雙氫青蒿素對胃癌SGC-7901細胞凋亡和侵襲能力的影響

劉師兵，董長松，朱文赫，于 洋，林 松，高金昌 （.吉林醫藥學院科研實驗室，吉林 吉林 303；.吉林醫藥學院附屬四六五醫院消化內科，吉林 吉林 303）

雙氫青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素的衍生物[1]，相比于青蒿素，DHA的水溶性更好、生物利用度更高，更容易代謝[2]，且對正常組織細胞的毒性很低[3]。隨著青蒿素類藥物在臨床治療中的廣泛應用，其對多種腫瘤細胞的抑制和殺傷作用也得到了關注。研究表明，DHA 對白血病、肺癌、前列腺癌及乳腺癌等多種腫瘤細胞具有促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞轉移、逆轉腫瘤細胞耐藥性、抑制腫瘤新生血管形成等多種細胞毒作用[3]。DHA 對胃癌細胞是否也有類似作用成為研究的焦點。本研究通過檢測DHA 對胃癌SGC-7901 細胞增殖、形態變化、凋亡數量、侵襲能力以及相關蛋白表達的影響，初步探討DHA 在SGC-7901 細胞凋亡和侵襲方面的作用及其可能機制。

1 儀器與試劑

1.1 研究對象

細胞株：胃癌SGC-7901 細胞由吉林醫藥學院科研實驗中心提供。

主要儀器：LAS X 激光共聚焦掃描顯微鏡（德國Leica 公司）；Microfuge 16 型離心機（Sigma 公司）；MCO-20AIC 二氧化碳培養箱（日本三洋公司）；550型酶標儀（美國BIO-RAD 公司）；MUSETM 細胞分析儀（美國EMD Millipore 公司）；蛋白電泳印跡系統（美國BIO-RAD公司）。

主要試劑：IMDM 培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、Bax、Bcl-2、caspase-3、VEGF（均購自Biosharp 廣州碩譜生物科技有限公司）；CCK-8（北京碧云天生物技術公司）；Hoechst 33258 染液（武漢賽維爾生物科技有限公司）；基質膠（美國Corning公司）。

1.2 細胞實驗

1.2.1 細胞培養與分組

使用含有10%胎牛血清的IMDM 培養基，將SGC-7901 細胞放入恒溫37℃、CO2濃度為5%的培養箱中常規培養，0.25%胰蛋白酶消化傳代，每2 d傳代1 次。根據IC50數據將細胞分為空白組和DHA 低（40 μmol/L）、中（80 μmol/L）、高劑量組（120 μmol/L）。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖活力

取對數生長期的SGC-7901 細胞接種于96 孔板中，用含有10%胎牛血清的IMDM 培養基混勻細胞，接種濃度約為1×104個細胞/孔，每孔終體積為100 μL，常規培養24 h；用DMSO 溶解DHA 為100 mmol/L，再用IMDM 培養基稀釋成不同濃度（25、50、75、100、150 μmol/L），分別加入孔板中，每個濃度重復4 個孔，繼續培養24 h 后棄去培養基；用IMDM稀釋的CCK-8加入孔板中，3 h后使用酶標儀檢測。

1.2.3 Hoechst染色法觀察細胞形態變化

接種細胞于6 孔板中，常規培養24 h；根據分組加入相應濃度的藥物，繼續培養24 h；棄去培養基，加入4%多聚甲醛，常溫下固定10 min。棄去固定液，用0.01 mol/L PBS 液洗3 次，每次間隔3 min。加入終濃度為10 mg/L 的Hoechst 33258 染液染細胞核5 min。用0.01 mol/L PBS 液洗3 次，每次間隔3 min。激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞核形態變化。

1.2.4 Transwell侵襲實驗

選擇生長狀態良好，融合度達70%~80%的細胞，按分組加入相應劑量的DHA，培養24 h。用4 ℃預冷的基質膠與IMDM 按1∶8 的比例進行混合，每個小室滴加60 μL 稀釋后的基質膠并置于24 孔板中，將孔板放入細胞培養箱內聚合3 h。加藥后的細胞用0.01 mol/L PBS 液洗2 次，消化、離心收集，再用無血清的IMDM 混懸并離心（1000 r/inm，3 min），以清洗細胞表面的胎牛血清。細胞計數后，每個小室內加入密度為2.5×105的細胞200 μL，下室加入胎牛血清濃度為15%的IMDM 500 μL。繼續培養48 h 后，進行結晶紫染色。鏡下觀察細胞侵襲情況，每組取5個視野進行拍照、計數，取平均值。抑制率=[1-（穿出基質膠的細胞數/原細胞數）]×100%。

