PEG浸種對黃芩種子萌發及生理特性的影響

陳秀靈, 趙春穎, 李季生, 李忠思, 趙紅玲, 李 娜

(1.承德醫學院蠶業研究所,河北省高校特色蠶桑應用技術研發中心, 河北 承德 067000;2.承德醫學院中藥研究所-河北省中藥研究與開發重點實驗室, 河北 承德 067000)

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorigi)屬于唇形科黃芩屬多年生草本植物,根呈圓錐狀,莖叢生,分枝多而細,葉片披針形,為總狀無限花序,種子梯次成熟,成熟期長,具有耐旱、耐寒、不耐澇的生物學特性[1-2]。作為歷史悠久的中國秦嶺五大商藥之一,黃芩為常用大宗中藥材,始載于《神農本草經》,主要以根入藥,主要分布于我國內蒙古、河北、山西、山東、黑龍江及遼寧等省,河北承德為道地產區,俗稱“熱河黃芩”[3-4]。黃芩的主要藥用成分為黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素等成分,在抗菌、消炎、抗腫瘤、抗氧化、止血安胎、瀉火解毒等方面具有重要功效[5-6]。黃芩已被廣泛應用于臨床疾病的治療,約70%的清熱解毒中成藥及配方均含黃芩[6]。近年來,野生黃芩資源因過度采挖日趨減少,逐漸被人工引種栽培代替,但黃芩種子質量良莠不齊,很難滿足規?；a[3,7]。而且,黃芩為短壽命種子,種子活力易喪失,導致種子萌發受阻、田間出苗率低及長勢弱等,不利于黃芩產業發展[8]。因此,研究如何提高黃芩種子萌發能力,對種苗培育以及陳種子的再利用具有重要的現實意義。

種子萌發是植物生命周期中的起始階段,萌發與植物的形態建成和成株狀態密切相關[9]。種子引發是在特定的條件下使其產生“引發記憶”的播前處理技術,能夠改善種子的萌發潛力,提高種子發芽速度、出苗整齊度、幼苗健壯度以及植株抗逆性[10]。聚乙二醇(PEG)不僅可以作為評價種子抗旱能力的重要標志,也是較為理想的種子引發劑,通過滲透調節作用來延長種子吸水時間,以降低電導率和營養物質滲漏,使細胞的修復能力增強,但本身不會滲入活細胞,對種子無毒害作用,從而提高種子活力和萌發能力[11-13]。研究表明,適宜的PEG濃度和分子量引發對茄子、大麥、高羊茅、甜菜、遠志、苜蓿等種子的發芽指標具有明顯的促進作用[13-18]。早期研究表明,PEG引發可能抑制商洛黃芩種子萌發[11],但適宜的黃芩種子PEG引發條件仍需要深入探討。本研究采用正交試驗設計,研究活力水平、PEG分子量、PEG浸種濃度和浸種時間對黃芩種子萌發的影響,為以PEG作為引發劑促進黃芩種子萌發提供科學依據和技術指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃芩種子為2021年10月采集于承德醫學院中藥材種植實驗基地,收獲種子含水量為6.34%,種子初始發芽率水平為60.48%。PEG試劑購自于北京索萊寶科技有限公司,分析純試劑AR級。分別用蒸餾水配制3種分子量(600,2 000和6 000)的不同濃度(5%,10%,20%;質量/體積分數)PEG浸種液,備用。

1.2 試驗方法

1.2.1種子老化

種子置于人工加速老化箱,采用高溫(40 ℃)、高濕(相對濕度80%)處理獲得在活力水平上具有差異的種子。老化1 d和2 d后,分別取出測定,種子發芽率為41.93%和37.49%。

