HPLC法測定聚維酮碘消毒顆粒中聚維酮K30的含量

李星余，高 洋，馬亞美，孫文霞

(成都大學藥學院，四川 成都 610106)

2019年來，新冠病毒肺炎疫情席卷全球，導致大量人員死亡，因而各類消毒劑廣泛用于公共場所以及家庭的新冠病毒肺炎預防。有文獻研究[1-3]聚維酮碘(PVP-I)可以快速滅活冠狀病毒，并有效減少急性呼吸系統綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV-2)的醫院傳播。PVP-I是元素碘和表面活性劑聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)結合而成的疏松復合物(見圖1)，對于細菌、真菌、病毒、原蟲等都有良好的殺滅作用，不僅可用于外科消毒，還可用于治療燒燙傷、皮膚潰瘍、婦科疾病以及預防與輔助治療性病等。

圖1 聚維酮碘結構式Fig.1 Structure formula of povidone iodine

PVP-I確切的抗菌機制尚未完全明確，應與其能快速穿透微生物細胞壁的能力有關。Schreier等研究發現PVP-I對細菌細胞蛋白和酶的結構和功能有影響，可以通過阻斷氫鍵和改變細胞膜結構來損害細胞功能(見圖2)[4]。PVI-I的多重作用機制可以使其能夠快速殺死微生物和阻止細菌耐藥性的出現。由于其抗菌活性與一些對細胞壁的直接毒性作用相關，而不是通過特定的分子途徑(如抗生素)，耐藥性的發生可能性不大，也鮮有報道。其中PVP起載體和助溶作用，它是一種類似人體血漿蛋白的高分子聚合物，性質穩定，無毒、無臭、無味，具有極好的成膜、粘合、解毒降毒和緩釋的功效。PVP通過氫鍵能與碘的分子緊密絡合，有效降低了碘的腐蝕性和刺激性。目前市場上已有聚維酮碘溶液、凝膠劑、栓劑和軟膏劑等幾種劑型。筆者制備了PVP-I消毒顆粒，攜帶方便，以適用于野外受傷應急處理。為了更好的控制本品的質量，本研究建立了高效液相色譜法測定本品中PVP的含量。

圖2 聚維酮碘的作用機制Fig.2 Mechanism of povidone iodine

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

Waters 2695高效液相色譜儀、Waters empower 3液相工作站，沃特世公司；賽多利斯BS224S型萬分之一天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司；KQ-300E超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司；UPT-II-10T優普超純水機，四川優普超純科技有限公司。

1.2 試藥與試劑

聚維酮K30對照品(批號：BCCF-2694，由Sigma公司提供)，聚維酮碘顆粒(批號：210101，210102，210103，規格：5 g/包，四川大學提供)，乙腈為色譜純(諾爾施公司提供)；水為蒸餾水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適用性

色譜柱為Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，i.d 5 μm)；流動相為乙腈-水(8∶92)；檢測波長為210 nm；流速為0.8 mL/min；進樣體積為20 μL；柱溫為室溫。理論板數按聚維酮K30計算應不低于3 000。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液

取本品10包，混勻研細，稱取細粉80 mg，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，加水適量超聲使溶解，放至室溫，用水稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液

取聚維酮K30對照品60 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加水適量超聲使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，取續濾液作為對照品溶液。

2.2.3 空白輔料溶液

按處方量，稱取空白輔料適量，置100 mL容量瓶中，加水適量超聲使溶解，放至室溫，用水稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，取續濾液作為空白輔料溶液。

2.3 方法專屬性

分別取空白輔料溶液、對照品溶液和供試品溶液各20 μL，照“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，見圖3。結果表明：聚維酮K30的保留時間約為3.5 min，流動相和輔料在主峰處無干擾，聚維酮K30與相鄰雜質峰的分離度大于1.5，符合測定要求，本方法的專屬性良好。

圖3 空白輔料溶液(A)、聚維酮K30對照品溶液(B)和供試品溶液(C)的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of blank adjuvant solution (A)，plasdone K30 reference substance solution (B)and sample solution (C)

2.4 線性關系考察

取聚維酮K30對照品適量，精密稱定，用蒸餾水溶解制備成濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mg/mL的系列工作溶液。照“2.1”項下色譜條件，注入色譜儀，并記錄色譜圖。采用最小二乘法將峰面積(y)對溶液濃度(x)進行線性回歸，得回歸方程為：y=34 459x-199.07 (r=0.999 9)，見圖4。 結果表明：在0.05～1.0 mg/mL濃度范圍內，聚維酮K30的濃度與峰面積線性關系良好。