1.2.5 Western blot 法檢測Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和VEGF蛋白表達

取對數生長期細胞，根據實驗分組加入低、中、高濃度的DHA，培養24 h 后棄去培養基，消化、離心收集細胞。加入含有蛋白酶抑制劑（PMSF）的RIPA蛋白裂解液150 μL，超聲細胞粉碎儀超聲細胞2 次，每次3~5 s，4 ℃放置30 min，蛋白裂解液充分裂解細胞后，高速臺式冷凍離心機離心收集上清液。蛋白定量，SDS-PAGE 結束后，將蛋白轉移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，PBST 洗3 次，加入1∶1000 的Ⅰ抗，4 ℃過夜。次日PBST 洗3 次，加入HRP 標記的Ⅱ抗（1∶2000），室溫搖床孵育1.5 h；PBST 洗5 次，ECL 顯色，掃描記錄。以β-actin 作為內參照，采用Quantity One 軟件進行分析處里，以目標蛋白與內參照蛋白的吸光度比值表示蛋白的相對表達量。

1.2.6 流式細胞術

取對數生長的HepG2細胞接種于6孔板中，接種濃度約為2×105個細胞/孔，常規培養24 h，根據不同藥物處理組給藥，繼續培養24 h 后，胰蛋白酶消化并收集細胞，800 r/min 離心5 min 后棄去上清液，加入IMDM 培養液混懸細胞，使細胞濃度約為1×106個細胞/mL，將細胞原液與MUSETM Annexin-V 凋亡細胞檢測試劑1∶1 混勻，避光孵育20 min 后用MUSETM細胞分析儀檢測。

1.3 統計學分析

實驗數據采用（）表示，SPSS 19.2 軟件進行統計學分析處理，實驗數據均重復3 次，組件比較采用單因素方差分析或重復測量方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 雙氫青蒿素對胃癌細胞增殖的影響

CCK-8檢測結果表明，DHA 能夠抑制SGC-7901細胞增殖，隨著給藥濃度的增加，SGC-7901 細胞活力下降，與空白組比較差異具有統計學意義（P<0.05），即細胞增殖活力與濃度呈負相關。計算IC50為（78.89±0.10）μmol/L，見圖1。參考此數據，進行實驗分組，DHA 低、中、高劑量組加藥濃度分別為40、80、120 μmol/L。

圖1 雙氫青蒿素對胃癌細胞增殖的影響Fig.1 Effect of dihydroartemisinin on the proliferation of gastric cancer cells

2.2 DHA對SGC-7901細胞核形態的影響

Hoechst 33258 是一種可以穿透細胞膜的膜透性熒光染料，在嵌入雙鏈DNA后釋放藍色熒光，故正常細胞和中早期凋亡細胞均可著色。實驗結果顯示，低、中、高劑量組的SGC-7901 細胞的細胞核，不同程度地出現固縮和破裂，熒光強度隨藥物濃度增加而增強。見圖2。

圖2 DHA對SGC-7901細胞核形態的影響（200×，bar=50 μm）Fig.2 Effect of DHA on the nuclear morphology of SGC-7901（200×，bar=50 μm）

2.3 雙氫青蒿素對SGC-7901細胞侵襲能力的影響

Transwell 侵襲實驗結果顯示，與空白組相比，各劑量組穿過基質膠的數量明顯減少。相較于空白組88.6%的細胞侵襲率，低劑量組的細胞侵襲率為66.8%，中劑量為54.3%，高劑量僅為11.4%?？梢娊o藥濃度越高，SGC-7901細胞侵襲率越低。見圖3、4。

圖3 雙氫青蒿素對SGC-7901細胞侵襲能力的影響（400×）Fig.3 Effect of dihydroartemisinin on the invasion ability of SGC-7901 cells（400×）

圖4 雙氫青蒿素對SGC-7901細胞侵襲能力的影響Fig.4 Effect of dihydroartemisinin on the invasion ability ofSGC-7901 cells

2.4 DHA 對SGC-7901 細胞Bcl-2、Bax 和cleaved caspase-3蛋白表達的影響

Western blot 法檢測結果顯示，與空白對照組相比，隨著DHA 濃度的增加，Bax 和cleaved caspase-3蛋白表達明顯增加，Bcl-2 和VEGF 蛋白表達顯著降低（P<0.05），見圖5。

