桃金娘果實不溶性膳食纖維理化特征及其抗糖基化性能研究

鄧葉俊, 黃立新, 張彩虹, 謝普軍

(中國林業科學研究院 林產化學工業研究所;江蘇省生物質能源與材料重點實驗室;國家林業和草原局林產化學工程重點實驗室;林木生物質低碳高效利用國家工程研究中心;江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心,江蘇 南京 210042)

晚期糖基化終末產物(AGE)是蛋白質的氨基與還原糖的醛基之間自發糖基化反應生成的一類糖蛋白,與糖尿病、尿毒癥、阿爾茲海默癥等的發展密切相關[1]。AGE分為內源性和外源性兩類,內源性AGE是指由生物機體內的蛋白質與還原糖類發生反應形成[2],而外源性AGE主要來源為日常膳食,也被稱為食源性AGE。食源性AGE可通過多種途徑產生,其中食品加工過程中發生的美拉德反應是生成AGE的重要因素[3-4]。食源性AGE被機體吸收后不能完全被人體代謝,易產生蓄積,其在人體內的蓄積對健康具有威脅,易造成人體氧化應激反應,可誘導糖尿病、免疫缺陷等多種疾病的發生[5-6]。因此,抑制食源性AGE的產生,減少AGE在機體內的吸收對于保持人體健康具有重要意義。膳食纖維作為第七大營養素,又被稱為“腸道清道夫”,具有預防腸胃疾病和心血管疾病等生理功能[7],對人體健康起著積極的作用。特別是林源果實的膳食纖維含量高,對AGE抑制能力強[8],富含的不溶性膳食纖維(IDF)具有良好的吸附能力,在捕捉、清除AGE方面具有潛能。桃金娘別名山稔、崗稔、當梨等,是桃金娘科桃金娘屬小灌木,廣泛分布于我國廣西、廣東、海南、福建及云南等地[9],桃金娘的利用價值極高,其根、莖、葉和果均可入藥[10]。桃金娘果實營養成分豐富,除蛋白質、維生素和氨基酸[11]外,IDF質量分數也極高(約為91.77%)[12],可能具有良好的功能特性和生物活性,但目前依然缺乏桃金娘IDF相關的報道。為充分利用桃金娘IDF,并系統探討其在AGE形成過程中的抑制效應,本研究將對制備的IDF理化性質進行表征,評估其在蛋白糖基化各階段的抑制活性,以及吸附已形成AGE的能力,以期為桃金娘IDF的利用提供新思路和理論依據。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

桃金娘(Rhodomyrtustomentosa(Ait.) Hassk.)鮮果,購于廣東省韶關市;透析袋(截留分子質量為100 ku),購于美國Spectrum公司;堿性蛋白酶Alcalase、溶解酶Viscozgme L及氨基胍鹽酸鹽,購于美國Sigma公司;α-1,4-葡萄糖水解酶(糖化霉)、α-淀粉酶、牛血清白蛋白(BSA)、果糖、氯化硝基四氮唑藍(NBT),購于上海阿拉丁公司;其余試劑均為市售分析純。

Five Easy plus型pH計,瑞士梅特勒公司;3400-Ⅰ掃描電鏡(SEM),日本日立公司;F1 Libra熱重(TG)分析儀,德國Netzsch公司;iSO50型傅里葉紅外光譜(FT-IR)儀,美國Thermo Fisher公司;SpectraMax?i3x酶標儀,美國美谷分子公司;Wizard 2.0冷凍干燥機,美國Virtis公司;X射線衍射(XRD)儀,德國Bruker公司。

1.2 桃金娘不溶性膳食纖維的制備

1.2.1預處理 桃金娘鮮果使用榨汁機充分破碎后凍干,再次粉碎后過孔徑0.425 mm篩。桃金娘果粉末采用索氏提取法進行脫脂處理,溶劑為沸程30～60 ℃石油醚,45 ℃下脫脂8 h。脫脂完成后烘干,除去溶劑,獲得脫脂桃金娘果粉末。