1.2.2種子引發

采用L9(34)正交實驗優化種子引發處理方案,試驗因素與水平見表1。

表1 PEG處理黃芩種子實驗因素與水平

稱取約0.5 g黃芩種子,裝入對應編號的尼龍網袋,將網袋放入種子發芽盒中,用移液器分別量取80 mL不同濃度的PEG浸種液加入到發芽盒中,以三種活力水平的未浸種處理的種子作為對照,分別記為ck1、ck2、ck3。將密封的發芽盒置于室溫(25 ℃)黑暗條件下進行浸種,浸種結束后用蒸餾水沖洗網袋3次,吸水紙吸干表面水分,將種子置于25 ℃、80%相對濕度條件下平衡約5 h。

1.3 指標測定

1.3.1發芽指標

將處理后的種子放入鋪有2層濾紙且對應編號的發芽盒中,加入12 mL蒸餾水,每盒50粒黃芩種子,置于人工氣候箱中培養,培養溫度設為25 ℃(晝/夜),相對濕度為80%,光照12 h/d,光照強度為2 000 lx。 每個處理4個重復,每天記錄種子發芽數,培養至第7天結束。發芽標準按照國際種子協會(ISTA)規定,有明顯的胚根“露白”且胚根長度為種子的1/2認定為發芽[19]。以發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數作為萌發測試分析指標[13,19-20]。

發芽率/%=(發芽終期全部正常發芽種子總數/供試種子總數)×100%,以第7天種子發芽數計算;

發芽勢/%=(規定時期內正常發芽種子總數/供試種子總數)×100%,以第4天種子發芽數計算;

發芽指數(GI)=∑(每日種子發芽數/相應種子發芽天數);

活力指數=發芽指數×平均根苗干重,干重為將7 d后幼苗放入70 ℃恒溫箱烘干48 h后稱重。

1.3.2生理指標

選擇每個活力水平上種子引發處理效果相對較好的組合以及相應的未引發種子,吸干引發種子表面水分,液氮速凍,置于-80 ℃的冰箱保存,用于測定生理指標?？扇苄蕴呛坎捎幂焱壬y定,丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定,總淀粉酶活力采用3,5-二硝基水楊酸顯色試劑盒測定,活性氧含量采用熒光探針檢測試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)測定,總抗氧化能力采用亞鐵還原微板法試劑盒測定?；钚匝鯔z測試劑盒購自上海酶科生物科技有限公司,其余試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 數據分析

對4個測試指標進行極差分析、方差分析和多重比較。處理間平均數差異顯著性比較采用Duncan’s新復極差法,所有數據采用SPSS22.0軟件進行。

2 結果與分析

2.1 PEG引發對人工老化黃芩種子發芽率的影響

4因素的極差大小順序為RC>RB>RA>RD,表明其對發芽率影響作用為浸種時間>浸種濃度>PEG分子量>種子活力(表2)。根據4因素均值最優組合為A1B2C1D1,即PEG分子量為600,浸種濃度為10%,浸種時間為8 h,種子活力為60.48%(表2)。方差分析結果表明, PEG分子量、浸種濃度和種子活力均對發芽率的影響差異達到顯著水平(p<0.05),浸種時間對發芽率的影響差異達到極顯著水平(p<0.01)(表4)。進一步的多重比較顯示,PEG分子量(A)的高低順序為A1>A2>A3,A1顯著高于A3,即在PEG分子量為600時,發芽率最高,其次為2000;浸種濃度(B)的高低順序為B2>B3>B1,B2和B3顯著高于B1,即在PEG浸種濃度為10%時,發芽率最高,其次為20%;浸種時間(C)的高低順序為C1>C2>C3,三水平間存在顯著差異,即浸種時間為8 h時,發芽率最高;種子活力(D)的高低順序為D1>D3>D2,D1顯著高于D2和D3,即當種子處于60.48%的活力水平時,發芽率最高(表4)。與對照相比,當種子活力為D1水平時,僅A1B1C1D1組合對發芽率具有顯著的促進作用,促進程度為15.86%;當種子活力為D2水平時, A1B2C2D2和A2B3C1D2組合對發芽率具有促進作用,促進程度分別為55.28%和62.03%;當種子活力為D3水平時,三種組合均對發芽率具有促進作用,促進程度為34.92%～69.49%,A3B2C1D3組合的促進程度最高(表3)。