圖5 DHA對SGC-7901細胞Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和VEGF 蛋白表達的影響Fig.5 Effect of DHA on the expression of Bcl-2，Bax，cleaved caspase-3，and VEGF proteins in SGC-7901 cells

2.5 DHA對SGC-7901細胞凋亡的影響

使用流式細胞術對不同給藥組進行檢測，結果發現，不同給藥組細胞均有不同程度的凋亡，且凋亡率與給藥濃度成正比，即藥物濃度越高，凋亡率越高。見圖6。

圖6 DHA對SGC-7901細胞凋亡的影響Fig.6 Effect of DHA on apoptosis of SGC-7901 cells

3 討論

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一[4]。國家癌癥中心數據顯示，我國胃癌病例約占所有癌癥病例的9.8%，位居第3；死亡病例約占所有癌癥死亡病例的12.0%，同樣位居第3[5]。如未能早期發現和治療，很難通過手術、化療和放療等方法治愈。腫瘤細胞的侵襲和轉移是影響癌癥治療的最主要原因之一[6]。因此，抑制轉移過程是胃癌治療的新策略[7]。DHA是青蒿素在人體內的活性代謝產物之一[8]，雖已有研究表明，DHA 可以誘導多種腫瘤細胞凋亡，但是DHA 能否誘導胃癌細胞凋亡，并通過抑制胃癌侵襲和轉移發揮抗腫瘤作用尚不完全明確。本研究將不同劑量的DHA 作用于胃癌SGC-7901 細胞，觀察其對SGC-7901 細胞凋亡和侵襲能力的影響。CCK-8檢測結果顯示，DHA 作用SGC-7901 細胞24 h 后，細胞生長受到明顯抑制，且隨著DHA濃度增加，抑制作用明顯增強。采用Hoechst 染色法觀察細胞核的形態改變，激光共聚焦顯微鏡掃描結果顯示，給藥組的SGC-7901 細胞出現明顯的細胞核固縮和致密濃染的形態變化，且有細胞核形態改變的細胞數量，與給藥濃度呈正比。應用Transwell 染色法觀察SGC-7901 細胞侵襲能力的改變，通過拍攝圖片和計數后發現，空白組穿透基質膜的細胞數量明顯增多，即給藥濃度越高，穿透基質膜的SGC-7901 細胞數量越少，可見DHA 對SGC-7901 細胞的侵襲能力有影響。為求證DHA 能夠抑制抑制SGC-7901 細胞的侵襲能力，選擇VEGF 蛋白進行Western blot 檢測。VEGF 是通過血管上皮受體VEGFR 介導的受體信號通路，是HIF-1α 的上調能夠誘導VEGF 基因表達和血管生成，進而促進腫瘤細胞的生長和轉移，是腫瘤細胞能夠轉移和侵襲的基礎[9]。所以，抑制VEGF 信號通路可以有效抑制腫瘤的發生和發展。本實驗結果表明，DHA 能夠抑制VEGF 的表達，且給藥濃度越高，VEGF 蛋白的表達量越低，可見DHA 能夠抑制SGC-7901細胞的侵襲能力。細胞中的促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白間的相互平衡介導細胞凋亡[10]，其中Bcl-2 和Bax 是研究較廣泛的促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白，二者通常在正常的細胞中以二聚體的形式存在，可有效調控細胞的凋亡，且二者的比值介導細胞進入凋亡階段的進程[11]。Bcl-2 表達增加后可結合Bax 形成異源二聚體，通過抑制Bax的活性并抑制細胞凋亡；Bax表達增加時可結合Bax 形成同源二聚體，通過活化caspase-9 酶切caspase-3 酶原，且激活caspase-3 表達對該剪切有促進作用，進而啟動caspase級聯反應，最終誘導細胞發生凋亡[12]。Western blot 檢測結果顯示，與空白組相比，DHA 各濃度組Bax 和cleaved caspase-3 蛋白表達顯著上升，Bcl-2 蛋白表達顯著降低；流式細胞儀結果顯示，各給藥組SGC-7901 細胞凋亡數量較空白組明顯增加，且隨著給藥濃度的上升，細胞的凋亡率也明顯呈上升趨勢?？梢?，DHA 對SGC-7901細胞有明顯的促進凋亡的作用。

綜上所述，DHA 能夠抑制SGC-7901 細胞的增殖，誘導其凋亡，并能減弱SGC-7901 細胞的侵襲能力，表明DHA 對SGC-7901 細胞具有毒性效應，其機制可能與DHA 對Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3 和VEGF 蛋白表達調控有關，但具體的作用途徑與機制還有待進一步研究。