1.2.2酶法改性提取 參照Gu等[13]的方法加以調整。取20 g脫脂桃金娘果粉末與600 mL蒸餾水混合均勻后,加入1 mL耐高溫α-淀粉酶后,調節混合液pH值至8.2,于沸水浴下反應1 h。待反應體系冷卻至60 ℃后,加入2 mL堿性蛋白酶水解1 h,隨后加入2 mL糖化酶于60 ℃反應1 h。最后調節體系pH值至5.0,加入Viscozyme L溶解酶2 mL,于60 ℃下反應2 h。反應完成后,于沸水浴下處理10 min對酶進行滅活。冷卻至室溫后,于8 000 r/min下離心10 min,棄去上層清液。使用蒸餾水對沉淀物洗滌2次,離心后獲得下層沉淀物,加水混勻后透析。最后凍干、粉碎,獲得酶法改性提取不溶性膳食纖維(EIDF)。

1.2.3水法提取 水法提取與酶法改性提取過程相似,在與1.2.2節相同的提取溫度、時間以及pH值下,不加入酶進行處理。最后透析、凍干、粉碎,獲得水法提取不溶性膳食纖維(WIDF)。桃金娘IDF的得率可通過式(1)計算:

Y=m1/m0×100%

(1)

式中:Y—桃金娘IDF得率,%;m1—桃金娘IDF質量,g;m0—脫脂桃金娘果粉末質量,g。

1.3 表征分析

1.3.1化學組成分析 使用杜馬斯燃燒法測定桃金娘IDF的蛋白質含量(總氮含量換算為蛋白質含量的換算系數6.25),使用水分測定儀檢測水分,參照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》檢測灰分,脂肪含量通過索氏提取法測定。

1.3.2FT-IR分析 使用FT-IR儀檢測桃金娘IDF的官能團特征。取2 mg干燥的桃金娘IDF粉末樣品,直接使用紅外光譜儀進行檢測,掃描波數范圍為4 000～500 cm-1。

1.3.3XRD分析 取一定量干燥的桃金娘IDF在穩定的X射線衍射條件下檢測。測試條件為電壓40 kV,電流40 mA,特征射線為Cu Kα(λ=0.154 6 nm),測量角度2θ為5°～40°,測定步長為0.02°,掃描速率為2(°)/min。通過Segal法計算IDF的結晶度,公式如下:

Xc=(I002-Iam)/I002×100%

(2)

式中:Xc—桃金娘IDF的結晶度;I002—002面的最大衍射強度;Iam—2θ為18°處的衍射強度。

1.3.4SEM分析 取少量桃金娘IDF粉末于樣品臺的雙面膠上,噴金處理后于SEM下觀察樣品的形貌特征。

1.4 抗糖基化性能分析

1.4.1體外糖基化模型的建立 構建BSA-果糖體外糖基化模型的方法參考Anis等[14]的報道。取500 mg的BSA與25 mg果糖,溶于50 mL質量分數為0.2%的疊氮化鈉PBS緩沖液(10 mmol/L,pH值7.4)中,得到糖基化體系溶液。樣品組加入IDF(2 g/L),同時設置氨基胍為陽性對照組(1 g/L)、糖基化體系溶液為陰性對照?；旌弦?7 ℃孵化反應7天,反應完成后立即離心取上層清液,于-20 ℃冷凍儲藏供后續檢測。

1.4.2果糖胺含量測定 果糖胺是蛋白糖基化的早期產物,采用NBT法[15]測定桃金娘IDF對果糖胺生成的抑制性能。取20 μL的1.4.1節離心后的糖基化體系溶液與180 μL的0.5 mmol/L NBT試劑(于0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液中配制,pH值10.8)混合均勻。37 ℃下反應10 min后,于530 nm下測定吸光度。同時使用1-脫氧-1-嗎啉-D-果糖建立標準曲線,對體系中生成的果糖胺進行定量。