表2 PEG處理下三因子的黃芩種子極差分析結果

表3 PEG處理對黃芩種子萌發狀況的影響

表4 黃芩種子萌發方差分析及多重比較

2.2 PEG引發對人工老化黃芩種子發芽勢的影響

4因素對發芽勢的極差順序為RA>RC>RD>RB,表明其對發芽率影響作用為PEG分子量>浸種時間>種子活力>浸種濃度(表2)。根據4因素均值最優組合為A1B3C1D1,即PEG分子量為600,浸種濃度為20%,浸種時間為8 h,種子活力為60.48%(表2)。方差分析結果表明:PEG浸種濃度和種子活力水平對發芽勢的影響差異達到顯著性水平(p<0.05),浸種時間對發芽勢的影響差異達到極顯著水平(p<0.01)(表4)。進一步的多重比較結果顯示,B2和B3顯著高于B1,即在浸種濃度為20%和10%時,發芽勢最高;浸種時間因素的三水平間存在顯著差異,且C1水平最高,即在浸種時間為8 h時,發芽勢較高;種子活力水平為D1時,發芽勢最高,顯著高于D2和D3(表4)。與對照相比,當種子活力為D1水平時,僅A1B1C1D1組合對發芽勢具有顯著的促進作用,促進程度為17.15%;當種子活力為D2水平時,A1B2C2D2和A2B3C1D2組合對發芽勢具有促進作用,促進程度分別為102.32%和132.57%;當種子活力為D3水平時,三種組合均對發芽勢具有促進作用,促進程度為103.95%～153.47%,A3B2C1D3組合的促進程度最高(表3)。

2.3 PEG引發對人工老化黃芩種子發芽指數的影響

4因素對發芽指數的極差順序為RC>RD>RB>RA,表明其對發芽指數影響作用為浸種時間>種子活力>浸種濃度>PEG分子量(表2)。根據4因素均值最優組合為A1B2C1D1,即PEG分子量為600,浸種濃度為10%,浸種時間為8 h,種子活力為60.48%(表2)。方差分析結果表明:浸種濃度對發芽指數的影響差異達顯著水平(p<0.05),浸種時間和種子活力水平對發芽指數的影響差異達極顯著水平(p<0.01)(表4)。進一步的多重比較結果顯示:浸種濃度(B)中B2顯著高于B1,而B3與B2和B1間無顯著差異,即浸種濃度為10%的發芽指數最高;浸種時間(C)中C1和C2顯著高于C3,C1和C2之間無顯著差異,即浸種時間為8 h的發芽指數最高,浸種24 h次之;種子活力(D)中D1顯著高于D2和D3,而D2和D3之間無顯著差異,即種子活力水平為60.48%時,發芽指數最高(表4)。與對照相比,當種子活力為D1水平時,三種組合對發芽指數的促進程度為41.12%～88.24%,A1B1C1D1和A3B3C2D1組合的促進程度相對較高;當種子活力為D2水平時,三種組合對發芽指數的促進程度為99.53%～342.84%;A1B2C2D2和A2B3C1D2組合對發芽指數促進程度較高;當種子活力為D3水平時,三種組合對發芽指數的促進程度為177.04%～332.45%,A3B2C1D3組合的促進程度最高(表3)。

2.4 PEG引發對人工老化黃芩種子活力指數的影響

4因素對活力指數的極差順序為RC>RA>RB>RD,表明其對發芽指數影響作用為浸種時間>PEG分子量>浸種濃度>種子活力(表2)。根據4因素均值最優組合為A3B1C2D3,即PEG分子量為6000,浸種濃度為5%,浸種時間為24 h,種子活力為37.49%(表1)。方差分析結果表明,浸種時間對活力指數的影響差異達顯著水平(p<0.05),而PEG分子量、浸種濃度和種子活力水平對活力指數的影響差異均未達顯著水平(表4)。進一步的多重比較結果顯示:浸種時間(C)中C2顯著高于C1和C3,而C1和C3之間無顯著差異,即浸種時間為24 h的活力指數最高(表4)。與對照相比,當種子活力為D1水平時,三種組合對活力指數的促進程度為71.78%～145.78%,A3B3C2D1組合的促進程度相對較高;當種子活力為D2水平時,三種組合對活力指數的促進程度為108.36%～132.40%,A3B1C3D2和A1B2C2D2組合對發芽指數促進程度較高;當種子活力為D3水平時,三種組合對活力指數的促進程度為86.01%～270.09%,A2B1C2D3組合的促進程度最高(表3)。

