不同種源福建柏葉精油得率及成分分析

陳美璇, 黃 霞, 李秉鈞, 榮俊冬, 鄭郁善, 陳禮光

(福建農林大學 林學院,福建 福州 350002)

福建柏(Fokieniahodginsii),又名建柏、滇柏,是國家二級保護瀕危植物,主要分布于越南以及中國西南部、南部至東部,以福建中部最多。始載于《經濟植物手冊》,據《中華本草》摘錄福建柏心材含揮發油,以其心材作藥材基源,具有行氣止痛、降逆止嘔的功效[1]。目前關于福建柏精油的研究主要集中于葉精油成分及其生物活性,主要采用水蒸氣蒸餾法提取,并利用GC-MS對其成分進行分析,但前人的研究結果存在較大差異。潘炯光等[2]研究發現精油得率為0.5%,主要成分為α-蒎烯(24.89%)、檸檬烯(8.46%)、石竹烯氧化物(4.01%);張艷平等[3]研究得出福建柏精油的主要成分為β-橙椒烯(22.514%)、τ-杜松醇(19.883%)、石竹烯(10.133%)、γ-畢澄茄烯(8.307%)和α-杜松醇(5.519%);盧鈺鐸等[4]研究得出精油得率為0.12%,密度為0.736 g/mL,主要成分為α-蒎烯(29.25%)、馬鞭烯醇(10.88%)和石竹烯氧化物(9.64%),精油對白紋伊蚊和致倦庫蚊都有很好的毒殺作用,其生物活性與精油中所含的化學成分α-蒎烯和石竹烯氧化物有關;黃霞等[5]對福建柏不同部位的精油成分和含量進行了分析研究,發現福建柏葉精油和福建柏心材精油成分存在很大差異?，F如今柏科植物精油早已廣泛應用于醫藥、化工、農藥等領域,福建柏所產生的揮發性氣體具有一定的保健效果,福建柏葉精油雖然已逐漸用于化妝品[6]和滅蚊產品,但其康養效果和生物活性的研究仍具有深入研究的價值,在社會市場的開發應用中具有極大潛力。本研究采用超聲波輔助的水蒸氣蒸餾法提取不同種源的福建柏葉精油,通過GC-MS對精油的成分進行檢測,對精油的得率、感官性狀、成分及其GC含量進行分析比較,探究不同種源福建柏葉精油含量及其成分的差異性和相關性,篩選出更有應用價值的福建柏種源,以期為福建柏工業原料林營造和產業化生產提供參考,為福建柏葉精油開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

福建柏(Fokieniahodginsii(Dunn) A. Henry et H. H. Thomas),鮮葉于2020年9月24日采自福建省安溪豐田國有林場,福建柏種源試驗林(4年生)。選擇中坡位、生長良好的標準木5株,將每株葉子分上、中、下3部分,各層取500 g混合后作為精油提取原料。無水硫酸鈉,分析純;正己烷,色譜純,麥克林生化科技有限公司。

2010QP-PLUS氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)儀,日本島津公司;超聲波提取機,濟寧天華超聲儀器有限公司;0.45 μm的尼龍濾(Nylon)膜,天津市津騰實驗設備有限公司;5 mL揮發油量管。

1.2 原料預處理和精油提取

新鮮福建柏葉-80 ℃冷凍保存,避免反復凍融,取出粉碎至粒度基本一致,取100 g放入1 000 mL圓底燒瓶,加入一定量去離子水,超聲波處理一定時間后,加熱至沸騰,再保持微沸,進行水蒸氣蒸餾。收集提取液上層油狀物質,無水硫酸鈉干燥。所得淡黃色透明油狀物,低溫4 ℃暗保存備用。

1.3 精油提取工藝優化

在查閱文獻及預實驗基礎上,以福建泉州安溪種源福建柏葉為原料,超聲波功率240 W,按1.2節方法提取精油。通過單因素試驗考察提取時間(沸騰后開始計時,2、 4、 6、 8、 10 h)、超聲波處理時間(10、 20、 30、 40、 50 min)、液料比(3∶1、 4∶1、 5∶1、 6∶1、 7∶1,mL∶g,下同)對福建柏葉精油得率的影響。在單因素試驗基礎上,進一步通過正交試驗優化提取工藝條件。

1.4 精油成分GC-MS分析

取100 μL的精油溶于1 mL正己烷,過孔徑為0.45 μm的Nylon膜,進行GC-MS成分測定,利用譜圖庫自動檢索,結合人工篩選,鑒定出其主要成分,采用Microsoft Excel 2010和SPSS 22.0軟件進行數據分析。

