈傷組織誘導過程中4個時期miRNA與靶基因,并按照調控關系建立了關聯。這個過程中,有78個miRNA可能參與調控,并預測213個靶基因中的14個基因可能參與愈傷組織形成調控[8]。楚宗麗等比較了小麥胚性愈傷組織形成的3個重要時期轉錄組,在3、6和15時間階段,識別了3 181、2 085和1 468個差異表達基因,同時也分別識別了30、33和18個差異表達miRNA[9]。本實驗利用忍冬愈傷組織形成的3個時期,分別進行轉錄組測序,計算獲取差異表達基因的數量和類別,推測差異基因的生物調控通路,為進一步研究忍冬愈傷組織形成分子機制提供基礎和參考。