2.5 PEG引發對黃芩種子活性氧積累的影響

為進一步探究PEG引發處理對黃芩種子生理的影響,選擇了6個引發效果相對較好的處理組合進行比較分析?；钚匝醴e累在引發處理組間差異達顯著水平,當種子生活力水平為D1時,A1B1C1D1、A1B1C2D1分別較對照降低了20.30%和5.02%,但A1B2C1D1、A1B2C2D1分別較對照增加了7.91%和17.26%,且A1B1C1D1活性氧含量最低;生活力為D2和D3的黃芩種子引發處理(A1B2C2D2和A1B2C2D3)后,活性氧仍處于非常高的水平,且無顯著差異(圖1A)。相對于未引發處理,PEG引發處理能夠降低丙二醛含量,當種子生活力為D1水平時,A1B1C1D1、A1B1C2D1和A1B2C2D1分別較對照降低了16.32%,5.79%和24.83%,A1B2C1D1較對照增加了3.80%;人工老化導致D2和D3生活力水平的黃芩種子丙二醛含量急劇升高,A1B2C2D2和A1B2C2D3引發處理后,丙二醛含量分別降低了54.43%和41.82%(圖1B)?？偪寡趸芰υ诓煌盍λ介g的PEG引發結果變化不一致,當種子生活力水平為D1時,總抗氧化能力呈增加和不變的趨勢,A1B1C1D1、A1B2C2D1、A1B1C2D1和A1B2C2D1分別較對照增加了6.77%,26.56%,11.45%和0.80%;當種子生活力下降至D2和D3時,總抗氧化能力被提高,但A1B2C2D2和A1B2C2D3引發處理后,相對于未引發處理,其值出現輕微下降(圖1C)。

注:1～6分別表示黃芩種子引發處理為A1B1C1D1、A1B2C1D1、A1B1C2D1、A1B2C2D1、A1B2C2D2和A1B2C2D3,7～9分別表示未引發生活力水平為D1、D2和D3的對照種子。圖1 PEG引發適宜處理對黃芩種子活性氧、丙二醛、總抗氧化能力、可溶性糖和總淀粉酶的影響

2.6 PEG引發對黃芩種子可溶性糖和淀粉酶活力的影響

相對于未引發處理,PEG引發處理顯著地降低了可溶性糖含量,在種子生活力水平為D1時,A1B1C1D1、A1B2C2D1、A1B1C2D1和A1B2C2D1分別較對照降低了42.19%,40.17%,56.89%和54.80%;在黃芩種子生活力下降至D2和D3水平時,可溶性糖含量出現輕微下降,A1B2C2D2和A1B2C2D3引發后,可溶性糖含量進一步下降,下降幅度分別達53.78%和56.49%(圖1D)?？扇苄蕴呛康南陆?可能是因為PEG引發處理促進了糖代謝。在生活力水平為D1時,相對于未引發處理,PEG引發處理導致總淀粉酶活力顯著增加,A1B1C1D1、A1B2C2D1、A1B1C2D1和A1B2C2D1分別較對照增加了14.39%,13.85%,13.59%和14.55%;人工老化使D2和D3水平種子的總淀粉酶活力增加,但A1B2C2D2和A1B2C2D3引發后造成了總淀粉酶活力不同程度的下降,下降幅度分別為3.97%和11.26%(圖1E)。