色譜條件:HP-5MS石英彈性毛細管柱(30 m×250 μm ×0.25 μm);載氣為超純氦氣;總流速40 mL/min,柱內流速1.0 mL/min,進樣口溫度250 ℃,進樣量1 μL,分流比為50∶1,GC和MS接口溫度270 ℃。升溫程序:柱溫40 ℃保持1 min,以10 ℃/min的速率升溫至100 ℃,再以20 ℃/min升溫至140 ℃并保持2 min,最后以20 ℃/min的速率升溫至250 ℃后,保持3 min。

質譜條件:電子轟擊能量70 eV,離子源溫度230 ℃,掃描范圍(m/z)15～500,并采用峰面積歸一化法初步定量。

1.5 得率計算

運用ISO 279—1998(參比法)在20 ℃時測定精油相對密度,以精油得率作為福建柏葉精油產量的評價標準,精油得率(y)計算公式如下:

y=m1/m0×100%

式中:m0—樣品質量,g;m1—精油質量,g。

2 結果與討論

2.1 不同條件對精油得率的影響

2.1.1提取時間 在液料比5∶1、超聲波處理時間30 min、超聲波功率240 W條件下,提取時間對精油得率的影響見圖1(a)。由圖可知,隨著提取時間的延長,福建柏葉精油的得率有所增加,2～6 h增加迅速,6 h后增加變緩,8 h后略有減少?？赡苁且驗榍? h內水分未能完全進入植物細胞,精油未能及時隨蒸汽餾出,蒸餾時間大于8 h后,幾乎無精油餾出,蒸汽還可能導致精油部分成分分解或精油隨之揮發。綜合考慮精油得率、時間成本、能源消耗,提取時間以8 h為宜。

a.提取時間extracting time; b.超聲波處理時間ultrasonic treatment time; c.液料比ratio of liquid to material圖1 不同條件對精油得率的影響Fig.1 Effect of different conditions on the yield of essential oil

2.1.2超聲波處理時間 在液料比5∶1、提取時間6 h、超聲波功率240 W條件下,超聲波處理時間對精油得率的影響見圖1(b)。由圖可知,隨著超聲波處理時間的延長,精油得率也有所升高,超聲波處理時間30 min時,得率達到最高值,隨后緩慢降低。超聲波處理時間過短,福建柏葉細胞壁破裂及胞內熱效應程度低,精油無法完全溶出;但超聲波處理時間太長會使溫度升高,可能導致福建柏葉部分成分揮發,造成精油得率降低[7]。這與盧錕等[8]利用超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取藍桉葉精油研究結果相似。故超聲處波處理時間應為30 min。

2.1.3液料比 液料比會影響液體與物料的接觸,合適的液料比能保持物料與水的接觸,水蒸氣能更好地帶出精油[9]。在提取時間6 h、超聲處波理時間30 min、超聲波功率240 W條件下,液料比值對精油得率的影響見圖1(c)。由圖可知,隨著液料比值增大,精油得率增加;當液料比值為4時,精油得率最高;當液料比值增大到5時,精油得率降低,但不顯著(P>0.05);隨著液料比值繼續增大,精油分散在水中濃度會逐步減小,精油得率持續降低。故液料比選擇4∶1。

2.2 正交試驗結果優化

在單因素試驗基礎上,選取提取時間、超聲波處理時間、液料比這3個因素,并加入空白列考察試驗誤差,采用L9(34)正交試驗,以精油得率為評價指標,優化得到福建柏葉精油最佳提取工藝,正交試驗設計及結果見表1。由表1中R值分析可知,RC>RA>RB,說明影響福建柏葉精油得率各因素的主次順序為液料比>超聲波處理時間>提取時間。最優組合為A2B2C1,并通過實驗驗證該組合下福建柏葉精油的得率為0.252%,與正交試驗結果相近,證明正交優化有效。因此,福建柏葉最佳提取工藝為超聲波處理時間30 min、提取時間8 h、液料比3.5∶1。

表1 精油提取的正交試驗設計及結果Table 1 Orthogonal test design and results for extraction of essential oil

2.3 不同種源福建柏葉精油提取結果和性狀分析

由表2可以看出,不同種源的福建柏葉精油得率具有顯著差異(P<0.05)。

表2 不同種源福建柏葉精油得率及感官性質差異Table 2 Difference of essential oil yield and sensory properties of F. hodginsii leaves from different provenances

即使是同省不同市,如2號與1、 3號種源,11號與福建省其他種源的精油得率均存在顯著差異,甚至同市不同縣也可能存在顯著差異如9和10號。前期試驗發現在樹上部(頂部)與下部(靠地面)采摘的葉精油得率相當,中部精油得率相對較少但不顯著。不同種源福建柏葉精油的得率存在顯著差異,同省不同市也存在較大差異,精油得率最高的是福建三明大田(0.290%),廣西來賓金秀精油得率最低(0.153%),精油得率較高者大多精油顏色較淺、澄清、香味較淡,精油得率較低者則反之,這可能是受種源地的不同,精油成分中揮發性萜類物質的含量存在差異,使得精油的氣味和所呈顏色存在差異。

