DLBCL患者血Th22細胞、IL-22水平及IL-22對DLBCL細胞株增殖和侵襲的影響

張靈, 范凌, 郝杰, 張陽, 靳艷麗, 高炳華

河北北方學院附屬第一醫院血液科,河北張家口 075000

彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是一種來源于成熟B細胞的侵襲性腫瘤,是最常見的非霍奇金淋巴瘤,約占全部非霍奇金淋巴瘤的30%～40%[1]。DLBCL臨床異質性大,發病機制和發展較復雜,具體機制尚不清楚,探究DLBCL的發病機制、尋找新的治療靶點具有重要意義。大量研究表明免疫細胞在DLBCL發生、發展中發揮重要作用[2]。輔助性T細胞22(helper T cell 22,Th22)是最新發現的輔助性T細胞亞群,由幼稚的CD4+T細胞在白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)以及漿細胞樣樹突狀細胞協同下分化而來,其主要分泌IL-22和TNF-α等細胞因子[3]。其中,IL-22是Th22細胞亞群的主要效應細胞因子。Th22細胞已被揭示在先天免疫性疾病、感染性疾病、慢性炎癥性疾病及腫瘤中發揮重要作用[4],Th22細胞及其細胞因子IL-22與血液病發生、發展密切相關。然而關于Th22細胞及其分泌的細胞因子在DLBCL中作用的文獻報道較少。因此,本文分析DLBCL患者血Th22細胞、IL-22水平及IL-22對DLBCL細胞株增殖和侵襲的影響,為臨床提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇本院2022年1月—2022年12月收治的40例DLBCL患者(DLBCL組),男性22例,女性18例,年齡33～75歲;按照臨床分期分為不同亞組,Ⅰ期7例,Ⅱ期12例,Ⅲ期13例,Ⅳ期8例。納入標準:①符合《淋巴漿細胞淋巴瘤/華氏巨球蛋白血癥診斷與治療中國指南(2022年版)》[5]診斷標準;②患者及家屬簽署知情同意書。排除標準:①由其他淋巴瘤轉化而來的、原發縱隔的、原發中樞的、原發皮膚的DLBCL,有其他惡性腫瘤史;②心腦血管、肝、腎、自身免疫性疾病及造血系統其他嚴重原發性疾病;③幽門螺桿菌、巨細胞病毒、乙肝病毒感染。同期選取40例體檢健康成年人為對照組。兩組性別、年齡比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經本院倫理審查委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器

人淋巴細胞分離液購自美國Sigma-Aldrich公司;CD4-PerCP、γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)-FITC、IL-22-PE、IL-17-Alexa Fluor抗體由eBioScience公司提供;酶聯免疫試劑盒由英國Abcam公司提供;人DLBCL細胞株SU-DHL-4和TOLEDO購自中國科學院北京細胞庫;胎牛血清由美國Gibco公司提供;RPMI-1640培養基由瑞士Lonza公司提供。二氧化碳細胞培養箱由上海力康公司提供;流式細胞儀由美國貝爾曼庫爾特公司提供;酶標儀由美國Thermo公司提供。

1.3 流式細胞術檢測Th22細胞亞群

DLBCL組新診、化療前后,以及復發者于來院第2日清晨空腹取外周血;對照組于體檢當日取外周血。每管加入等體積PBS稀釋,稀釋后的血液加入到人淋巴細胞分離液中,采用密度梯度離心法分離出單個核細胞,PBS沖洗并沖懸,加入CD4-PerCP、IFN-γ-FITC、IL-22-PE、IL-17-Alexa Fluor抗體染色,4 ℃避光孵育30 min,采用流式細胞儀檢測分析CD4+IFN-γ-IL-17-IL-22+(Th22)細胞占CD4+IFN-γ-T細胞的比例。

1.4 ELISA法檢測IL-22水平

對照組于體檢當日取外周血,DLBCL組于入院第2日清晨空腹取外周血,離心10 min取上清液。按照ELISA試劑盒說明書測定IL-22蛋白水平。

1.5 細胞培養

將人DLBCL細胞株SU-DHL-4和TOLEDO置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中,37 ℃、5%CO2培養,取處于對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.6 MTT實驗檢測細胞增殖

將SU-DHL-4、TOLEDO細胞分別以1×105個/孔接種于96孔板,干預組每孔加入150 μL不同質量濃度的IL-22(0、50、100、150、200 μg/L),對照組加入相同體積培養基。孵育48 h后每孔加入50 μL 0.25 g/L MTT,37 ℃孵育4 h后,加入200 μL DMSO,用酶標儀在570 nm波長處讀取每孔光密度(optical density,OD)值。

1.7 Transwell實驗檢測細胞侵襲

用基質膠包被Transwell小室底部膜的上室面,4 ℃風干,使用前進行基底膜水化。SU-DHL-4和TOLEDO細胞中加入200 μg/L IL-22培養48 h,對照組未經IL-22處理。隨后將1×105個細胞加入上室,含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基600 μL加入下室,37 ℃、5%CO2培養24 h。顯微鏡下觀察過膜細胞并將其用乙酸漂白染色,結晶紫洗脫,觀察細胞并進行細胞計數。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 各組外周血Th22細胞比例、IL-22水平的比較