圖4 標準線性圖Fig.4 Standard linear diagram

2.5 準確度試驗

取空白輔料，按處方量加入聚維酮K30對照品適量，用蒸餾水制成低、中、高三種濃度(0.48、0.60、0.72 mg/mL)的聚維酮K30工作也溶液，每個濃度平行制備3份，按外標法分別測定并計算低、中、高三種濃度的回收率及RSD。結果(見表1)表明高、中、低3個濃度的回收率為98.18%～101.88%，RSD為0.61%～1.34%，符合測定要求，本方法的準確度良好。

表1 回收試驗結果Table 1 Results of recovery test

2.6 精密度試驗

2.6.1 進樣精密度

取聚維酮K30對照品溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，連續進樣6次，記錄色譜圖，峰面積分別為20 398、20 541、20 419、20 455、20 353 、20 241，峰面積的RSD為0.49%(n=6)，表明儀器進樣精密度良好。

2.6.2 重復性試驗

取本品(批號：210101)，按照“2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，精密量取20 μL注入色譜儀，并記錄色譜圖，按外標法計算樣品中聚維酮K30的含量。6份樣品中聚維酮K30的百分含量分別為62.65%、61.98%、 62.13%、 62.52%、63.11%、62.92%，RSD為0.70%(n=6)，表明本方法的重復性良好。

2.7 穩定性試驗

按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，將供試品溶液放置室溫條件下，于不同時間(0、1、2、3、4、6、8 h)分別進樣20 μL，記錄峰面積并計算RSD。結果不同時間點的峰面積分別為17 270、17 362、17 431、17 376、17 078、17 329，RSD為0.72%(n=7)，結果表明供試品溶液在室溫條件下放置8 h穩定性良好。

2.8 耐用性試驗

分別改變色譜柱品牌(Welchrom C18：4.6 mm×200 mm，5 μm、Kromasil C18：150 mm×4.6 mm，5 μm、Hypersil C184.6 mm×250 mm，5 μm)、流動相流速(0.6、0.8、1.0 mL/min)、檢測波長(205 nm、210 nm、215 nm)，其他色譜條件不變，評估測定條件發生微小變動時測定結果不受影響的承受程度。結果在不同品牌色譜柱條件下，聚維酮K30的測定含量分別為62.92%、62.95%和62.32%，RSD為0.64%(n=3)；在不同流速條件下的平均含量分別為61.32%、62.32%和60.48%，RSD為1.22%(n=3)；在不同波長條件下的平均含量分別為61.20%、62.32%和60.42%，RSD為1.97%(n=3)。結果表明本方法的耐用性良好。

2.9 樣品含量測定

取3批聚維酮碘顆粒樣品，照“2.1”項下色譜條件測定，并按外標法計算每批樣品中聚維酮K30的含量。結果各批樣品中含聚維酮K30的含量分別為60.90%、60.50%、61.22%。

3 結 論

隨著局部和全身性抗生素的耐藥性不斷增加，越來越多的證據表明[5]，局部皮膚感染應優先使用消毒劑而不是局部和全身性抗生素治療。作為局部傷口治療的替代品，消毒劑往往對微生物具有殺滅作用，并且比抗生素具有更廣泛的抗菌活性。此外，與大多數抗生素相比，消毒劑針對微生物細胞生物學各個方面的多種作用機制而降低了出現耐藥性的可能性。此外，世界衛生組織最近的一項指南提倡在圍手術期使用良好的消毒劑[6]，同時減少全身性抗生素的使用。臨床上理想的消毒劑應該具有以下性質如殺菌譜廣，有效濃度低，穿透生物膜、壞死組織和焦痂的能力強，獲得性抗性的發生率低，和良好的局部耐受性。在傷口護理中，僅少數消毒劑能夠同時用于感染疾病的預防和治療，其中就包括碘載體和聚乙烯吡咯烷酮碘。

PVP本身無抗菌作用，在生產過程中PVP形成微小包腔載體，將碘離子絡合在微囊的腔體內，形成PVP-I，從而增加碘的溶解性，同時減少揮發性。另外，PVP對細胞膜具有親和作用，能將碘直接引到細菌物胞表面，這對提高碘的抗菌活性有重要意義。目前測定PVP含量的方法包括紫外分光光度法[7]、排阻色譜法[8]等，存在靈敏度不高，操作過程繁瑣等問題，因而筆者根據參考文獻[9]，建立了HPLC-UV法測定聚維酮碘消毒顆粒中聚維酮K30的含量。取聚維酮K30對照品進行紫外掃描(200～400 nm)，在200～230 nm波長處有末端吸收，為減少輔料和其他溶劑的干擾，選用210 nm為檢測波長。本試驗進行了全面的方法學驗證，建立了準確、可靠、專屬性強的測定聚維酮碘顆粒中聚維酮K30的HPLC法，也為其他消毒制劑或藥品中聚維酮K30的含量測定提供思路。