2.4 不同種源福建柏葉精油成分分析結果

2.4.1GC-MS分析 精油經過GC-MS分析后,通過譜圖庫自動檢索,進一步人工匹配篩選出相似度90%以上,且穩定存在的成分,再通過面積歸一法計算得到各化學成分的GC含量。如圖2和表3所示,各種源精油成分相似,主要為倍半烯萜類,但主要成分(GC含量大于1%)GC含量有較大的差異,如在時間為17.5 min左右分離出的化學成分刺柏烯醇僅在種源福建泉州安溪、漳州華安、三明大田、龍巖上杭和龍巖長汀葉精油中大量存在,其余種源未檢出或GC含量遠低于1%;重慶江津種源精油成分與其他種源也有較明顯差異,(+)-表雙環倍半水芹烯和α-杜松醇為獨有的主要成分,β-蓽澄茄烯、β-欖香烯和γ-依蘭油烯的GC含量也高于其他種源,但α-蒎烯、β-蒎烯和β-石竹烯的GC含量遠低于其他種源,其中α-蒎烯的GC含量僅高于廣西來賓金秀。

表3 不同種源福建柏葉精油主要成分GC含量Table 3 GC content of the main components of essential oil of F. hodginsii from different provenances %

圖2 CT(a)和GY(b)種源福建柏葉精油的總離子流色譜Fig.2 TIC of F. hodginsii leaf essential oils from provenances of CT(a) and GY(b)

2.4.2主成分分析 不同種源福建柏葉精油成分的方差分解和載荷矩陣結果見表4。

表4 福建柏葉精油成分指標的主成分分析Table 4 Principal components analysis of essential oil components indexes in the leaves of F. hodginsii

由表4可知,葉精油成分可分為5個主成分,載荷解釋原有變量貢獻率達88.613%。第一主成分貢獻率為29.032%,其中貢獻較大的是α-杜松醇、γ-依蘭油烯、β-杜松烯、β-欖香烯;第二主成分貢獻率為19.530%,其中貢獻較大的是γ-杜松醇、τ-杜松烯和1-辛烯-3-醇,第三主成分貢獻率為19.432%,其中貢獻較大的是β-蒎烯、β-蓽澄茄烯、β-石竹烯;第四主成分貢獻率為10.554%,其中貢獻較大的是β-月桂烯、刺柏烯醇;第五主成分貢獻率為10.066%,其中貢獻較大的是D-檸檬烯。這12個成分影響著不同種源福建柏葉精油質量。

各種源福建柏葉精油在每一主成分上的得分(FAC),計算得到綜合得分(F),結果見表5。

表5 不同種源葉福建柏精油新變量值1)Table 5 New variable values of different provenances essential oil of F. hodginsii

根據得分可直觀反映出各種源地成分差異,可分為含不同主成分類別。得分為正則表示與負荷量表值正相關,為負則為負相關;若同一種源地某主成分得分較高,則表示對該主成分貢獻率較為突出;某主成分最大值所對應的種源為含該主成分最高的種源。不同種源福建柏葉精油主成分及其GC含量綜合得分最高種源地為廣西來賓金秀,與其他種源精油相比其α-蒎烯和β-蒎烯含量較低;綜合得分最低為福建莆田仙游,與其他種源精油相比其α-蒎烯含量較高、β-蒎烯較低。

2.4.3聚類分析 基于不同種源福建柏葉精油主成分采用分層聚類法進行聚類分析。采用離差平方和法利用歐氏距離作為樣品的測度[10-11],每2個樣本間用類間平均聯鎖法鏈接,獲得分層聚類分析圖,結果見圖3。

圖3 14個種源福建柏葉精油聚類樹形Fig.3 Cluster tree diagram of F. hodginsii leaf essential oil obtained from 14 provenances

當歐氏平方距離(NUM)=20時,可將不同種源福建柏葉精油成分聚類為3類:第一類為5號樣品組成,第二類由9號和14號樣品組成,第三類由其余11組樣品組成,表明5號重慶江津種源與其他種源精油成分及其GC含量差異較大,其中與福建福州永泰、福建三明大田、廣西桂林灌陽和廣西南寧大明山這4個種源差異最大。

當NUM=15時,可將不同種源福建柏葉精油成分聚類為3類:第一類由5號樣品組成,第二類由9、 14號2組樣品組成,第三類由其他11組樣品組成。

當NUM=10時,可將不同種源福建柏葉精油成分聚類為6類:第一類由5號樣品組成,第二類由9、 14號2組樣品組成,第三類由2號樣品組成,第四類由4、 12、 6、 10號4組樣品組成,第五類由7、 8號2組樣品組成,第六類由1、 3、 13、 11號4組樣品組成。第六類均為福建、廣西省區內的種源樣品組成,第五、第四和第二類主要為福建省內種源,第三和第一類為單獨的廣西種源和重慶種源。