與對照組比較,DLBCL組外周血Th22細胞比例和IL-22水平升高(P<0.05;圖1和表1)。與臨床分期Ⅰ～Ⅱ期比較,Ⅲ～Ⅳ期DLBCL患者外周血Th22細胞比例和IL-22水平升高(P<0.05;表1)。

表1 各組Th22細胞比例及IL-22水平的比較

圖1 流式細胞術檢測Th22細胞比例

2.2 化療前后、復發和新診DLBCL患者Th22細胞比例的比較

檢測10例DLBCL患者化療1～2個周期后外周血Th22細胞比例發現,化療后Th22細胞比例低于化療前(P<0.05;圖2A)。檢測9例復發DLBCL患者的Th22細胞比例發現,復發患者的Th22細胞比例高于新診患者和對照組(P<0.05;圖2B)。

圖2 化療前后、復發和新診DLBCL患者Th22細胞比例的比較a為P<0.05,與治療前或對照組比較。

2.3 IL-22對DLBCL細胞增殖的影響

IL-22作用48 h后,SU-DHL-4和TOLEDO細胞增殖OD隨IL-22質量濃度的增加而增加(P<0.05;圖3),這說明IL-22能促進DLBCL細胞增殖。對OD值進行線性分析(圖3虛線)發現,TOLEDO細胞增長變化斜率大于SU-DHL-4細胞,提示IL-22對TOLEDO細胞的促增殖作用可能大于SU-DHL-4細胞。

圖3 IL-22對DLBCL細胞增殖的影響a為P<0.05,與同細胞0、50 μg/L比較;b為P<0.05,與同細胞100 μg/L比較。

2.4 IL-22對DLBCL細胞侵襲的影響

Transwell實驗結果表明,與對照組比較,IL-22組SU-DHL-4和TOLEDO細胞侵襲數目明顯增加(P<0.05;表2),提示IL-22能夠促進DLBCL細胞侵襲。

表2 IL-22對DLBCL細胞侵襲(細胞數目)的影響

3 討 論

DLBCL是一組在基因學、形態學、臨床特征、治療及預后上都具有非常大異質性的侵襲性腫瘤[6]。DLBCL在中位年齡為70歲的老年患者中更為普遍,但也發生在年輕人中,很少發生在兒童中[7]。臨床上,大多數患者表現為一個快速增長的腫塊,涉及一個或多個淋巴結和結外部位[8]。目前,DLBCL的常規治療方案是利妥昔單抗聯合CHOP化療,但仍有部分患者出現難治和復發的情況[9]。因此,對DLBCL發病機制的研究是必要的,這將為DLBCL的治療提供理論基礎和臨床指導。

了解免疫系統如何影響腫瘤的發生和發展仍然是腫瘤學中最具挑戰性的問題之一。Th22細胞被定義為CD4+IFN-γ-IL-17-IL-22+細胞,與已知的Th1和Th17細胞亞群比較,Th22細胞是一種新發現的獨立的Th細胞亞群[10-11]。研究發現,Th22細胞在腫瘤中起著重要作用,Th22細胞能夠激活肺癌JAK-STAT3/MAPK/AKT信號通路,促進腫瘤細胞增殖和遷移[12]。此外,Th22細胞也與胰腺癌、結直腸癌的不良預后有關[13-14]。本研究發現,與健康個體比較,DLBCL患者外周血Th22細胞比例顯著升高,說明Th22細胞可能參與DLBCL的發生、發展。

在胃癌和宮頸癌中,Th22細胞比例增加與疾病的進展相關,并預示著較差的生存率[15-16]。本研究發現,Th22細胞比例增加與DLBCL患者較差的化療效果相關。除此之外,本研究發現,與Ⅰ～Ⅱ期比較,Ⅲ～Ⅳ期DLBCL患者外周血Th22細胞比例和IL-22水平升高。綜上,外周血Th22細胞比例可作為DLBCL患者臨床療效及預后的預測因子。

為了研究IL-22對DLBCL細胞的作用,本研究進一步設計了體外實驗發現,IL-22能夠促進DLBCL細胞增殖和侵襲,這與文獻[17]研究結果一致,文獻[17]發現,胰腺癌中IL-22通過活化STAT3通路促進癌細胞增殖、遷移和侵襲。因此,IL-22在DLBCL中具有促瘤效應,而不具有抗腫瘤的免疫功能。此外,本研究發現,TOLEDO細胞比SU-DHL-4細胞對IL-22更敏感,這說明IL-22對非生發中心來源DLBCL的促瘤作用更強。阻斷IL-22可作為DLBCL患者的潛在治療靶點。

總之,DLBCL患者外周血Th22細胞比例及IL-22水平升高,Th22細胞比例與DLBCL患者臨床分期及對化療的反應有關;IL-22能夠促進DLBCL細胞增殖和侵襲,提示Th22細胞及其細胞因子IL-22可能促進DLBCL的發生發展,Th22細胞可作為DLBCL患者臨床療效及預后的預測因子,本研究為臨床DLBCL藥物研發、治療及預后提供新策略。