1.4.3羰基化合物含量測定 通過二硝基苯腙(DNPH)法[14]測定羰基含量。取0.5 mL糖基化體系溶液,與等體積0.01 mol/L的DNPH溶液(于2.5 mol/L鹽酸溶液中配制)充分混合后,室溫下反應 1 h。反應完成后加入質量分數20%三氯乙酸溶液0.5 mL,充分混勻后于4 500 r/min下離心5 min。棄去上層清液,沉淀物使用1 mL乙醇/乙酸乙酯(體積比1∶1)溶液洗滌3次。沉淀物溶于1 mL尿素溶液(8 mol/L)后,于370 nm下測定吸光度,羰基消光系數為22 000 L/(mol·cm)。

1.4.4β-淀粉樣蛋白分析β-淀粉樣蛋白含量測定方法參考Ravichandran等[16]的報道。取100 μL糖基化體系溶液與等體積20 mg/L的熒光染料硫磺素T(ThT)溶液充分混勻,室溫下反應1 h后,在激發波長435 nm、發射波長485 nm下測定熒光強度。

1.4.5AGE抑制活性評價 通過測定糖基化體系溶液的熒光強度,評估桃金娘IDF對AGE形成的抑制能力。取200 μL糖基化體系溶液于激發波長370 nm、發射波長440 nm下測定熒光強度,對熒光性AGE的抑制能力通過式(3)計算:

η=(F0-F1)/F0×100%

(3)

式中:η—抑制劑對熒光性AGE的抑制率;F0—陰性對照組的熒光強度;F1—樣品組或陽性對照組的熒光強度。

1.4.6AGE吸附能力評估 建立BSA-果糖體外糖基化模型,方法同1.4.1節,于37 ℃下孵化21天至糖基化體系溶液熒光強度無顯著變化。取5 mL的BSA糖基化體系溶液,分別加入一定量桃金娘IDF,使其質量濃度分別為0、 2、 4、 6、 8、 10 g/L,混勻后于400 r/min搖床振蕩1 h。隨后于4 500 r/min下離心3 min,取200 μL上層糖基化體系溶液于激發波長370 nm、發射波長440 nm下測定熒光強度,同時以PBS緩沖液(10 mmol/L,pH值7.4)替代BSA糖基化體系溶液作為空白組。

1.5 數據處理與分析

所有數據均以3次試驗結果的平均值±標準差(SD)表示,使用Excel軟件進行顯著性差異分析,當P<0.05時表明差異顯著。

2 結果與分析

2.1 桃金娘IDF的理化性質

2.1.1化學組成及提取得率 化學組成對膳食纖維的理化性質具有重要影響,桃金娘IDF化學組成見表1。由表可知,提取方法對桃金娘IDF化學組成具有一定影響,其中WIDF中的水分、脂肪、蛋白質及灰分含量更高。此外,酶法處理對桃金娘IDF提取得率也具有顯著影響,水法提取得率為(75.23±1.49)%,而酶法改性桃金娘IDF提取得率則下降至(67.43±1.75)%。Yu等[17]報道了相似的結果,使用復合酶法改性顯著降低了胡蘿卜廢渣IDF的提取得率。這可能是由于酶的加入導致部分IDF發生水解,IDF含量降低。

表1 桃金娘IDF的化學組成Table 1 The chemical compositions of R. tomentosa IDF %

圖1 桃金娘IDF的FT-IR(a)和XRD(b)圖譜Fig.1 The FT-IR(a) and XRD(b) spectra of R. tomentosa IDF

2.1.3XRD分析 桃金娘IDF的結晶構型特征見圖1(b)。

由圖1(b)可知,桃金娘WIDF及EIDF在衍射角2θ為22.15°附近出現主衍射峰,同時在2θ為16.17°和34.73°出現2個次衍射峰,這些峰表明桃金娘IDF具有纖維素Ⅰ型的X射線衍射峰的特征[22]。WIDF和EIDF的特征衍射峰相似,表明酶法改性處理并未改變膳食纖維的結晶構型。通過Segal法計算獲得WIDF的結晶度為35.72%,而EIDF為29.32%。Liu等[7]報道了相似的結果,這可能是由于酶作用于纖維素的結晶區,導致部分水解的發生,部分纖維素構型由結晶結構轉變為無定形結構。結晶度對膳食纖維的功能特性具有重要影響,一般認為結晶度高的膳食纖維具有較高的抗拉強度和硬度,而結晶度低的膳食纖維往往具有更高的吸附性能[23]。因此,EIDF可能具有更高的AGE吸附能力。