當NUM=5時,進一步將福建省內9個種源精油成分聚類為7類:只有龍巖長汀與漳州華安、福州閩清與泉州永春各聚為一類,其他福建省的種源地全部分為單獨或與其他省份種源為一類,如廣西桂林灌陽、廣西南寧大明山與福建福州永泰聚為一類,廣西來賓金秀單獨為一類,與廣西另外2個種源葉成分及其GC含量差異較大。

重慶江津福建柏葉精油成分及其GC含量與其他種源差異明顯;福建省內福建柏葉精油成分及其GC含量具有相關性和差異性,龍巖長汀和漳州華安與福建省其他種源相關性較弱,但種源地理位置相近的福建柏葉精油均有較強的相關性;廣西來賓金秀,與其他2個廣西種源精油成分及其GC含量差異性較大;廣西的桂林灌陽和南寧大明山,以及廣東深圳南嶺種源均與福建種源葉精油成分有較強的相關性。

2.5 討論

造成植物體內精油主要成分及其GC含量不同的原因是多方面的,除生長環境(土壤、氣候、季節等)、樹齡、采集部位、采集運輸過程和提取工藝等外在因素以外,植物種源不同也是造成精油主要化學成分及其GC含量差異的主要因素[12-16]。當環境因子一定、正常生長時,基因控制著福建柏葉精油的成分及其GC含量,表明福建柏葉精油主要成分及其GC含量受遺傳基因影響顯著。福建柏葉精油中α-蒎烯的GC含量較高,約占總成分的50%,與松針精油成分相似。松針精油的市場應用很廣泛,因此福建柏葉精油同樣具有很高的研究價值。α-蒎烯是合成香料的主要原料,主要用于合成松油醇、芳樟醇以及一些檀香型香料,也可用于日化產品以及其他工業品的加香,在工業上經常被用于合成潤滑劑和增塑劑。α-蒎烯微毒,高濃度時會對人體造成危害。有研究發現體積分數高于50 mL/L時α-蒎烯對小麥中的害蟲以及玉米中的玉米象和雜擬谷盜有較為理想的殺蟲效果。α-蒎烯還具有抗腺病毒作用,為研發天然、高效、低毒的抗腺病毒藥物提供了科學依據[17]。福建柏葉精油中β-蒎烯的GC含量占總成分的4%左右,有研究以β-蒎烯為原料,經化學反應制備了二氫枯茗酸酰胺等6類共45種新化合物,這些化合物中的大部分具有一定的抑菌作用以及一定的廣譜抗菌性[18]。不同種源福建柏葉精油主要成分中α-蒎烯和β-蒎烯的含量差異較小,相較于其他種源地,廣西各種源地的福建柏葉精油中α-蒎烯和β-蒎烯含量較高,這可能是受種源地遺傳基因的影響。

3 結 論

3.1通過單因素試驗和正交試驗設計優化,得到福建柏葉精油超聲波輔助水蒸氣蒸餾提取的最佳工藝條件為:液料比3.5∶1(mL∶g)、提取時間8 h,超聲波處理時間30 min和超聲波功率240 W。此條件下,精油得率為0.252%。

3.2不同種源福建柏葉精油得率、主要成分及其GC含量的差異顯著,精油得率較高的種源為福建三明大田、廣西南寧大明山、廣西桂林灌陽,主要成分GC含量較高的種源為廣西南寧大明山、福建三明大田、廣東深圳南嶺,影響福建柏葉精油品質的主要成分為α-杜松醇、γ-依蘭油烯、β-蓽澄茄烯、β-欖香烯、β-杜松烯、γ-杜松烯、τ-杜松醇、β-蒎烯、β-石竹烯、D-檸檬烯、刺柏烯醇、β-月桂烯。地理位置相距較近種源間福建柏葉精油成分及其GC含量相關性較強,表明福建柏葉精油得率、化學成分及其GC含量受基因遺傳因素影響顯著,并有穩定遺傳可能。

3.3不同種源福建柏葉精油主成分綜合得分最高種源地為廣西來賓金秀,α-蒎烯含量較低;綜合得分最低為福建莆田仙游,α-蒎烯含量較高。根據福建柏葉精油得率、主要成分GC含量,種源廣西南寧大明山、福建三明大田均為較合適選擇,可用于早期選育品種,其精油成分更具有生產價值,可以為福建柏工業原料林營造和產業化生產提供參考,為福建柏精油開發提供理論依據,從而充分發揮福建柏的應用價值。