3 討論與結論

種子萌發期屬于植物生長史的關鍵階段,極易受外界環境條件影響,屬于比較敏感的時期,決定了田間出苗率高低與整齊度[21]。種子類型、貯藏條件等因素影響了種子老化速率,導致種子活力水平出現了不同程度的下降,誘發DNA損傷、氧化脅迫及活性氧積累等一系列生理變化,直接影響了種子萌發狀況[22]。適宜的引發劑能夠改善種子活力,促進種子萌發[23]。種子的發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數是衡量種子質量的重要指標,能夠有效地反映種子的萌發能力。

PEG引發通過調節溶液水勢,影響種子的吸水速率,使種子萌發所需物質和能量提前啟動,降低了吸脹傷害事件的發生,促進種子萌發[23-25]。PEG處理對種子萌發的影響與種子類型、種子活力、PEG分子量、浸種濃度、浸種時間等多種因素有關[13,16,18,26]。種子引發的PEG分子量主要為6000和8000,如李衛芬等[12]利用PEG-6000引發陳年野菜種子,表明濃度為15%～30%的PEG處理能顯著提高藿香、羅勒、板藍根等的發芽率、發芽勢、發芽指數等;辛秋宇等[27]研究發現,濃度為15%的PEG-8000浸種顯著提高了谷子種子的活力水平。適宜的PEG濃度因種子老化程度存在差異,安衍茹等[16]研究表明,20%的PEG-6000溶液引發能促進人工加速老化36 h(種子活力:24.44%)遠志幼苗株高、根長、地上部分生物量和地下部分生物量的增加,而人工老化48 h的種子引發效果減弱;類似的研究結果也在甜菜中被報道[28]。在本研究中,相對于未經人工老化的黃芩種子,老化24 h和48 h黃芩種子的引發效果明顯減弱。適宜的引發時間因PEG濃度高低也存在差異,如在甜菜的研究中,60%的PEG-6000浸種24 h、40%PEG-6000浸種72 h對種子萌發的促進作用最大[17];在紫花苜蓿中,10%的PEG-6000溶液引發24 h能夠顯著提高種子發芽速度[18];PEG濃度為13.33%,引發時間為24.57 h時,玉米種子的萌發效果最好[29]。

為了全面評價PEG引發對黃芩種子萌發的影響,本試驗研究了不同PEG分子量、浸種濃度、浸種時間以及種子生活力對黃芩種子引發的影響。結果表明,PEG浸種時間對種子萌發影響更大,其次為種子生活力和浸種濃度,PEG分子量影響程度最小。PEG浸種時間為8 h的發芽率、發芽勢、發芽指數獲得了最大程度的提高,但活力指數卻在浸種24 h獲得了最大值,推測適宜的浸種時間可能在8～24 h之間;浸種濃度和種子生活力均對引發處理發芽率、發芽勢和發芽指數的影響差異達到顯著水平,且分別在浸種濃度為10%和種子生活力為60.48%時獲得最強的引發促進作用;PEG分子量僅對發芽率的影響差異達到顯著水平,且低分子量(600)和中分子量(2000)PEG對發芽率的促進作用最大。這與李小玲等[10]、華智銳和李小玲[11]得出PEG抑制黃芩種子萌發的結果相反,這可能是因為黃芩種質不同所致。PEG引發處理后,對膜系統損傷具有一定的修復作用,可以改善種子生活力,但隨著種子老化程度的加深,生物體的修復作用被削弱。從四種發芽指標促進程度來看,D1(60.48%)生活力水平下的黃芩種子,組合A1B1C1的引發效果相對更好。根據活性氧積累、丙二醛含量、總抗氧化能力、可溶性糖含量以及總淀粉酶活力等生理指標的變化,組合A1B1C1D1相對更能有效地避免ROS過量積累,防止細胞膜發生脂質過氧化,抑制MDA的產生,維持相對較高的總抗氧化能力水平,促進糖代謝和淀粉水解,從而為種子萌發提供能量[30-31]。

綜合上述結果,可將PEG引發處理技術應用于黃芩種子,對提高種子萌發能力、增強抗逆性能等方面具有重要的應用價值。