2.1.4微觀形貌分析 桃金娘WIDF及EIDF的微觀結構特征見圖2。如圖2(a)、(b)所示,WIDF主要由無規則棒狀物構成,同時伴有少量的塊狀結構,WIDF的表面相對光滑且結構致密。從圖2(c)、(d)可以觀察到,EIDF中無規則棒狀物顯著減少而塊狀結構增多,這些塊狀結構的表面粗糙、結構松散,同時伴有一定孔洞,表明酶法處理對IDF的微觀結構具有重要影響。Zhang等[24]報道了相似的結果,酶解作用可能造成部分纖維素、半纖維素或木質素發生水解,導致膳食纖維的微觀結構發生較大變化。由于具備結構松散的特性,EIDF的比表面積增加,使其具有更大空間來吸附其他物質。此外,在EIDF表面出現的孔洞能進一步暴露膳食纖維內部結構的疏水和親水基團,進而影響其功能特性。

a.WIDF,×500;b.WIDF,×2 000;c.EIDF,×500;d.EIDF,×2 000圖2 SEM下桃金娘IDF微觀形貌Fig.2 Microstructure of R. tomentosa IDF observed by SEM

2.2 IDF抗糖基化性能表征

2.2.1果糖胺抑制能力 抑制果糖胺的形成是阻止蛋白糖基化的重要途徑,桃金娘IDF對糖基化過程果糖胺形成的抑制活性見表2。由表2可知,相比BSA,糖基化體系中的果糖胺含量均顯著增加(P<0.05),尤其是陰性對照組果糖胺濃度最高,達到(3.47±0.22) mmol/L。氨基胍作為常見的抗糖基化活性物,抑制果糖胺生成活性強,當其用量為1 g/L時,果糖胺的濃度為(1.21±0.11) mmol/L。當EIDF的用量為2 g/L時,果糖胺的濃度為(1.98±0.25) mmol/L;而WIDF用量為2 g/L時,果糖胺濃度為(2.43±0.25) mmol/L?？梢?種方法提取的桃金娘IDF均具有果糖胺抑制活性,其中EIDF的活性更強。

表2 桃金娘IDF抑制糖基化性能1)Table 2 The antiglycation capacity of R. tomentosa IDF

2.2.2羰基化合物抑制能力 羰基化合物是糖基化反應中間階段產物,可誘導蛋白質分子間的交聯,嚴重影響蛋白質的生物學功能[15,25]。由表2可知,羰基化合物在所有BSA-果糖體外糖基化模擬體系中均有生成。原BSA中的羰基僅為(4.78±0.38) μmol/g,而陰性對照組的質量摩爾濃度達到(35.46±0.92) μmol/g,可知BSA上游離的氨基(如賴氨酸、精氨酸及色氨酸等)在糖基化第二階段被大量氧化成為蛋白羰基衍生物。當體系中添加氨基胍或桃金娘IDF后,羰基化合物含量顯著降低。當氨基胍用量為1 g/L時,體系中的羰基為(13.42±0.46) μmol/g。此外,桃金娘IDF能顯著抑制蛋白羰基化合物的生成,其中WIDF用量為2 g/L時,體系中的羰基為(26.42±0.88) μmol/g;EIDF的抑制活性更強,在相同用量下體系中羰基質量摩爾濃度下降至(21.75±1.17) μmol/g?？芍?桃金娘IDF是一種有效的蛋白糖基化抑制劑。

2.2.3β-淀粉樣蛋白抑制能力β-淀粉樣蛋白可改變蛋白的生理活性,有文獻報道β-淀粉樣蛋白與神經退行性疾病和2型糖尿病的發生密切相關[26]。硫磺素T能與β-淀粉樣蛋白結合,產生的熒光強度與蛋白的交聯程度為正相關關系。由表2可知,陰性對照組中β-淀粉樣蛋白含量最高(熒光強度值最大),為原BSA的2.92倍,表明陰性對照組中的BSA糖基化程度高,蛋白分子間交聯度高。然而,加入1 g/L氨基胍后,糖基化溶液與硫磺素T結合后的熒光強度顯著降低,表明氨基胍可有效抑制β-淀粉樣蛋白的形成。此外,桃金娘IDF也表現出良好的抑制活性,當用量為2 g/L時,EIDF抑制β-淀粉樣蛋白形成的能力高于WIDF,加入2 g/L EIDF的糖基化溶液的熒光強度為(5.26±0.14)×106。由此表明,桃金娘IDF可抑制β-淀粉樣蛋白的生成,減少蛋白的交聯。

2.2.4AGE抑制能力 桃金娘IDF抑制AGE的能力見表2。由表2可知,抗糖基化藥物氨基胍的抑制活性最高,桃金娘IDF對熒光性AGE的形成也具有良好的抑制活性,當WIDF質量濃度為2 g/L時抑制率為(11.57±0.36)%,EIDF在相同質量濃度下抑制率達(18.15±0.73)%。EIDF的抑制活性高于WIDF,這可能是因為EIDF的結構更松散,暴露出更多的結合酚,從而能有效抑制AGE的形成。

2.2.5AGE吸附能力評估 游離的AGE可以通過膜擴散的方式吸收進入到機體的循環系統,嚴重危害生命健康[27]。IDF具有優良的吸附性能,可對AGE產生吸附,有望減少AGE在機體內的吸收轉運。桃金娘IDF吸附AGE的能力結果見圖3。由圖3可知,在不添加桃金娘IDF情況下,BSA糖基化溶液的熒光強度為5.77×106,添加桃金娘IDF后,熒光強度降低,表明桃金娘IDF具有吸附AGE的能力,且隨著IDF質量濃度的增加,熒光強度逐漸降低,呈現明顯量效關系。當WIDF質量濃度為10 g/L時糖基化溶液熒光強度降低至4.23×106,可知WIDF吸附了26.69%的牛血清蛋白結合AGE。當EIDF質量濃度為10 g/L時糖基化溶液熒光強度進一步降低為3.85×106,EIDF吸附了33.28%的牛血清蛋白結合AGE?？芍狤IDF吸附AGE的能力更強,這可能與其松散的結構相關,結構松散的EIDF比表面積更大,同時具有的孔洞、裂縫等特征結構可吸附更多的AGE,這與SEM觀察到的結果一致。桃金娘IDF具有AGE吸附能力,表明其具有降低AGE在機體內蓄積的潛力。

圖3 桃金娘IDF吸附AGE性能Fig.3 AGE absorption capacity of R. tomentosa IDF

3 結 論

3.1分別采用水法和酶法改性的方法提取桃金娘果實中的IDF,酶法改性提取的IDF得率為67.43%,稍低于水法提取的IDF得率75.23%;2種提取方法制備的IDF官能團組成相似,但化學組成差異顯著;酶法改性提取的IDF結構更松散,結晶度更低,為29.32%。

3.2桃金娘IDF在蛋白糖基化各階段均具有顯著抑制效應,其中EIDF抑制活性更強。當EIDF質量濃度為2 g/L時,糖基化體系中果糖胺、蛋白羰基分別為(1.98±0.25) mmol/L、(21.75±1.17) μmol/g,β-淀粉樣蛋白熒光強度為(5.26±0.14)×106,EIDF對AGE的抑制率為18.15%±0.73%。

3.3桃金娘IDF具有吸附AGE的能力,其中EIDF吸附能力更強,質量濃度為10 g/L時,可吸附33.28%的熒光性AGE。